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Agilent1100 guide.docx

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Agilent1100guide

Agilent1100高压液相色谱仪基本操作步骤Agilent1100液相基本操作步骤_S0i_S_/}k

Agilent1100高压液相色谱仪维护保养知识保养事项：

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高压液相色谱HPLC常见故障及排除方法}_l）!

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液相色谱柱使用及保养m2�_xx_<

高压液相色谱HPLC培训教程

（一）ei_GZg1_,D

高压液相色谱HPLC培训教程（七）Ra>$$I_DWM

高效液相色谱仪中反相HPLC柱子的清洁和再生&1yy[9[[Tb

HPLC对流动相的基本要求WQ'h_kz�_D

高效液相色谱~_ed-ryQ!

Waters600E-2487HPLC系统SOPWaters高效液相色谱系统操作规程Nm_）pzbp1

高效液相色谱仪（Agilent1100）操作注意事项%P]7='u3p

色谱扫盲班r

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Agilent1100高压液相色谱仪基本操作步骤Agilent1100液相基本操作步骤1AtnD|__h

（一）、开机：

5xL/*RYE_K

1、打开计算机,进入WindowsNT（或Windows2000）画面,并运行BootpServer程序。

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2、打开1100LC各模块电源。

U;%Al{_%

3、待各模块自检完成后，双击Instrument1Online图标，化学工作站自动与1100LC通讯，进入的工作站画面。

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4、从“View”菜单中选择“MethodandRuncontrol”画面,单击”View”菜单中的“ShowTopToolbar”，“Showstatustoolbar”，“Systemdiagram”,”Samplingdiagram”，使其命令前有“√”标志，来调用所需的界面。

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5、把流动相放入溶剂瓶中。

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6、打开Purge阀。

X_r2_;w_q

7、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Setuppump选项，进入泵编辑画面。

_|_sY[kVha

8、设Flow：

5ml/min，单击OK。

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9、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Pumpcontrol选项，选中On，单击OK，则系统开始Purge，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止,切换通道继续Purge，直到所有要用通道无气泡为止。

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/H1

10、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击PumpControl选项，选中Off，单击Ok关泵，关闭Purgevalve。

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11、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Setuppump选项，进入Pump编辑画面，设Flow：

1.0ml/min。

yj_Z_f}t

12、单击泵下面的瓶图标，输入溶剂的实际体积和瓶体积。

也可输入停泵的体积。

单击Ok。

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U"&u____y_

（二）数据采集方法编辑：

Rn0___K5C

1、开始编辑完整方法：

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●从“Method”菜单中选择“Editentiremethod”项，如上图所示选中除“Dataanalysis”外的三项，单击Ok，进入下一画面。

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_*_$Nk

2、方法信息：

uxt�5__x`

●在“MethodComments”中加入方法的信息（如：

方法的用途等）。

_Yw,om41

●单击Ok进入下一画面。

_,vf:

BvI;M

3、泵参数设定：

（以二元泵为例）"1_a_1_|_P

●在“Flow”处输入流量,如1ml/min，在“SolventB”处输入70.0,（A=100-B）,也可Insert一行”Timetable”,编辑梯度。

在“PressureLimitsMax”处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。

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●单击Ok进入下一画面。

N_>[_BO\z&

4、自动进样器参数设定:

h_t_i8z"

●选择合适的进样方式,进样体积1.0ul,洗瓶位置为6号。

“StandardInjection”----只能输入进样体积，此方式无洗针功能。

“InjectionwithNeedleWash”----可以输入进样体积和洗瓶位置，此方式针从样品瓶抽完样品后，会在洗瓶中洗针。

“Useinjectorprogram”---可以点击Edit键进行进样程序编辑。

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●点击Ok进入下一画面。

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~I_r+UY

5、柱温箱参数设定:

i=7_eaSi_K

●在”Temperature”下面的方框内输入所需温度,并选中它,点击”more>>”键,如图所示,选中”Sameasleft”---使柱温箱的温度左右一致。

pHHmh%;7]"

●点击ok进入下一画面。

_zcC__H`+Z

6、VWD检测器参数设定:

<_l_|R*_HN

●在”Wavelength”下方的空白处输入所需的检测波长,如254nm,在”Peakwidth（Responsetime）”下方点击下拉式三角框,选择合适的响应时间,如>0.1min（2s）。

6R^mm_U__E

_xvu___）g

●在Timetable中可以“Insert”一行，输入随时间切换的波长，如1min，波长=300nm。

点击ok进入下一画面。

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7、DAD检测器参数设定:

