细菌内毒素检测方法验证-(1).doc
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细菌内毒素检测方法验证方案
目的---------------------------------------------------------------------------------------------------------
范围---------------------------------------------------------------------------------------------------------
责任人-----------------------------------------------------------------------------------------------------
内容--------------------------------------------------------------------------------------------------------
1.实验材料及用具-------------------------------------------------------------------------------------
2.具体验证步骤-----------------------------------------------------------------------------------------
2.1.鲎试剂灵敏度复核------------------------------------------------------------------------------
2.2..干扰实验---------------------------------------------------------------------------------------------
2.3.供试品细菌内毒素检查--------------------------------------------------------------------------
3.验证结论----------------------------------------------------------------------------------------------
附：
表1.鲎试剂灵敏度复核记录
表2.干扰试验预实验
表3.干扰试验记录
表4.细菌内毒素检查记录
细菌内毒素检测方法验证方案
目的：
为确保注射用重组抗Her2单克隆抗体细菌内毒素检测方法的专属性、灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求，特制定此方案。
范围：
注射用重组抗Her2单克隆抗体细菌内毒素检测方法
责任人：
细菌内毒素检验员、QC主管
内容：
1.实验用具及试剂
1.1实验用具
内毒素试管恒温仪、旋涡混合器、可调式移液枪、试管架、时钟、75%酒精棉。
1.2实验试剂
试剂名称
来源
产品批号
细菌内毒素工作标准品80EU/支
中国食品药品检定研究院
150601-201886
细菌内毒素检查用水（5mL）
湛江安度斯生物有限公司
1811090
无热源空安瓿（2mL）
湛江安度斯生物有限公司
1809040
鲎试剂（0.125EU/mL）
湛江安度斯生物有限公司
1807272
2.具体验证步骤
2.1.鲎试剂灵敏度复核
2.1.1.实验操作
2.1.1.1.细菌内毒素标准溶液的制备加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，封口膜封严后置旋涡混合器混合15分钟。
检查用水稀释制备4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2λ、λ、0.5λ、0.25λ。
2.1.1.2.待复核鲎试剂的准备取λ=0.125EU/mL的鲎试剂18支后启备用。
每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。
2.1.1.3.加样待复核鲎试剂18支放在试管架上，排成5列，其中4列4支，1列2支。
4支4列每列每支分别加入0.1ml的2λ、λ、0.5λ、和0.25λ的内毒素标准溶液；另2支（管）加入0.1ml检查用水。
加样结束后，封口膜封口，振动混匀后放入37℃±1℃恒温仪中，保温60±2分钟。
2.1.1.4.观察并记录结果将试管架从水浴中轻轻取出，避免振动，将每管拿出缓缓倒转180°观察，管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（+）；未形成凝胶或凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（－）
2.1.2.实验结果计算
如最大浓度2.0λ4管均为阳性，最低浓度0.25λ4管均为阴性，阴性对照为阴性时实验为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果（λc）。
λc=lg-1（∑X/4）
式中x为反应终点浓度的对数值（lg）。
反应终点浓度是系列递减的内毒素标准溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。
2.1.3.结果判断
当λc在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）时判定该批鲎试剂灵敏度复核合格，可用于干扰实验和供试品细菌内毒素检查，并以λ（标示灵敏度）为该批鲎试剂的灵敏度。
2.2.干扰实验
2.2.1.操作方法
2.2.1.1.目的是检验在某一浓度下的供试品对于鲎试剂与内毒素的反应有无干扰作用。
使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过所使用的鲎试剂的最大有效稀释倍数的溶液。
2.2.1.2.制备内毒素标准对照溶液
取1支细菌内毒素标准品，用细菌内毒素检查用水稀释成4个浓度的标准溶液即2λ、λ、0.5λ、0.25λ。
2.2.2.3.制备含内毒素的供试品溶液
将供试品稀释至预实验中确定的不干扰稀释倍数，再用此稀释液将3.2.3.1.中的同支细菌内毒素标准品稀释成4个浓度即2λ、λ、0.5λ、0.25λ的含内毒素的供试品溶液。
2.2.2.4.鲎试剂的准备
取λ=0.125EU/mL的鲎试剂18支后启备用。
每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。
2.2.2.5.加样
将准备好的鲎试剂取其中18支（管）放在试管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。
其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液，另一列2支（管）加入0.1ml检查用水作为阴性对照。
将另外18支（管）鲎试剂放在试管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。
其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的含2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素的供试品溶液，另一列2支（管）加入0.1ml供试品溶液作为样品阴性对照。
加样结束后，用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37±1℃恒温仪中，保温60±2分钟后，观察并记录结果。
2.2.3.实验结果计算
如两组最大浓度2.0λ均为阳性，最低浓度0.25λ均为阴性，阴性对照,管均为阴性时，按下式计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（Es）和用供试品稀释液制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（Et）.
