蛋白质分子处于兼性离子状态时的溶液pH值称为该蛋白质的等电点(pI)。
不同的蛋白质分子有不同的等电点。
在PI时,蛋白质分子所带正、负电荷相等,净电荷为零,其溶解度低,最易沉淀析出。
偏离其pI时,蛋白质分子带有同种电荷,互相排斥,不易发生沉淀。
在一定pH值范围内,偏离其pI越远,蛋白质分子带同种电荷数越多,越不易发生沉淀。
因此,可根据蛋白质分子在溶液中的沉淀析出情况,来测定蛋白质的等电点。
【器材】
试管、试管架、刻度吸管(0.5mL、lmL、5mL)、吸耳球、记号笔。
【试剂】
1.0.01mol/L乙酸
2.0.1mol/L乙酸
3.1.0mol/L乙酸
4.5g/L酪蛋白乙酸钠溶液称取纯酪蛋白0.25g,加入蒸馏水20ml及1.0mol/LNaOH5ml,混合,至酪蛋白完全溶解。
然后加入1.0mol/L乙酸5ml,移入50ml容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度。
【操作】
取干净试管5支,编号后,按下表操作。
试剂
1
2
3
4
5
蒸馏水(ml)
0.01mol/L乙酸(ml)
0.1mol/L乙酸(ml)
1.0mol/L乙酸(ml)
5g/L酪蛋白乙酸钠溶液(ml)
溶液PH值
沉淀结果
1.6
—
—
2.4
1.0
3.2
—
—
4.0
—
1.0
4.1
3.0
—
1.0
—
1.0
4.7
1.5
2.5
—
—
1.0
5.3
3.38
0.62
—
—
1.0
5.9
立即混匀各管,静置10分钟,观察各管沉淀情况,结果用“-,+,++,+++”表示,并记录于表中。
【思考题】
酪蛋白的等电点是多少?
实验二血清蛋白质的醋酸纤维素薄膜
电泳
【目的要求】
掌握区带电泳法的原理及应用。
【原理】
胶体颗粒在外加电场的作用下,朝着与其所荷电荷符号相反的电极移动,这种现象称为电泳。
血清中各种蛋白质各有其特定的等点电。
将这些蛋白质置于pH高于其等点电的溶液中,则它们将携带负电荷,在外加电场下,向正极移动。
由于血清中各种蛋白质的等电点不同,分子的大小不同,所以在同一电场中的泳动速度也不同。
蛋白质分子小、携带电荷多者移动速度快;分子大、携带电荷少者移动速度慢。
因此可以利用电泳方法将血清中的各种蛋白质分开。
醋酸纤维素薄膜作为支持介质,具有电渗小、分离速度快、区带清晰、操作简单等优点。
酸酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白分为:
清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白等5条区带。
固定染色之后,可看到清晰的色带,还可用光密度计扫描进行定量测定,计算出各种蛋白的构成百分比。
【操作】
1.准备与点样
(1)将缓冲液加入电泳槽的两槽内,并使两槽的液面等高。
(2)将薄膜切成2×8厘米的小条。
在薄膜无光泽面距一端1.5厘米处用铅笔划一横线,表示点样位置。
然后将薄膜在巴比妥缓冲液中浸泡。
(3)将充分浸透缓冲液的薄膜条取出,夹于洁净的滤纸中间吸去缓冲液,将薄膜条展平。
用盖玻片边缘蘸取少量血清样品,平直的印于点样线上,稍停3—5秒,使血清渗入薄膜,点样力求均匀,但不要靠近薄膜边缘。
2.电泳
