生化实验05凯氏定氮法.ppt

生化实验05凯氏定氮法.ppt

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1,实验06植物组织中总氮含量的测定（微量凯氏定氮法）,2,氮素代谢在植物新陈代谢中占有主导地位。

测定氮素含量对于研究植物的氮素吸收、运输和代谢规律，以及确定农产品品质、营养价值等均具有一定意义。

动植物组织中的氮包括蛋白氮和非蛋白氮两大类，主要以有机氮形式存在。

由于蛋白质的含氮量相对稳定，测定出样品中总氮含量，再乘上一个系数即可得出样品中粗蛋白含量。

如要准确测定蛋白质含量，则需利用三氯乙酸将样品中蛋白质沉淀出来，再分别测定蛋白氮和非蛋白氮。

组织中含氮量常用凯氏定氮法测定。

3,一、原理,在催化剂（如CuSO4、K2SO4、硒粉等）存在的条件下，将植物材料与浓硫酸共热，有机物氧化分解成CO2和H2O，其中的氮转变为氨，并进一步生成（NH4）2SO4，这个过程称为消化。

在消化后的样品中加入过量的NaOH，经强碱碱化使之分解释放出NH3,通过蒸馏借蒸汽将NH3导入过量的硼酸溶液中生成四硼酸铵；再用标准盐酸滴定，直到硼酸溶液恢复到原来的H+浓度，根据盐酸的用量即可计算出样品中总氮的含量。

4,一、原理,以甘氨酸为例的化学反应式：

消化：

CH2NH2COOH+3H2SO42CO2+3SO2+4H2O+NH32NH3+H2SO4（NH4）2SO4蒸馏:

（NH4）2SO4+2NaOH2H2O+Na2SO4+2NH32NH3+4H3BO3（NH4）2B4O7+5H2O滴定：

（NH4）2B4O7+2HCl+5H2O2NH4Cl+4H3BO3,5,材料：

面粉仪器设备：

消化管、分析天平、微量凯氏定氮蒸馏装置、容量瓶、三角瓶、滴定管、移液管、消煮炉等。

试剂：

1.浓硫酸（AR级）；2.30%（W/V）NaOH；3.30%H2O2；4.0.01mol/LHCl标准溶液；5.2%硼酸溶液；6.混合催化剂；7.混合指示剂；8.标准（NH4）2SO4溶液,二、材料、仪器设备及试剂,6,凯氏定氮蒸馏装置,全自动凯氏定氮仪,7,三、实验步骤,1.样品消化（已完成）准确称取0.1-0.2g样品（依其含氮量而定）至消化管中，加入5mL浓硫酸和0.3-0.5g混合催化剂，浸泡数小时后在管口盖一小漏斗，放在消煮炉上加热消化。

开始时温度可稍低，加热至管口不再产生泡沫时可逐渐升温，使消化管内液体达到微沸，直到消化液褐色消失并全部变为清澈透明为止。

在消化过程中，可分数次加入少许H2O2以加速有机物氧化。

如发现在消化管上部有黑色颗粒，应小心转动消化管，用消化液将其冲洗下来。

整个过程一般需3-4小时，均应在通风橱中进行。

8,2.定容：

消化液冷却后，沿管壁仔细加入10mL左右无氨蒸馏水以冲洗管壁冷却后转入100mL容量瓶，再用少量无氨蒸馏水冲洗消化管数次，洗涤液一并转入容量瓶冷却后用无氨蒸馏水定容至刻度，混匀后备用。

3.蒸馏

（1）仪器洗涤：

在蒸汽发生器中加入2/3体积蒸馏水关闭汽水分离器阀和进样漏斗、并使管道联通打开冷凝管打开电炉加热蒸汽发生器，用热蒸汽通入仪器各部分清洗15min。

9,3.蒸馏

（1）仪器洗涤冲洗完毕，从加样漏斗向蒸馏反应管加入无氨蒸馏水，清洗蒸馏反应管打开汽水分离器阀、夹紧蒸汽发生器与蒸馏反应管之间的橡皮管，由于冷却减压使得反应瓶中废液被虹吸进入隔热套中打开隔热套下端的活塞阀排出废液。