Es=lg-1（∑Xs/4）
Et=lg-1（∑Xt/4）
Xs、Xt分别为用检查用水和供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数值（lg）。
2.2.4.结果判断
2.2.4.1.判断标准
当Es在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）时，且Et在0.5Es～2.0Es（包括0.5Es和2.0Es）时，则认为供试品在该浓度下不干扰实验，可在该浓度下对此供试品进行细菌内毒素检查。
当Et不在0.5Es～2.0Es（包括0.5Es和2.0Es）时，则认为供试品在该浓度下干扰实验。
2.2.4.2.判断结果：
（记录附后）
2.3.供试品细菌内毒素检查
在细菌内毒素检查中，每批供试品必须做2支供试品管和2支供试品阳性对照，同时每次实验必须做2支阳性对照和2支阴性对照。
2.3.1.操作方法
2.3.1.1.供试品溶液的制备：
（稀释倍数不得超过MVD）
2.3.1.2.阳性对照溶液的制备
用检查用水将内毒素标准品稀释制成2λ浓度的内毒素标准溶液（方法同2.1.1.1.）。
2.3.1.3.供试品阳性对照溶液的制备
用待检测的供试品溶液或其稀释液将内毒素标准品制成2λ浓度的内毒素溶液。
（方法同2.2.1.3.2.供试品阳性对照溶液的制备）。
2.3.1.4.阴性对照液用细菌内毒素检查用水
2.3.1.5.加样
取规格为0.1ml/支的鲎试剂8支，每支用0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解。
其中2支加入0.1ml供试品溶液或其稀释液（其稀释倍数不得超过MVD）作为供试品管，2支加入0.1ml阳性对照溶液作为阳性对照管（PC），2支加入0.1ml检查用水作为阴性对照管，2支加入0.1ml供试品阳性对照溶液作为供试品阳性对照管。
将试管中溶液混匀、封口膜封闭，垂直放入37℃±1℃恒温仪中，保温60±2分钟。
2.3.2.结果判断
2.3.2.1.判断标准
当阳性对照都为阳性、供试品阳性对照都为阳性且阴性对照都为阴性时，实验有效。
若供试品2管均为阴性，认为该供试品符合规定；如供试品2管均为阳性，应认为不符合规定；如2管中1管为阳性，1管为阴性，按上述方法另取4支供试品管复试，4管中如有1管为阳性，即认为不符合规定。
若第一次实验时供试品的稀释倍数小于MVD而结果出现2管均为阳性或2管中1管为阳性时，按同样方法复试，复试时要求将其稀释至MVD。
2.3.2.2.判断结果：
（记录附后）
3.验证结论
附：
表1
鲎试剂灵敏度复核记录
检验目的
对细菌内毒素检查试剂所用的鲎试剂的灵敏度进行复核
检验日期
2020.02.27
检验依据
2015年版《中国药典》
ⅧE细菌内毒素检查法
室温
15.1℃
试剂名称
生产单位
批号
灵敏度/效价
规格
鲎试剂
湛江安度斯生物有限公司
1807272
EU/ml
0.125
细菌内毒素标准品
中国食品药品检定研究院
15061-201886
EU/支
80
细菌内毒素检查用水
湛江安度斯生物有限公司
1811090
ml/支
5
实验操作
标准品稀释：
取细菌内毒素标准品80EU/支+1ml检查用水80EU/ml
取0.2ml80EU/ml溶液+1.4ml检查用水10EU/ml
取0.2ml10EU/ml溶液+1.8ml检查用水1EU/ml
取1.0ml1EU/ml溶液+3.0ml检查用水0.25EU/ml
取1.0ml0.25EU/ml溶液+1.0ml检查用水0.125EU/ml
取1.0ml0.125EU/ml溶液+1.0ml检查用水0.0625EU/ml
取1.0ml0.0625EU/ml溶液+1.0ml检查用水0.03125EU/ml
即得到2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液。
反应结果
保温时间（10：
15～11：
15）
内毒素浓度
（EU/ml）
2.0λ
（0.25）
1.0λ
（0.125）
0.5λ
（0.0625）
0.25λ
（0.03125）
阴性对照
终点浓度
（EU/ml）
重复管数
1
+
+
-
-
-
0.125
2
+
+
+
-
-
0.0625
3
+
+
+
-
/
0.125
4
+
+
+
-
/
0.125
结果计算
λc=0.105EU/ml
（在0.5λ-2.0λ范围内）
结果判断
鲎试剂灵敏度复核
合格
检验人员
校对人员
表2：
干扰试验预实验
检品名称
IAH20170-20181207-DS
检验日期
2020.02.27
生产单位
盛禾（中国）生物制药有限公司
室温
15.1℃
供样单位
盛禾（中国）生物制药有限公司
规格
100mg/支
批号
IAH20170-20181207
包装
西林瓶
检验依据
2015年版《中国药典》
ⅧE细菌内毒素检查法
内毒素限度
0.1EU/mg
试剂名称
生产单位
批号
灵敏度/效价
规格
鲎试剂
湛江安度斯生物有限公司
1807272
EU/ml
0.125
细菌内毒素标准品
中国食品药品检定研究院
15061-201886
EU/支
80
细菌内毒素检查用水
