食品安全检验综合实验指导书.docx
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食品安全检验综合实验指导书
年级：
系部及班级：
姓名及学号：
实验一食品安全国家标准
食品微生物学检验菌落总数测定
1范围
本标准规定了食品中菌落总数的测定方法。
适用于食品中菌落总数的测定。
2菌落总数
食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。
3设备和材料
3.1恒温培养箱：
36℃±1℃，30℃±1℃。
3.2冰箱：
2℃~5℃。
3.3恒温水浴箱：
46℃±1℃。
3.4天平：
感量为0.1g。
3.5均质器。
3.6振荡器。
3.7无菌吸管：
1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。
3.8无菌锥形瓶：
容量250mL、500mL。
3.9无菌培养皿：
直径90mm。
3.10pH计。
3.11放大镜或/和菌落计数器。
4培养基和试剂
4.1平板计数琼脂培养基：
见附录A中A.1。
4.2磷酸盐缓冲液：
见附录A中A.2。
4.3无菌生理盐水：
见附录A中A.3。
5操作步骤
5.1样品的稀释
5.1.1固体和半固体样品
称取25g样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min~10000r/min均质1min~2min，制成1:
10的样品匀液。
5.1.2液体样品
以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:
10的样品匀液。
5.1.3用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:
10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:
100的样品匀液。
5.1.4按6.1.3操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。
每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。
5.1.5根据对样品污染状况的估计，选择2~3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。
同时，分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。
5.1.6及时将15mL~20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。
5.2培养
待琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养48h±2h。
5.3菌落计数
可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。
菌落计数以菌落形成单位（colony-formingunits，CFU）表示。
5.3.1选取菌落数在30CFU~300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。
低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。
每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
5.3.2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。
5.3.3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。
6结果与报告
6.1菌落总数的计算方法
6.1.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。
6.1.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式计算：
N=∑C÷（n1+0.1n2）d
式中：
N——样品中菌落数；
∑C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；
n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；
n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；
d——稀释因子（第一稀释度）。
6.1.3若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
6.1.4若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
6.1.5若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。
6.1.6若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU~300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于300CFU时，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
6.2菌落总数的报告
6.2.1菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。
6.2.2菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。
6.2.3若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。
6.2.4若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。