将点样后的薄膜条置于电泳槽架上,放置时,无光泽面(即点样面)向下,点样端置于阴极。
薄膜在槽架上绷紧,用三四层滤纸压在膜条上,使之与缓冲液连通。
滤纸与薄膜应充分贴紧。
平衡5—10分钟后通电。
应用电压在90—150V之间,电势梯度约10V/cm;电流约0.1—0.5mA/cm(此点需灵活掌握)时间约需1小时左右。
3.染色
通电完毕后,用镊子将薄膜取出,直接浸于氨基黑10B染色液中,染5分钟取出,立即浸入盛有漂洗液的培养皿中,反复漂洗数次,直至背景漂净为止。
用滤纸吸干薄膜,此时可见五条色带。
4.定量
在用光密度计扫描前,必须先将醋酸纤维薄膜透明。
透明的方法很多,这里介绍一种最常用的方法。
电泳后,染色并漂洗干净之后。
待薄膜完全干燥,浸入透明液中约3—5分钟,取出,平贴于玻璃板上。
玻璃板必须干净,贴时应排出空气,待完全干燥后即可轻轻揭下。
还有一种透明方法;不必将薄膜浸入透明液,将薄膜展开于玻璃板上,用吸管吸取透明液,逐滴加于膜上,待完全加匀后,轻压薄膜排除空气,将玻板竖起放置,使多余的透明液流去,待干燥后轻轻揭下即可。
此膜可用于光密度计扫描,亦可永久保存,扫描仪多种多样,但原理基本相同。
可按各该仪器说明进行。
如作定量分析,则将薄膜水分吸干燥后,按次序剪下各条色带区及一空白带,分别浸入盛有0.4NNaOH的试管中(清蛋白管加4毫升,其余各管加2毫升)。
放入37℃水浴中15分钟,振摇数次,使色带全部洗脱下来,然后用580nm或绿色滤光板比色,读取吸光度A值。
根据测得读数,按下法计算:
各部分蛋白质的百分比(%)
α2、β、γ的计算依次类推:
T=清A×2+α1A+α2A+βA+γA
【临床意义】
正常值:
清蛋白57—72%,α1球蛋白2—5%,α2球蛋白4—9%,β球蛋白6.5—12%,γ—球蛋白12—20%。
1.肾病综合症、慢性肾小球肾炎时,清蛋白降低,α2球蛋白及β—球蛋白升高。
2.肝硬变时,清蛋白显著下降,γ—球蛋白升高。
3.胶原性疾病时,清蛋白降低,γ—球蛋白显著增高。
【注意事项】
1.电泳完毕后正负两极缓冲液的pH发生变化,再次电泳时,应改变电场方向,即将原正极改为负极;或将正负两极电极槽内的缓冲液混合之后,再分别倒入电泳槽中。
2.两侧电泳槽液面应保持在同一水平面。
否则,液体通过薄膜有虹吸现象,会影响蛋白质的泳动速度。
3.电泳失败的原因:
(1)电泳图谱不整齐,可能的原因有:
点样不均匀;薄膜未完全浸透;或温度过高使膜面局部干燥或水分蒸发;缓冲液变质;电泳时薄膜未放正,电流方向与膜方向不平行。
(2)各组分分离不佳,可能的原因是:
点样过多;电流过小;薄膜结构过分细密,透水性差,导电性差。
(3)染色后,清蛋白中部着色浅:
可能由于染色时间不足;染色液陈旧;或蛋白含量过高。
(4)透明膜上有气泡:
玻片上有油脂;贴膜时,有气泡。
【试剂】
1.巴比妥缓冲液(pH8.6,离子强度0.06):
称取巴比妥1.84克、巴比妥钠10.3克于500毫升蒸馏水中加热溶解,冷至室温后再用蒸馏水稀释至1000毫升。
2.氨基黑10B染色液:
称取氨基黑10B0.1克溶于无水乙醇20毫升中,加冰醋酸5毫升,甘油0.5毫升,使溶解,然后将磺基水杨酸2.5克溶于少量蒸馏水中,加到前液中,以蒸馏水补充至100毫升。
3.漂洗液:
甲醇45毫升、冰醋酸5毫升和蒸馏水50毫升混匀。