湛江安度斯生物有限公司
1811090
ml/支
5
反应结果
保温时间（11：
50～12：
50）
阴性对照
全阴性（--）
阳性对照
全阳性（++）
N/A
稀释倍数
8
16
64
供试品溶液
+
-
-
-
-
-
供试品阳性对照
+
+
+
+
+
+
标准规定
当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性，实验有效。
当系列浓度中出现供试品溶液2管为阴性，供试品阳性对照2管为阳性时，认为供试品在该浓度下不干扰实验，此稀释倍数即为最小不干扰稀释倍数。
即可选择该稀释倍数进行正式干扰试验
最小不干扰系数是倍数
16倍
检验人员
校对人员
表3
干扰试验记录
检品名称
IAH20170-20181207-DS
检验日期
2020.02.27
生产单位
盛禾（中国）生物制药有限公司
室温
15.1℃
供样单位
盛禾（中国）生物制药有限公司
规格
C=20.6mg/ml
批号
IAH20170-20181207
包装
低吸附离心管
检验依据
2015年版《中国药典》
ⅧE细菌内毒素检查法
内毒素限度
0.1EU/mg
试剂名称
生产单位
批号
灵敏度/效价
规格
鲎试剂
湛江安度斯生物有限公司
1807272
EU/ml
0.125
细菌内毒素标准品
中国食品药品检定研究院
15061-201886
EU/支
80
细菌内毒素检查用水
湛江安度斯生物有限公司
1811090
ml/支
5
实验操作
1.标准品稀释：
同鲎试剂灵敏度复核实验稀释方法相同。
2.供试品制备：
取0.5mlIAH20170-20181207-DS样品（c=20.6mg/ml）+7.5ml检查用水
1.2875mg/ml供试品溶液8ml
3.含供试品内毒素溶液的制备：
取细菌内毒素标准品80EU/支+1ml供试品溶液80EU/ml
取0.2ml80EU/ml溶液+1.4ml供试品溶液10EU/ml
取0.2ml10EU/ml溶液+1.8ml供试品溶液1EU/ml
取1.0ml1EU/ml溶液+3.0ml供试品溶液0.25EU/ml
取1.0ml0.25EU/ml溶液+1.0ml供试品溶液0.125EU/ml
取1.0ml0.125EU/ml溶液+1.0ml供试品溶液0.0625EU/ml
取1.0ml0.0625EU/ml溶液+1.0ml供试品溶液0.03125EU/ml
即得到2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ四个浓度的含供试品内毒素溶液。
反应结果
保温时间（13：
30～14：
30）
含供试品内毒素（EU/ml）
系列/管数
2λ
（0.25）
λ
（0.125）
0.5λ
（0.0625）
0.25λ
（0.03125）
反应终点浓度
（EU/ml）
A
全阴性
/
B
1
+
+
-
-
0.125
2
+
+
-
-
0.125
3
+
+
-
-
0.125
4
+
+
-
-
0.125
C
1
+
+
+
-
0.0625
2
+
+
-
-
0.125
3
+
+
-
-
0.125
4
+
+
-
-
0.125
D
全阳性
/
结果计算
Es=0.105EU/ml
Et=0.125EU/ml
Et在0.5Es-2.0Es范围内。
结果判定
供试品在c=20.6mg/ml浓度下不干扰试验，可进行细菌内毒素检查
检验人员
校对人员
表3
细菌内毒素检查记录
检品名称
IAH20170-20181207-DS
检验日期
2020.02.27
生产单位
盛禾（中国）生物制药有限公司
室温
15.1℃
供样单位
盛禾（中国）生物制药有限公司
规格
C=20.6mg/ml
批号
IAH20170-20181207
包装
低吸附离心管
检验依据
2015年版《中国药典》
ⅧE细菌内毒素检查法
内毒素限度
0.1EU/mg
试剂名称
生产单位
批号
灵敏度/效价
规格
鲎试剂
湛江安度斯生物有限公司
1807272
EU/ml
0.125
细菌内毒素
标准品
中国食品药品检定研究院
15061-201886
EU/支
80
细菌内毒素检查用水
湛江安度斯生物有限公司
1811090
ml/支
5
实验操作
1.标准品稀释：
取细菌内毒素标准品80EU/支+1ml检查用水80EU/ml
取0.2ml80EU/ml溶液+1.4ml检查用水10EU/ml
取0.2ml10EU/ml溶液+1.8ml检查用水1EU/ml
取1.0ml1EU/ml溶液+3.0ml检查用水0.25EU/ml
即得到2.0λ浓度的内毒素标准溶液。
2.供试品制备：
MVD=cL/λ
=20.6*0.1/0.125
=16.48
取稀释16倍
3.供试品阳性对照液的制备：
0.1ml2.0λ浓度的内毒素标准溶液+0.1ml稀释16倍后的供试品溶液
仪器：
内毒素试管恒温仪
保温时间：
（15：
00～16：
00）
保温温度：
37℃
结果
阴性对照
阳性对照
供试品管
供试品阳性对照
-
-
+
+
-
-
+
+
结果判断
内毒素检验合格（＜0.1EU/ml）
检验人员
校对人员
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