6.2.5称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。
培养基和试剂
A.1平板计数琼脂（platecountagar，PCA）培养基
A.1.1成分
胰蛋白胨
5.0
g
酵母浸膏
2.5
g
葡萄糖
1.0
g
琼脂
15.0
g
蒸馏水1000mLpH7.0±0.2
A.1.2制法
将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。
分装试管或锥形瓶，121℃高压灭菌15min。
A.2磷酸盐缓冲液
A.2.1成分
磷酸二氢钾（KH2PO4）34.0g蒸馏水500mLpH7.2
A.2.2制法
贮存液：
称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH，用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。
稀释液：
取贮存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL，分装于适宜容器中，121℃高压灭菌15min。
A.3无菌生理盐水
A.3.1成分
氯化钠8.5g蒸馏水1000mL
A.3.2制法
称取8.5ｇ氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。
7.实验结果：
N=∑C÷（n1+0.1n2）d
=（132+35）/{1+（0.1*1}*10-3
=151818
经数据修约后得1.5*105
式中：
N——样品中菌落数；
∑C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；
n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；
n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；
d——稀释因子（第一稀释度）。
8.实验分析：
平板的平均菌落数处在30-300之间，说明操作比较规范
从样品中菌落总数可知，发酵茶中含有的微生物较多
年级：
系部及班级：
姓名及学号：
实验二食品安全国家标准
食品微生物学检验大肠菌群平板计数
1范围
本标准规定了食品中大肠菌群计数的方法。
本标准适用于食品中大肠菌群的计数。
2大肠菌群
在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
3设备和材料
3.1恒温培养箱：
36℃±1℃。
3.2冰箱：
2℃~5℃。
3.3恒温水浴箱：
46℃±1℃。
3.4天平：
感量0.1g。
3.5均质器。
3.6振荡器。
3.7无菌吸管：
1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。
3.8无菌锥形瓶：
容量500mL。
3.9无菌培养皿：
直径90mm。
3.10pH计。
3.11菌落计数器。
4培养基和试剂
4.1煌绿乳糖胆盐（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉汤：
见附录A中A.1。
4.2结晶紫中性红胆盐琼脂（VioletRedBileAgar，VRBA）：
见附录A中A.2。
4.3磷酸盐缓冲液：
见附录A中A.3。
4.4无菌生理盐水：
见附录A中A.4。
4.5无菌1mol/LNaOH：
见附录A中A.5。
4.6无菌1mol/LHCl：
见附录A中A.6。
5操作步骤
5.1样品的稀释
5.2平板计数
5.2.1选取2个~3个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1mL。
同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。
5.2.2及时将15mL~20mL冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。
小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3mL~4mLVRBA覆盖平板表层。
翻转平板，置于36℃±1℃培养18h~24h。
5.3平板菌落数的选择
选取菌落数在15CFU~150CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。
典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。
5.4证实试验
从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，36℃±1℃培养24h~48h，观察产气情况。
凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。
5.5大肠菌群平板计数的报告
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以5.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。
例：
10-4样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：
100×6/10×104/g（mL）=6.0×105CFU/g（mL）。
培养基和试剂
A.1煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤
A.1.1成分
蛋白胨10.0g
乳糖10.0g
牛胆粉（oxgall或oxbile）溶液200mL
0.1%煌绿水溶液13.3mL
蒸馏水800mLpH7.2±0.1
A.2.2制法
将蛋白胨、乳糖溶于约500mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200mL（将20.0g脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中，调节pH至7.0~7.5），用蒸馏水稀释到975mL，调节pH，再加入0.1%煌绿水溶液13.3mL，用蒸馏水补足到1000mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL。