4.透明液:
冰醋酸25毫升,无水乙醇75毫升,混匀。
实验三血清淀粉酶活性测定—稀释法
【目的】
了解本实验的原理及方法,能正确地进行各项操作;了解血清淀粉酶活性测定的临床意义。
【原理】
淀粉在淀粉酶催化下,首先生成糊精,其最终产物是麦芽糖和葡萄糖。
向反应体系中加入碘液可检查淀粉的水解程度,淀粉与碘呈蓝色,麦芽糖遇碘不显色。
将标本(血清)做一系列的稀释,使之催化淀粉水解,加入碘液后,以不显蓝紫色之标本最高稀释倍数乘以2,作为血清淀粉酶活性单位。
【试剂】
1.1%NaCL
2.淀粉溶液(1mg/mL)
3.革兰氏碘液:
取碘化钾2g溶解于少量蒸馏水中,再加碘1g,溶解后以水稀释至300Ml,密闭保存。
【实验操作】
1.取10支试管,分别加入1%NaCl溶液1.0ml;
2.向第1支试管内加入血清1.0ml,混匀后吸取1.0ml加入第2支试管,混匀后吸取1.0ml加入第3支试管,再混匀后吸取1.0ml加入第4支试管,依此类推,直至第9支试管,混匀后吸取1.0ml弃去,第10支试管不加血清;
3.向每支试管各加2ml淀粉溶液,混匀后置于370C水裕箱中保温30分钟;
4.取出试管,向每支试管各加1滴碘液,摇匀,立即观察结果。
以不显蓝紫色之标本最高稀释倍数乘以2,作为血清淀粉酶活性单位。
【正常值】
本法以每毫升标本在37℃作用30分钟能水解1mg淀粉的酶活力作为1单位(温氏)。
血清(浆)正常参考值8-64单位(温氏)。
【临床意义】
淀粉酶主要由唾液腺和胰腺分泌,当唾液腺堵塞特别是急性胰腺炎是时,血和尿中的淀粉酶可显著增高,一般认为,在急性胰腺炎发病的8-12小时开始升高。
其它如胰腺癌、胰腺外伤、胆石症、胆囊炎,总胆管阻塞以及溃疡病穿孔等均可增高。
正常人血清淀粉酶主要由肝产生,故减低见于某些肝硬化,肝炎等肝病。
实验四酵母核酸的提取与鉴定
【目的要求】
了解核酸的提取方法及其理化性质。
【原理】
核酸可溶于碱性溶液,当碱被中和后,可加乙醇使其沉淀,由此即可得到核酸制品。
RNA与DNA均可被硫酸水解,产生磷酸、含氮碱(嘌岭和嘧啶)和戊糖(核糖和脱氧核糖)。
RNA中含核糖,DNA中含脱氧核糖。
以上三类物质可用下述方法进行鉴定:
(1)磷酸可与钼酸铵作用生成磷钼酸,后者在还原剂氨基萘酚磷酸(或维生素C)作用下生成钼兰(蓝色)。
(2)嘌呤碱可与硝酸银作用产生灰褐色絮状的嘌呤银化含物。
(3)核糖与浓盐酸或浓硫酸作用可生成糠醛。
后者能和3,5-二羟基甲苯缩合而显绿色。
脱氧核糖与浓酸反应生成ω—羟基Y-酮基戊醛,它和二苯胺作用生成蓝色化合物。
管号
水解液
5%硫酸
浓氨水
5%硝酸银
测定管
20滴
——
数滴使呈碱性
10滴
对照管
——
10滴
数滴使呈碱性
10滴
1.核酸的提取:
置1克干酵母于50毫升锥形瓶中,加2克/升NaOH溶液10毫升,沸水浴中加热30分钟,并经常搅拌。
待冷却后,加醋酸数滴,使提取液呈酸性(石蕊试纸),离心10-15分钟(4000rpm)。
将上清液倒入锥形瓶中,加95%乙醇5毫升,边加边搅。
加毕,静置。
待完全沉淀,离心10分钟,即可得到核酸钠的白色沉淀。
2.核酸的水解:
在含有核酸钠的离心管中加入5%H2SO44毫升,用玻棒搅匀,在沸水浴中加热15分钟即可。
3.取水解液进行RNA与DNA成分的鉴定。
嘌呤碱的鉴定:
取试管两支,分别标明测定管和对照管,依次加入下列各试剂;
加入硝酸银后,观察变化。
静置15分钟后,再比较两管中的沉淀。
磷酸的鉴定:
取试管两支,分别标明测定管和对照管,然后依次加入下列各试剂:
管号
水解液
5%硫酸
钼酸铵试剂
氨基萘酚磺酸
测定管
10滴
——
5滴
20滴
对照管
——
10滴
5滴
20滴
核糖的鉴定:
取试管两支分别标明测定管和对照管,然后依次加入下
列各试剂:
管号
水解液
5%硫酸
3,5-二羟基甲苯试剂
测定管
4滴
——
6滴
对照管
——
4滴
6滴
将两管放入沸水浴中,加热10分钟,比较两管之颜色。
脱氧核糖的鉴定:
取试管两支分别标明测定管和对照管,然后依次加入下列各试剂:
管号
水解液
5%硫酸
二苯胺试剂
测定管
20滴
——
30滴
对照管
——
20滴
30滴
【试剂】
1.钼酸铵试剂:
20毫升水中溶解2.5克钼酸铵,加5摩尔/升(10N)硫酸30毫升用水稀释至100毫升,此试剂在冷处可保存1个月不变。
2.氨基萘酚磺酸:
商品氨基萘酚磺酸(1,2,4-Aminonaphthol-sulfonicacid)为暗红色。
可纯化如下:
在100毫升热水(90℃)中溶解15克NaHSO3及1克Na2SO3,加1.5克商品氨基萘酚磺酸,搅匀,使大部分溶解,(仅少部分杂质不溶)乘热过滤,迅速使滤液冷却。
加1毫升浓盐酸(12N),则有白色氨基萘酚磺酸沉淀析出。
过滤,并用水洗涤沉淀数次。
再用乙醇洗涤至纯白色为止。
最后用乙醚洗涤,并将固体放置暗处,使乙醚挥发。
将此纯化的氨基萘酚磺酸保存于棕色瓶中。
取195毫升15%NaHSO3溶液(溶液必须透明),加入0.5克纯化的氨基萘酚磺酸及20%Na2SO3溶液5毫升。
并在热水手中搅拌使固体溶解(如不溶解,可再加20%Na2SO3溶液,每次加入量以1毫升为限,不溶可再加,不可过量。
),此为浓溶液,置冷处可保存2~3周。
如颜色变黄须重新配制。
临用时,将上述浓溶液以蒸馏水稀释10倍。
3.二苯胺试剂:
取1克纯二苯胺溶于100毫升重蒸的冰醋酸中;加入2.75毫升浓硫酸,放在棕色瓶中。
此试剂需临时配制。
4.3,5-二羟基甲苯试剂:
取比重1.19盐酸100毫升,加入FeCl3·6H2O100毫克及3,5-二羟基甲苯100毫克,混匀溶解后,置棕色瓶中,此试剂必须在临用前配制。
市售的二羟基甲苯不可直接用,必须用苯重结晶1~2次,并用活性炭脱色,方可使用。
5.5%硫酸。
6.浓氨水。
7.5%AgNO3:
取5gAgNO3加蒸馏水并稀释至100mL,于棕色瓶避光保存。
实验五影响酶活性的因素
【目的要求】
通过实验,了解温度、pH、激动剂和抑制剂等因素对酶活性的影响。
一、温度对酶活性的影响
【原理】
温度对酶的活性有显著影响。
温度降低,酶促反应速度减慢或停止。
温度升高,反应速度加快,当上升至某一温度时,酶促反应速度达最大值,此温度称为酶的最适温度。
温度继续升高,反应速度迅速下降。
人体内大多数酶的最适温度为37℃左右。
体外实验,酶的最适温度随反应时间而异,温度愈高,酶蛋白变性愈重,至80℃时,酶活性几乎完全丧失。
本实验以唾液淀粉酶为例。
唾液淀粉酶催化淀粉水解生成各种糊精和麦芽糖。
(C6H10O5)n→(C6H10O5)m→qC12H22O11(n>m)
淀粉糊精麦芽糖