X;`^_d_>Z_

●检测波长:

254nm,BW=30nm, 参比波长=350nm,BW=100nm;5=|`aj

o;L

●检测波长：

一般选择最大吸收处的波长。

样品带宽BW：

一般选择最大吸收值一半处的整个宽度。

参比波长：

一般选择在靠近样品信号的无吸收或低吸收区域。

参比带宽BW：

至少要与样品信号的带宽相等，许多情况下用100nm作为缺省值。

Peakwidth（Responsetime）：

其值尽可能接近要测的窄峰峰宽。

Slit—狭缝窄，光谱分辨率高；宽时，噪音低。

同时可以输入采集光谱方式，步长，范围，阈值。

选中所用的灯。

=_[Sxy!

●点击Ok进入下一画面。

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__wvAu

8、RID检测器参数设定:

n3_

mS#P5

●色谱条件:

9_xjP6

进样体积:

20ul。

光学单元温度:

Off。

*6@d�Yob{

极性:

正。

峰宽（响应时间）:

4s。

__H?

\__1:

●“OpticalUnitTemperature”---若环境温度控制在±2℃,设定为Off,若环境温度不稳定,则设定光学单元温度为高于环境温度5度,以防样品在池中沉淀。

“Peakwidth”---大多数分析设为4S，只有在高速分析下设为更短。

“Automaticrecyclingafteranalysis”---在不进行分析时可以让流动相循环，节省流动相，检测器连续运行，可随时投入使用。

_V_,0L3_W

●点击RID图标，选择RIDControl：

Heater设为On，若要循环流动相，必须将“RecyclingValve”设为ON。

手动purge参比池，将其设为On，并输入Purge时间。

D2pTk1

9、FLD检测器参数设定:

6X|<

色谱条件：

DzY

_RIq_

● 样品：

P/N01018-68704用甲醇稀释为1:

10。

C_@t$Ivje!

● 进样体积：

5ul。

Cbr7s（.t9

● 柱温箱:

30℃。

EX=246nm,EM=317nm,PMT=10。

B$2_j/CV_v

● 响应时间=4s. 停止时间：

出峰完毕。

ZL_Jj7_pv

● ExcitationA:

激发波长:

200-700nm,步长为1nm,或ZeroOrder。

__NeJrl

● Emission:

发射波长:

280-900nm,步长为1nm,或ZeroOrder。

U]$aG_oJ7

● PMT:

大多数应用适当的设定值为10,若高浓度样品峰被切平头,则减少PMT值。

*20'_6_6

●“Peakwidth”：

大多数应用设为4s，只有快速分析采用小的设定值。

_]_zSq

● MultiEx：

多波长及光谱（激发）。

__g|O[_Jt"

● MultiEm：

多波长及光谱（发射）。

eb[f`{+1

● 同时可以输入范围Range、步长step、采集光谱。

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_w,

10、在“Runtimechecklist”中选中“Dataacquisition”，单击Ok。

|U_n__,O_

11、单击“Method”菜单，选中“Savemethodas”，输入一方法名，如“test”，单击Ok。

_OC___W

12、从菜单“View”中选中”Onlinesignal”,选中Windows1,然后单击Change钮,将所要绘图的信号移到右边的框中,点击Ok.（如同时检测二个信号,则重复12,选中Windows2）。

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13、从“Runcontrol”菜单中选择“Sampleinfo”选项，如上图所示，输入操作者名称，在“Datafile”中选择“Manual”或“Prefix”。

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$._tI~_^Hp

区别:

Manual--每次做样之前必须给出新名字,否则仪器会将上次的数据覆盖。

Prefix—在Prefix框中输入前缀，在Counter框中输入计数器的起始位，仪器会自动命名，如vwd0001，vwd0002……。

M~Y）fH）@_g

14、从Instrument菜单选择Systemon。

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15、等仪器Ready，基线平稳，从Method菜单中选择“Runmethod”，进样。

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（三）、数据分析方法编辑:

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1、从“View”菜单中，单击“Dataanalysis”进入数据分析画面。

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2、从“File”菜单选择“Loadsignal”，选中您的数据文件名，如下图所示。

单击Ok。

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3、做谱图优化,从“Graphics”菜单中选择“Signaloptions”选项，。

从Ranges中选择Autoscale及合适的显示时间，单击ok,或选择”UseRanges”调整。

反复进行，直到图的比例合适为止。

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4、积分:

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（1）、从“Integration”中选择“Autointegrate”,如积分结果不理想,再从菜单中选择“IntegrationEvents”选项，选择合适的Slopesensitivity，Peakwidth，Areareject，Heightreject。

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（2）、从“Integration”菜单中选择“Integrate”选项，则数据被积分。

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WU.