121℃高压灭菌15min。
A.2结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）
A.2.1成分
蛋白胨7.0g
酵母膏3.0g
乳糖10.0g
氯化钠5.0g
胆盐或3号胆盐1.5g
中性红0.03g
结晶紫0.002g
琼脂15g～18g
蒸馏水1000mL
pH7.4±0.1
A.2.2制法
将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调节pH。
煮沸2min，将培养基冷却至45℃~50℃倾注平板。
使用前临时制备，不得超过3h。
A.3磷酸盐缓冲液
A.3.1成分
磷酸二氢钾（KH2PO4）34.0g
蒸馏水500mLpH7.2
A.3.2制法
贮存液：
称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH，用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。
稀释液：
取贮存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL，分装于适宜容器中，121℃高压灭菌15min。
A.4无菌生理盐水
A.4.1成分
氯化钠8.5g蒸馏水1000mL
A.4.2制法
称取8.5ｇ氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。
A.51mol/LNaOH
A.5.1成分
NaOH40.0g蒸馏水1000mL
A.5.2制法
称取40g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。
A.61mol/LHCl
A.6.1成分
HCl90mL蒸馏水1000mL
A.6.2制法
移取浓盐酸90mL，用蒸馏水稀释至1000mL，121℃高压灭菌15min。
6.实验结果：
实验三莫尔法测定酱油中NaCl的含量
一、实验目的
1、学会AgNO3标准溶液的配制和标定方法；
2、掌握莫尔法测定可溶性氯化物的原理及方法。
二、实验原理
某些可溶性氯化物中氯含量的测定常采用莫尔法。
在中性或弱碱性条件下，以K2CrO4为指示剂，用AgNO3标准溶液进行滴定，主要反应如下：
Ag++Cl-=AgCl↓（白色）
2Ag++CrO42-=Ag2CrO4↓（砖红色）
由于AgCl的溶解度小于Ag2CrO4，根据分步沉淀的原理，溶液中首先析出AgCl沉淀。
当AgCl定量沉淀后，稍微过量的Ag+即与CrO42-形成砖红色的Ag2CrO4沉淀，它与白色的AgCl沉淀一起，使溶液略带橙红色即为终点。
滴定必须在中性或弱碱性液中进行，最适宜pH范围为6.5~10.5。
如果有铵盐存在，溶液的pH需控制在6.5~7.2之间。
指示剂的用量对滴定准确度有影响，一般以5×10-3mol·L-1为宜。
凡是能与Ag+生成难溶性化合物或络合物的阴离子都干扰测定。
如：
PO43-、AsO43-、SO32-、CO32-、C2O42-、S2-等。
大量Cu2+、Ni2+、Co2+等有色离子将影响终点观察。
凡是能与CrO42-指示剂生成难溶化合物的阳离子也干扰测定。
如：
Ba2+、Pb2+能与CrO42-分别生成BaCrO4和PbCrO4沉淀。
Al3+、Fe3+、Bi3+、Sn4+等高价金属离子在中性或弱碱性液中易水解产生沉淀，会干扰测定。
AgNO3标准溶液既可以用直接法配制，也可以用间接法配制。
间接法配制的AgNO3标准溶液可用NaCl基准试剂标定。
三、仪器和试剂
1、仪器：
50ml酸式滴定管1支；25ml移液管1支；5ml吸量管1支；250ml容量瓶1个；100ml容量瓶1个；250ml锥形瓶3个；50～100mL烧杯1个；玻璃棒2根；洗耳球1个；小滴瓶1个；洗瓶1个。
2、试剂：
AgNO3标准溶液（待标定）；酱油试样；5%K2CrO4溶液；NaCl基准试剂。
四、实验步骤
1、0.05mol·L-1AgNO3标准溶液的配制（由实验员配制）称取1.3gAgNO3溶于150mL蒸馏水中，转入棕色试剂瓶中，臵于暗处保存，待标定。
（试剂量为一人所用）
2、0.05mol·L-1AgNO3标准溶液的标定准确称取0.60~0.70gNaCl基准试剂于小烧杯中，用蒸馏水溶解后，转入250mL容量瓶中，稀释至刻度摇匀。
用25mL移液管准确移取基准NaCl试液于250mL锥形瓶中，加入20mL蒸馏水，再加入1mL5%K2CrO4溶液，在不断摇动下，用AgNO3标准溶液滴定至砖红色即为终点。
3、酱油试样的稀释用5mL吸量管移取待测酱油试样5.00mL于100mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀。
4、酱油中NaCl含量的测定用5mL吸量管移取酱油稀释液5.00mL于250mL锥形瓶中，加水40mL，混匀。
加入1mL5%K2CrO4溶液，在不断摇动下，用AgNO3标准溶液滴定至砖红色即为终点，平行测定三份。
五、问题讨论
1、莫尔法测氯时，为什么溶液的pH必须控制在6.5～10.5？
2、以K2CrO4作指示剂时，指示剂浓度过大或过小对测定有何影响？
3、配制好的AgNO3标准溶液为什么要储于棕色瓶中，并臵于暗处？
4、能否用莫尔法以NaCl标准溶液直接滴定Ag+？
为什么？
5、当试样中含有铅、钡、铋元素时，能否用此法测定氯离子？
6、在滴定过程中，特别是化学计量点附近为什么要不断剧烈摇动？
六、实验数据记录与处理
1、AgNO3标准溶液的标定
1
2
3
倾出的质量m（g）
AgNO3溶液的终读数（mL）
AgNO3溶液的初读数（mL）
AgNO3溶液的用量V（mL）
AgNO3溶液的浓度（mol·L-1）
平均值（mol·L-1）
相对平均偏差（%）
2.酱油中NaCl含量的测定
1
2
3
移取酱油稀释液的体积（mL）
10.00
AgNO3溶液的终读数（mL）
AgNO3溶液的初读数（mL）
