WB实验基本步骤.docx
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WB实验基本步骤
实验基本步骤
提取细胞蛋白
↓
BCA定量
↓
制备蛋白胶(SDS-PAGE胶)
↓
蛋白样品变性
↓
电泳
↓
转膜
↓
封闭
↓
一抗
↓
TBST洗涤
↓
二抗
↓
TBST洗涤
↓
显影
↓
结果分析
试剂配制
1.PBS磷酸盐缓冲溶液1L
磷酸二氢钾0.24g
磷酸氢二钠1.44g
氯化钠8g
氯化钾0.2g
加入500ml纯水,调PH=7.2
定容至1L,高压蒸汽灭菌
2.PBST(PBS+0.05%吐温-20)
500mlPBS+0.25ml吐温-20
3.电转液500ml
Tris1.5g
甘氨酸7.2g
400ml水溶解
加入100ml甲醇,置于4℃冰箱预冷
4.电泳液(1X)
10x稀释,50ml10x电泳液+450ml纯水
5.TBS
6.TBST(TBS+0.05%吐温-20)
50mlTBS+450ml纯水+0.25ml吐温-20
7.封闭液
TBST1X+5%奶粉
40ml封闭液=40mlTBST+2g奶粉,40℃预热
WB实验
一、蛋白样品制备
准备:
一管细胞,PBS(4℃预冷),PMSF(100mM),移液枪(1000ul,10ul),1.5mlEP管2个,高速冷冻离心机4℃预冷
1.于-20℃冰箱中取出一管细胞样品,吸去培养液
2.加入1ml4℃预冷的PBS(0.01MpH7.2~7.3)。
用移液枪轻轻吹成悬浮液后4℃,8000r离心5min,然后弃去上清。
重复以上操作一次,共洗细胞两次以洗去培养液。
3.按1ml裂解液加10μlPMSF(100mM),摇匀置于冰上。
(PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。
)
4.在样品中加入300ul含PMSF的裂解液,吹匀,于冰上裂解30min,为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
5.裂解完后,于4℃下12000rpm离心5min。
7.将离心后的上清分装转移倒0.5ml的离心管中放于-20℃保存。
二、蛋白含量的测定(BCA定量)
准备:
96孔板,移液枪(1000ul,10ul,200ul),BCA工作液(A+B),50mlEP管,1xPBS,BSA标准液
1.将96孔板分好区域,若不够分则只做两个重复,(外围一圈的孔最好不用)
2.算好孔数(总的)每孔加200ulBCA工作液(A+B),(A液:
B液=50:
1,一般配多些,如60孔,A液12000ul,B液240ul)
3.将样品稀释到一定倍数才能定量,(10倍,20倍,30倍),每孔需要20ul样品(2ul样品+18ulPBS,即稀释10倍),做三个重复则需要60ul,一般配80ul
4.配蛋白标准样品,将2mg/ml的蛋白标准溶液稀释至0.5mg/ml,若配200ul的0.5mg/ml蛋白标准溶液则需要50ul的2mg/ml的蛋白标准溶液和150ulPBS溶液
5.将稀释好的样品加入孔板中(标记的区域),接着标准品按0,1,2,4,8,12,16,20ul加到标号的区域,之后在加标准样品的孔内,将孔内溶液用PBS补足到20ul
6.每孔加200ul配好的工作液,平行加,不能上下加,以减少误差
7.将加好的96孔板放在37℃下孵育30分钟
8.孵育完后,放在酶标仪轻微震荡3-10s,中速,吸光值595nm,进行比色测定,记录标准曲线及样品吸光值数据后,以蛋白含量(ml)为横坐标,吸光值为纵坐标作标准曲线。
(R2>0.98才有用,酶标仪操作:
两个箭头图标,1是结果,2是保存)
9.计算蛋白含量(注意定量样品已经稀释了10倍)
蛋白质定量标准曲线加样量
序号
1
2
3
4
5
6
7
8
标准蛋白量/ul(0.5mg/ml)
0
1
2
4
8
12
16
20
背景液(PBS)/ul
20
19
18
16
12
8
4
0
标准液浓度mg/ml
0
0.025
0.05
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
三、SDS-PAGE电泳
1. 配胶(12%,可以提前配好)
准备:
玻璃板,梳子,AP(解冻,现拿现用),聚丙烯酰胺(4℃冰箱冷藏)
(1)玻璃板验漏5min
(2)按表配置分离胶
(3)灌胶,加酒精封压,凝30min(注意不要有气泡)
(4)按表配浓缩胶,倒掉酒精,用吸水纸吸去酒精,灌胶,插梳子(注意不要有气泡),凝30min
(5)取胶,用水冲洗一下浓缩胶,加少量水放入一次性手套中4℃冰箱保存备用
2.样品处理
准备:
PBS,移液枪,1.5mlEP管
(1)稀释样品:
一般每孔上样5ul,即1mg/ml浓度的样品,测完蛋白含量后,将样品用PBS稀释至1mg/ml(注意loadingbuffer的加入也得算入)