（3）、如积分结果不理想，则修改相应的积分参数，直到满意为止。

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cf!

f.0P'<_

（4）、单击左边“√”图标，将积分参数存入方法。

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5、打印报告:

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（1）、从“Report”菜单中选择“Specifyreport”选项，进入如上画面。

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（2）、单击“QuantitativeResults”框中Calculate右侧的黑三角，选中Percent（面积百分比），其它选项不变。

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（3）、单击Ok.g"*__n%

（4）、从“Report”菜单中选择“Printreport”，则报告结果将打印到屏幕上，如想输出到打印机上，则单击Report底部的“Print”钮。

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（四）、关机:

X|'gG_h#

●关机前，用100%的水冲洗系统20分钟，然后用有机溶剂冲洗系统10分钟（如ACN），然后关泵，（适于反相色谱柱）。

[正相色谱柱用适当的溶剂冲洗]mW=_z__P_a

●退出化学工作站，及其它窗口，关闭计算机（用shutdown关）。

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关掉Agilent1100电源开关。

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Agilent1100高压液相色谱仪维护保养知识保养事项：

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1、色谱柱长时间不用，存放时，柱内应充满溶剂，两端封死（如ACN适于反相色谱柱，正相色谱柱用相应的有机相）=zIYsG_'

2、对于手动进样器，当使用缓冲溶液时，要用水冲洗进样口，同时搬动进样阀数次，每次数毫升。

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3、流动相使用前必须过滤，不要使用多日存放的蒸馏水（易长菌）。

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4、带seal-wash的1100，要配制90%水+10%异丙醇，以每分2—3滴的速度虹吸排出，溶剂不能干涸。

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5、其它主意事项见说明书，或由现场工程师介绍。

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维护知识问答

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1、为什么溶剂和样品要过滤?

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溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。

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色谱柱：

由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。

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仪器：

溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。

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样品过滤头的类型：

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30mm内径：

适用于大进样量的过滤，由0.2μm和0.45μm两种规格,材料有纤维素,醋酸纤维,聚四氟乙烯。

处理样品体积少于50μl。

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13mm内径：

适用于范围广的过滤，由0.2μm和0.45μm两种规格,材料为纤维素。

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3mm内径：

适用于小进样量的过滤，由0.2μm和0.45μm两种规格。

处理样品体积为7μl。

滤膜类型：

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聚四氟乙烯滤膜：

适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。

醋酸纤维滤膜：

不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶液，推荐用于蛋白质和其相关样品。

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尼龙66滤膜：

适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸，70%乙醇、二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。

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再生纤维素滤膜：

具有蛋白吸收低，同样适用水溶性样品和有机溶剂。

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2、为什么HPLC用缓冲盐时要加在线Seal-wash选项？

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HPLC用缓冲盐时,由于泵头内的缓冲盐溶液存在高压析盐现象,析出的细小盐粒非常坚硬,它附着在蓝宝石活塞杆上,随着蓝宝石活塞杆的往复运动,容易产生划痕,并磨损密封垫,造成漏液等故障现象。

在线Seal-wash选项能有效的带走可能存在的缓冲盐结晶。

缓冲盐的浓度在0.1mol或大于0.1mol时,必须使用该在线冲洗选项.（]（/{~/P{

清洗液配制:

90%水+10%异丙醇.该混合液可抑制菌类生长和减小水的表面张力。

以2-3滴/min的速度虹吸流下，不能干涸。

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3、为什么Agilent1100LC的流动相管路非常细?

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在使用HPLC时,应特别注意”柱外效应”对分析结果的影响，由于样品分子在液体流动相中的扩散系数比在气体中小4~5个数量级，液体流动相的流速也比气相慢1-2个数量级。

因此，样品进入色谱柱后，在柱子以外的任何死体积（进样器、柱接头、连接管、检测器）中，样品分子的扩散和滞留，都会引起色谱峰的展宽，而使柱效降低。

为使柱外效应减之最小，获得理想的分析结果，Agilent1100LC使用加工工艺难度高的毛细管线作为流动相管路。

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毛细管线分类：

0.17mm内径------绿色;0.12mm内径-------红色。

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PEEK管线：

内径-----0.13mm;0.18mm;0.25mm;0.5mm。

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毛细管线优点:

柔韧性好.F_（9>Qv6"

