1.2.2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数.ppt

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土壤中分解尿素的细菌的分离与计数选修1专题2课题2宜宾县二中生物备课组,课题背景,1、尿素的利用,尿素是一种重要的农业氮肥。

尿素不能直接被农作物吸收。

土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。

2、细菌利用尿素的原因,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶,从土壤中分离出能够分解尿素的细菌,统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌,课题目的,一.研究思路,.筛选菌株,.统计菌落数目,.设置对照,新课：

新课：

三、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,实验目的：

以尿素作唯一氮源的选择培养基上，经稀释涂布平板法使得分解尿素的细菌形成单菌落并计数。

实验过程：

（知识网络）,配制培养基,选择培养基筛选菌种,恒温培养箱中培养,结果分析与评价,计算称量溶化灭菌倒平板,菌种保藏,1、实例：

启示：

寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。

原因：

因为热泉温度70800C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。

DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。

.筛选菌株,2、实验室中微生物的筛选原理：

人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。

知识链接：

什么是选择性培养基？

根据某种微生物的特殊营养要求或其对某理化因素的抗性而设计的培养基使混合菌样中的目标菌种变成优势菌，从而提高该菌的筛选率。

加入青霉素的培养基:

分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基:

分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基:

分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基:

分离自养型微生物加入青霉素等抗生素的培养基:

分离导入了抗生素抗性基因的受体细胞,选择培养基,15.0g,琼脂,1.0g,尿素,10.0g,葡萄糖,0.2g,MgSO47H2O,2.1g,NaH2PO4,1.4g,KH2PO4,3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：

从物理性质看此培养基属于哪类？

固体培养基,把上述物质溶解后，蒸馏水定容到1000mL,在此培养基中哪些作为碳源、氮源？

碳源：

葡萄糖、尿素氮源：

尿素,培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。

缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。

4、培养基选择分解尿素的微生物的原理,5、怎样证明此培养基具有选择性呢？

以尿素为唯一氮源的培养基,牛肉膏蛋白胨培养基,是,分离尿素细菌,判断该培养基有无选择性,只生长尿素细菌,生长多种微生物,是,1、显微镜直接计数：

利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。

.统计菌落数目：

不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；,缺点,2.间接计数法（活菌计数法）原理：

在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。

常用方法：

稀释涂布平板法。

每克样品中的菌落数（CV）M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（ml），M代表稀释倍数。

注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。

为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。

统计的菌落往往比活菌的实际数目低（原因？

）,设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

.设置对照：

实例：

在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。

分析其原因。

原因：

土样不同，培养基污染或操作失误（或者是混入了其他的含氮物质）,小结：

通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。

参考方案一：

由其他同学用与A同学相同土样进行实验,参考方案二：

将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。

结果预测：

如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。

二.实验设计.土壤取样从肥沃、湿润的土壤中取样。

先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。

取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。

.制备培养基：

制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。

应在火焰旁称取土壤10g。

在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行,三样品的稀释,四.取样涂布,实验时要对培养皿作好标记。

注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。

（五）.取样涂布,分离不同的微生物采用不同的稀释度,原因：

不同微生物在土壤中含量不同,（六）.微生物的培养与观察,在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。

选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。

培养不同微生物往往需要不同培养温度。

细菌：

3037培养12d放线菌：

2528培养57d霉菌：

2528的温度下培养34d。

如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。

微生物的培养与观察,三.结果分析与评价1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。

2.提示：

选择每个平板上长有30300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。

同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。

四、操作提示,无菌操作,做好标记,规划时间,五.课外延伸在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。

培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。

测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到伊红-美蓝培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。

大肠杆菌呈黑色中心,有或无金属光泽,大肠杆菌在伊红美蓝琼脂（EMB）上典型特征,本课题知识小结:

六、例题解析,例1对细菌群体生长规律测定正确的表述是A在液体培养基上进行B至少接种一种细菌C接种一个细菌D及时补充消耗的营养物质,解析：

细菌群体生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。

这些条件是：

一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数。

在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。

测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过样品推测细菌总数。

若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。

在接种时，要保证一定的接种量。

答案：

A,1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（）A.在液体培养基上进行B.至少接种一种细菌C.接种一个细菌D.及时补充消耗的营养物质2.使用选择培养基的目的是（）A.培养细菌B.培养真菌C.使需要的微生物大量繁殖D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是（）A.CO2和N2B.葡萄糖和NH3C.CO2和尿素D.葡萄糖和尿素,实践训练,A,C,D,4.下列说法不正确的是（）A.科学家从7080度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。

5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）A.较多的氮源物质B.较多的碳源物质C.青霉素类药物D.高浓度食盐,B,C,练一练用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目，其结果与实际值相比（）A.比实际值高B.比实际值低C.和实际值一致D.比实际值可能高也可能低,B,下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是（）A.KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、水B.KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、琼脂、水C.KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、尿素、琼脂、水D.KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水,B,下课了,