AgNO3溶液的用量V（mL）
NaCl的质量浓度（g·L-1）
平均值（g·L-1）
相对平均偏差（%）
实验四酱腌菜中亚硝酸盐含量的测定
由于肉制品生产企业在生产过程中乱加、误加亚硝酸盐而引起食物中毒,所以强制检验肉制品生产企业加入硝酸盐与亚硝酸盐的含量起到非常重要的作用。
肉类罐头与肉制品最大使用量不得超过0.05克/公斤。
除了肉类食品含有硝酸盐及亚硝酸盐,果蔬制品、酱腌菜中也含有亚硝酸盐。
1.分光光度法
在稀盐酸介质中，NO2-与碱性品红发生重氮反应，用8-羟基喹啉作偶联剂，在弱碱性条件下，生成茶红色偶氮染料来定量测定NO2-含量。
最常用的方法是盐酸萘乙二胺法，也就是用分光光度计测定样品吸光度，分光光度法以其设备简单、操作快捷、灵敏度高、结果直观的优点，深受欢迎。
本实验研究了以α-萘胺为显色剂，利用紫外可见分光光度计测定肉制品中的亚硝酸盐的含量的方法。
结果证明，此方法简单、快捷、准确，是一种食品检测的好方法。
【实验原理】
自样品中抽提分离出亚硝酸盐，亚硝酸盐在酸性条件下与对氨基苯磺酸发生重氮化反应生成重氮盐，此重氮盐再与α-萘胺试剂发生偶合反应，生成紫红色偶氮化合物。
其颜色的深度与样液中亚硝酸含量成正比，可比色测定。
反应式如下：
肉制品中亚硝酸盐含量=
（mg/kg）
式中：
X为由测得的吸光度在标准曲线上对应的亚硝酸钠质量浓度（μg/mL）；
m为样品质量（g）。
【实验部分】
一、主要试剂及仪器
（1）亚铁氰化钾溶液：
称取10.619克亚铁氰化钾[K4Fe（CN）6·3H2O]溶于水，并稀释至100mL。
（2）乙酸锌溶液：
称取22.0克乙酸锌[Zn（CH3COO）2·2H2O]，加3mL冰醋酸溶于水，并稀释至100mL。
（3）饱和硼砂溶液：
5.0克硼酸钠（Na2BO4·10H2O）溶于100mL热水中，冷却备用。
（4）对氨基苯磺酸溶液（0.4g/L）：
称取2.4g对氨基苯磺酸溶于50mL20%盐酸中，避光保存。
（5）0.2%α-萘胺溶液（2g/L）：
称取1.000g盐酸萘乙二胺，以水定容50mL，避光保存。
（6）亚硝酸钠标准溶液（200μg/mL）：
精确称取0.1003克于硅胶干燥器中干燥24h的亚硝酸钠（优级纯），加水定容到500mL。
（7）亚硝酸钠标溶液（5μg/mL）：
临用前，吸取此溶液2.5ml于100ml容量瓶中，用水定容到100ml
（8）仪器：
①研钵
②UV8500紫外-可见分光光度计
③分析天平
④1mL、2mL、5mL、20mL移液管各1支
⑤50mL烧杯1个，100ml烧杯1个
⑥10ml量筒1个，100ml量筒1个
⑦500mL烧杯1个，500ml容量瓶4个
⑧50mL容量瓶10个，100ml容量瓶4个
⑨滤纸、过滤装置一套
⑩比色皿2个。
二、实验操作
（1）样品处理
样品中硝酸盐及亚硝酸盐的提取：
称取经剁碎混合均匀的样品5克于100mL烧杯中，加入硼砂饱和溶液12.5mL，以玻璃棒搅拌，然后用70℃左右的水约300mL，将其稀释转移到500mL容量瓶，沸水浴中加热15分钟，取出，转动，加入5mL亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加5mL乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质。
冷却到室温，用水定容，摇匀。
放置片刻，去除上层脂肪，清液用滤纸过滤，前30ml滤液弃之不用。
（2）亚硝酸钠标准曲线的绘制
用移液管精确吸取亚硝酸钠标准液（5μg/mL）0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.5，2.0，2.5mL（各含0，1，2，3，4，5，7.5，10，12.5μg亚硝酸钠）于一组50mL容量瓶中，各加水至约25mL，分别加2mL0.4g/ml对氨基苯磺酸溶液，摇匀，静置3—5min后，各加入1mL0.2%α-萘胺溶液，并用水定容到50mL，摇匀。
（浓度分别为0.00,0.02,0.04,0.06,0.08,0.10,0.15,0.20,ug/ml）
静置15min后，用20mm比色皿，用分光光度计在最大波长550nm下测定吸光度，以蒸馏水为空白。
以测得的各比色液的吸光度对应的亚硝酸浓度作曲线。
。
（3）亚硝酸盐的测定
取40mL待测液于50mL容量瓶中，加1mL0.4%对氨基苯磺酸溶液，摇匀。
静置3～5分钟后，加入1mL02%α-萘胺溶液，定容，摇匀。
比色测定，记录吸光度。
根据标准曲线方程算得相应的亚硝酸钠浓度（μg/mL），计算试样中亚硝酸盐（以亚硝酸钠计）的含量。
实验五食品中沙门氏菌的荧光抗体检验
一、目的与要求
1．学习和掌握免疫荧光检测技术的原理。
2．初步掌握免疫荧光检测技术的操作方法和检测结果的判定。
二、实验原理
抗体与荧光素结合后，并不影响其和相应抗原发生特异性结合反应，事先将待测抗原固定于载玻片上，滴加荧光标记抗体，若荧光标记抗体与相应抗原发生特异性结合反应，不能被缓冲液冲掉，在荧光显微镜下可观察到荧光，否则，荧光抗体被缓冲液冲掉，在荧光显微镜下观察不到荧光。
三、仪器与试剂
1．载玻片76×26mm，厚0.8~1.0mm，事先刻好4×2个小方格，并编号。
先用洗涤剂彻底洗净油污，经滴检察证实无油污，再浸于95%酒精中备用。
2．盖玻片22×22mm，厚0.13~0.17mm，同上洗净，浸于95%酒精中备用。
3．荧光显微镜。
4．溶液与试剂
磷酸盐缓冲生理盐水：
0.01m（pH9.0）PBS-0.85%NaCl；
固定液：
按顺序将无水乙醇60ml、三氯甲烷30ml混匀，再加入36～38%甲醛10ml、混匀4℃贮存，重复使用次数以不超过三次为宜；
pH9.0碳酸盐缓冲甘油：
无水Na2CO3（分子量105.99）6g、无水Na2HCO3（84.01）37g溶于蒸馏水中，加至100ml，混匀，即成pH9.0碳酸盐缓冲液，以此一份加九份甘油混匀即成，4℃，不超过2周为宜；
沙门氏菌多价荧光抗体试剂：
选用经国家进出口商品检验局批准的以FITC标记的沙门氏菌A-67全价“OH”免疫球蛋白（或沙门氏菌
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