***Agilent公司同时备有1/16in的粗外径毛细管线,适用于不同习惯的用户,优点是刚性好,但柔韧性差一些。

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4、流动相使用前为什么要脱气？

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8|f

流动相使用前必须进行脱气处理，以除去其中溶解的气体（如O2），以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。

气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。

溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。

若用FLD，可能会造成荧光猝灭。

p|eVM1=Fx'

常用的脱气方法比较：

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氦气脱气法：

利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。

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加热回流法：

效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。

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抽真空脱气法：

易抽走有机相。

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超声脱气法：

流动相放在超声波容器中，用超声波振荡10-15min，此法效果最差。

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在线真空脱气法：

Agilent1100LC真空脱机利用膜渗透技术，在线脱气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。

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5、如何防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞，以及堵塞后的处理？

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溶剂的质量或污染以及藻类的生长会堵塞溶剂过滤器，从而影响泵的运行，尤其水溶液或磷酸盐缓冲液（PH=4—7）。

以下几种方法可以有效防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞。

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A：

请严格执行溶剂过滤。

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S_.

B：

请勿使用多日存放的蒸馏水及磷酸盐缓冲液I,

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C：

如果应用许可，可在溶剂中加入0.0001---0.001M的叠氮化钠.^jvA3___F

在溶剂瓶内溶剂的上方小流量连续吹氩气,以隔绝空气。

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E：

避免使溶剂瓶暴露在直射阳光下，尽量使用琥珀色的溶剂瓶盛放水溶液或磷酸盐缓冲液。

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堵塞后的处理法方法：

将过滤头从组件中取下，在浓硝酸（35%）中浸泡1h，然后用二次蒸馏水冲洗干净并超声处理。

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6、Agilent1100LC泵如何维护？

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Agilent1100LC泵给色谱柱提供稳定、无脉动、流量准确的流动相，及时合理的维护非常重要。

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A：

流动相使用前请必须脱气、过滤。

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B：

使用缓冲盐时，要加在线Seal-wash选项。

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C：

关机前，用100%的水冲洗系统20分钟，然后用有机溶剂冲洗系统10分钟（如甲醇），然后关泵，（适于反相色谱柱）。

[正相色谱柱用适当的溶剂冲洗]_/u_B{{xa~

D：

及时更换PurgeValve内的过滤芯。

（当打开PurgeValve时，压力高于10bar，表明过滤芯已堵）。

E：

使用合适的密封圈。

Z�1p|`*[_

7、如何选择合适的泵头活塞密封圈？

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泵头活塞的标准密封圈能适合于大多数应用，但使用正相溶剂（如正己烷），不适合使用标准活塞密封圈，特别是长时间使用时，需更换另一种不同的密封圈，我们建议使用聚四氟乙烯密封圈。

（p/n0905-14202/pk）;qF_>`_=[

***注意：

聚四氟乙烯密封圈的压力范围为：

0—200bar；建议在泵的压力限制中，将最大压力设为200bar。

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8、使用梯度比例发时要注意那些事项？

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当盐溶液与有机溶剂溶液混合时，盐溶液能与有机溶剂溶液完全混溶，而不会出现沉淀。

但是在比例阀的混合点，重力作用使盐颗粒沉淀下来，通常，阀A接水相/盐溶液，D接有机溶剂，此法连接可有效使盐回落到盐溶液中，并被溶解。

若颠倒过来，盐可能落在有机溶剂中，出现问题。

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_X;_[O6

强烈建议：

当使用缓冲盐溶液和有机溶剂时，推荐将缓冲盐通道接在A通道上，有机溶剂通道直接接在A通道的上方D通道上；定期用水冲洗所有的通道，以除去阀口上可能出现的盐沉淀。

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9、在线真空脱气机使用要注意那些事项？

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一般来说，Agilent1100LC的真空脱气机无需过多维护，只需注意几个注意事项就可以了。

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A：

第一次使用，要用随仪器附带的注射器抽满脱气机腔体；更换不同类型的溶剂时，要先抽空，再抽满。

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B：

不用的通道要充满溶剂或密闭起来。

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10、更换色谱柱时要注意什么事项?

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为使柱外效应减之最小，获得理想的分析结果，仪器的流动相管路连接非常重要,一般Agilent1100LC在第一次安装时,均有受过专业培训的安装工程师负责安装,各种接头会处理的非常完美。

客户只需在更换色谱柱时注意接头处理就可以了，一般柱子入口接头为不锈钢卡套接头，柱子出口为不锈钢卡套接头或PEEK管线手拧街头，当完成第一次安张后，不锈钢卡套已固定

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