(2)取出上样样品15ul至1.5ml离心管中,加入6×SDS上样缓冲液3ul至终浓度为1×。
(上样总体积一般不超过15μl,加样孔的最大限度可加20μl样品。
)
(3)将样品在100℃煮5min震荡使蛋白完全变性(注意仪器操作)
3. 电泳
准备:
电泳液500ml(现配),蛋白胶,10ul移液枪(枪头),样品,Marker,冰盒,电泳装置
(1)将SDS-PAGE胶放入电泳槽中,加足够的电泳液。
(短玻璃板面向内,长玻璃板面向外。
若只跑一块胶,那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。
电泳液至少要漫过内测的短玻璃板。
注意先检漏。
)
(2) 上样。
用移液枪贴壁吸取样品,将样品吸出不要吸进气泡。
将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。
(加样太快可使样品冲出加样孔,若有气泡也可能使样品溢出。
加入下一个样品时,进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次,以免交叉污染。
)
(3)先设置80V,开始电泳,样品溴酚蓝跑至分离胶后增至120V电压,电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳,进行转膜。
(此时准备好电转液)
四、转膜
准备:
电转液(现配4℃冰箱冷藏),镊子,滤纸,PVDF膜(0.45um),电转装置,冰盒
注意:
拿滤纸和膜时一定要戴手套或用镊子,因为手上的蛋白会污染膜。
1. 在加有转移液的盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫
2.滤纸浸入电转液中,PVDF膜在甲醇中润湿成半透明,小心将膜放入4℃电转液中平衡至少5min。
3. 将夹子打开使黑的一面保持水平。
在上面垫一张海绵垫,用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。
(一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。
)在垫子上垫三层滤纸(可三张纸先叠在一起在垫于垫子上),一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
4.先将玻璃板撬掉才可剥胶,撬的时候动作要轻,要在两个边上轻轻的反复撬。
撬一会儿玻璃板便开始松动,直到撬去玻板。
(撬时一定要小心,玻板很易裂。
)除去小玻璃板后,将浓缩胶轻轻刮去(浓缩胶影响操作),要避免把分离胶刮破。
小心剥下分离胶盖于滤纸上(做好标记),用手调整使其与滤纸对齐,轻轻用玻棒擀去气泡。
将膜盖于胶上,要盖满整个胶(膜盖下后不可再移动)并除气泡。
在膜上盖3张滤纸并除去气泡。
最后盖上另一个海绵垫,擀几下就可合起夹子。
整个操作在转移液中进行,要不断的擀去气泡。
膜两边的滤纸不能相互接触,接触后会发生短路。
(转移液含甲醇,操作时要戴手套,实验室要开门以使空气流通。
)
5. 将夹子放入转移槽中(电转移时会产热,浆槽放入冰中),要使夹的黑面对槽的黑面,夹的白面对槽的红面。
一般用100mA转移90min。
6. 转完后将膜用1×丽春红染液染5min(于脱色摇床上摇)。
然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。
将膜晾干备用。
(准备封闭液)
六、免疫反应
准备:
封闭液,一抗,二抗,TBST
1. 将膜移至含有封闭液的平皿中,室温下脱色摇床上摇动封闭2h。
2. TBST洗4次。
每次5分钟。
3.将膜按照目的蛋白所处位置剪切并做好标记,加入相对应的一抗,室温孵育2h或者4℃过夜
4.室温下孵育1~2h后,用TBST在室温下脱色摇床上洗四次,每次5min
5. 同上方法准备二抗稀释液并与膜接触,室温下孵育1~2h后,用TBST在室温下脱色摇床上洗4次,每次5min
七、显影
准备:
样品胶片,移液枪(200ul),中枪头,吸水纸,显影液(A+B),薄镊子
一抗
二抗
目的蛋白78kd
Bip1:
1000
兔二抗
75kd
目的蛋白34kd
GAPDH内参1:
5000
鼠二抗
28kd
目的蛋白17kd
Sep151:
1000
兔二抗
1. 将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合;
2.1min后,取适量显影液于显影仪台面上,将膜用镊子夹起来正反面充分和显影液接触,注意切角在左上,即正面朝上。
应注意的是:
显影需移动胶片时,尽量拿胶片一角,手指甲不要划伤胶片,否则会对结果产生影响。
3.盖上盖子,将胶片进行扫描或拍照。