如此清洗2-3次。

可将冷凝管下口浸入硼酸-指示剂混合液中检测清洗效果，当硼酸-指示剂混合液不变色时，表明蒸馏装置清洗干净。

10,3.蒸馏

（2）样品蒸馏在三角瓶中装入20mL硼酸-指示剂混合液（此时应为紫红色，如变为蓝色，应倒出重装或清洗三角瓶）承接在冷凝管下端出口，将出口浸入在溶液中打开隔热套下端的活塞准确吸取10mL样品消化液通过加样漏斗加入蒸馏反应管中通过漏斗加入10mLNaOH溶液用少量无氨蒸馏水重复冲洗漏斗3次塞紧漏斗塞，再在漏斗中加入少量蒸馏水密封漏斗关闭隔热套下端活塞和汽水分离阀，打开蒸汽发生器与蒸馏反应管之间的橡皮管夹，开始蒸馏观察硼酸-指示剂混合液颜色变化，从颜色变绿起再蒸馏3-5min后，将三角瓶液面移离冷凝管下口约1cm继续蒸馏1min左右，结束蒸馏。

11,3.蒸馏（3）空白蒸馏用未加植物样品的消化液（其余试剂都加入并按同样方法进行消化）为空白液，按样品消化液的蒸馏方法进行蒸馏。

4.样品及空白滴定样品和空白蒸馏完毕后，分别用0.01mol/L盐酸标准溶液滴定，直到硼酸-指示剂混合液变回淡紫红色即为滴定终点，记录滴定样品和空白蒸馏液的盐酸用量。

（滴定空白蒸馏液的盐酸用量一般为0.2mL）,12,W=g（根据样品管编号在讲台上查表获得）；VT=mL;Vs=mL;A=mL；B=0.2mL,四、数据记录,五、结果计算,样品总氮含量（%）=面粉粗蛋白含量（%）=样品含氮量（%）5.70,（C：

滴定时标准盐酸溶液浓度（0.0100mol/L）；VT：

消化液定容总体积（mL）；W：

样品质量（g）；Vs：

蒸馏时取样体积（mL）；A：

滴定样品所用盐酸体积（mL）；B：

滴定空白所用盐酸体积（0.2mL）,13,为了熟悉蒸馏和滴定的操作技术和检验实验的准确性及误差，常用已知浓度的标准硫酸铵溶液测试3次；每次蒸馏前均需清洗蒸馏反应管；在蒸馏过程中，不能同时关闭汽水分离阀和蒸汽发生器与蒸馏反应管之间的橡皮管夹；定氮仪各连接处不能漏气。

注意事项：

14,实验07抗坏血酸（Vc）含量的测定（滴定法）,15,一、原理,Vc具有很强的还原性，染料2,6-二氯酚靛酚具有较强的氧化性，且在酸性溶液中呈红色，在中性或碱性溶液中呈蓝色。

用草酸提取Vc，然后用蓝色的碱性2,6-二氯酚靛酚溶液对其进行滴定时，Vc可将2,6-二氯酚靛酚还原成无色。

但当Vc被消耗完后，再滴入少许2,6-二氯酚靛酚就会使溶液呈现红色，借此可指示滴定终点。

根据标准2,6-二氯酚靛酚的用量，可以计算出被测样品中Vc的含量。

抗坏血酸又称为维生素c（Vc），在一般水果、果蔬中含量较高。

测定Vc含量，可作为衡量果蔬品质指标之一。

16,材料：

苞菜或其他果蔬仪器设备：

蒸发皿、天平、容量瓶、研钵、碱式滴定管、漏斗、移液管等试剂：

1.2%草酸；2.碱性2,6-二氯酚靛酚溶液（蓝色）；3.0.1mg/mL标准Vc溶液（用草酸配制）,二、材料、仪器设备及试剂,2,6-二氯酚靛酚溶液（蓝色）,17,三、实验步骤,1.样品提取准确称取3g左右样品放入研钵中，加入2%草酸溶液约5mL研磨匀浆液转入50mL容量瓶，用草酸洗涤研钵3次，洗涤液一并转入容量瓶中用草酸定容至刻度过滤，收集滤液，备用。

2.空白滴定取2%草酸10mL至蒸发皿中，用2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至粉红色，并在30s内不褪色为滴定终点，记录染料用量。

18,三、实验步骤,4.样品滴定取滤液10mL至蒸发皿中，用2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至粉红色，并在30s内不褪色为止。

记录染料用量。

3.染料标定取10mL标准Vc溶液至蒸发皿中，用2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至粉红色，并在30s内不褪色为滴定终点。

计算1mL染料相当于Vc的mg数，即滴定度（A）。

19,W=g；V1=mL;V0=mL；VT=mL;Vs=mL,四、数据记录,五、结果计算,样品Vc含量（mg/100g）=,（A：

滴定度（mg/mL）；V标：

染料标定所用染料体积（mL）；V1：

滴定样品所用染料的mL数；V0：

滴定空白所用染料的mL数；VT：

样品液定容总体积（mL）；Vs：

滴定时取样品溶液的体积（mL）；W：

样品质量（g）,滴定度（mg/mL）A=,