核酸的杂交(分子生物学)朱-096学时.ppt

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核酸的杂交,核酸杂交基本类型,1。

Southernblot2.NorthernblotWesternblot应用：

克隆筛选、特定基因序列测定。

1）DNA杂交探针为DNA2）RNA杂交探针为DNA或cDNA,3）蛋白质免疫分析探针为抗体,主要内容,一、核酸杂交的基本原理（掌握）二、核酸探针（熟悉掌握）三、杂交技术（了解）,第一节核酸杂交的基本原理,一、核酸的变性,1在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。

2变性方式,

（1）DNA热变性：

是最常用的方法，一般加热80-100数分钟即可使核酸分子氢键断裂，双链分开。

（2）热、酸、碱、化学试剂（如：

尿素、甲酰胺、甲醛等）。

变性的核酸分子失去了生物活性，同时理化性质也随之改变，其紫外吸收值（A260）也随之升高。

可用紫外吸收的变化来跟踪DNA的变性过程。

以A260吸收值对应温度作图，得到DNA的变性曲线或熔解曲线。

1特点1）增色效应：

在260nm紫外吸收值升高。

2）Tm值改变3）粘度下降、比旋度下降、沉降系数升高。

4）生物活性丧失。

影响Tm值的因素,1。

碱基组成：

G-C含量多，Tm值高；A-T含量多，Tm值低。

2。

离子强度：

低离子强度，Tm值低，范围宽；高离子强度，Tm值高，范围窄。

3。

PH值：

PH5-9，Tm变化不明显，PH小于4或大于11，Tm变化明显。

4。

变性剂：

各种变性剂都使Tm降低。

2.影响复性的因素,序列简单的分子复性快，如poly（dT）和poly（dA）识别快DNA片段愈大，扩散速度愈低，复性慢离子强度有利于复性DNA浓度复性,Tm值的估算20bpTm=69.3+0.41（G+C）%Tm=81.5+16.6lgM+0.41（G+C）%-500/n-0.61（甲酰胺%）,3变性过程,DNA变性过程是一个逐渐的过程：

AT区先解链，GC区后解链。

DNA变性曲线AT区先解链GC区后解链阶梯式曲线,GC含量与Tm值之间的关系（G+C）%=（Tm-69.3）2.44Tm=（G+C）%0.41+69.3,二、核酸的复性,1概念：

变性DNA两条互补单链，在适当条件下重新缔合成双链的过程。

2特点1）理化性质恢复。

2）生物活性部分恢复,3核酸复性的阶段,

（1）成核阶段：

两条单链局部碰撞，形成双链；

（2）拉练式阶段：

在成核基础上，其余部分碱基互补,复性过程

（1）单链分子间碰撞形成局部双链

（2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离（3）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列（4）形成完整的双链分子,4影响复性过程的因素,单链核酸的起始浓度：

反应开始时的总浓度可直接影响单链分子碰撞的几率，浓度越高，复性越快。

核酸链长度（分子量）：

分子越长，扩散越慢，形成配对的难度也大，复性也慢。

核酸分子的复杂性：

复杂性即核酸分子中不同序列的总长度，复杂性越高，形成正确配对的难度也越大，复性越慢。

温度：

温度过高有利于变性；过低则分子运动减慢，少数碱基形成的局部双链也不易解离。

适宜的复性温度是比Tm低25。

离子强度（盐浓度）：

适当的离子强度可中和核酸分子上磷酸基团所带的负电，减少双链间的静电斥力，有利于复性。

离子强度过高则不利于复性。

三。

核酸杂交概念：

利用变性作用将DNA双链分开，加入不同来源的DNA单链或RNA链，经过退火处理，不同来源的两条多核苷酸链依靠碱基互补关系形成杂种双螺旋的过程。

复性,RNA,DNA,杂交,影响核酸杂交的因素,1。

探针浓度：

双链探针浓度大，DNA-RNA杂交受影响，（0.10.5g,）单链探针浓度大核酸杂交率一般增加。

2。

碱基组成：

G-C含量多，杂交率增加。

3。

温度：

1）0，杂交非常缓慢，2）低于Tm20-25，杂交率最大3）温度为Tm-5杂交率十分低下。

4。

离子强度（盐浓度）：

适当的离子强度可中和核酸分子上磷酸基团所带的负电，减少双链间的静电斥力，有利于杂交。

离子强度过高过低则不利于杂交。

5。

核酸分子：

分子越大，越复杂，杂交难度大，杂交也慢。

分子越小，易杂交。

第二节核酸探针,一、探针的概念核酸探针的概念,指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交，杂交后又能被特殊方法检出的已知被标记的核苷酸链,二、探针种类和选择,1种类基因组DNA探针CDNA探针RNA探针CRNA探针寡核苷酸探针,基因组DNA探针,制备：

一般从基因文库中选取某一基因片段与载体连接，克隆后酶切得到,优点：

制备方法简单，不易降解，标记方法成熟。

1.基因组DNA探针,从基因组DNA文库中选取某一基因片段,与载体连接（质粒、噬菌体）,克隆（PCR扩增）,酶切,优点：

无性繁殖、制备方法简单；不易降解（与RNA比较）；标记方法成熟。

重组DNA导入受体菌,目的基因,基因载体,重组体,分,切,接,转,筛,表达,总体技术路线,Boyer和Cohen的实验,Boyer和Cohen的实验,2.cDNA探针（complementaryDNA）,S1核酸酶切平两端,优点：

不含内含子及高度重复序列但不易获得,载体连接,克隆,通过逆转录,双链cDNA,加接头限制酶粘性末端,3.RNA探针：

检测DNA和mRNA,优点：

杂交效率高，稳定性高，非特异性杂交较少,未杂交探针可用RNase降解，减少本底的干扰。

缺点：

易降解，标记方法复杂,2.cDNA探针（complementaryDNA）,S1核酸酶切平两端,优点：

不含内含子及高度重复序列但不易获得,载体连接,克隆,通过逆转录,双链cDNA,加接头限制酶粘性末端,3.RNA探针：

检测DNA和mRNA,优点：

杂交效率高，稳定性高，非特异性杂交较少,未杂交探针可用RNase降解，减少本底的干扰。

缺点：

易降解，标记方法复杂,4.寡核苷酸探针,优点：

可根据需要合成相应序列；探针短,序列复杂性低,分子量小，因此杂交时间短;长度只有1050bp，该识别序列内1个碱基的变化可明显降低杂交Tm值。

可大量合成，价格低，能够用酶学或化学方法进行非放射性标记。

三、探针设计原则：

长度：

1050bp,碱基成分:

G+C含量为40%60%,探针分子内无互补序列。

避免同一碱基重复出现。

一旦选定某一序列后，尚需与已知的各种基因序列进行同源性比较，与非靶区域的同源性不应超过70%或有连续8个或更多的碱基同源。

四、探针标记物的选择,理想的标记物：

具有高度的灵敏性,与探针结合后，不影响杂交及探针的主要理化特性,检测方法高灵敏性、高特异性，假阳性率低，环境污染少，价格低廉；,若用酶促方法标记，应对Km影响不大,寡核苷酸探针,制备：

先设计一个2050个碱基的核苷酸顺序，在DNA合成仪上合成,优点：

可根据需要合成，探针短，杂交时间短，价格低,设计探针的原则,

（1）探针长度1050bp

（2）G-C为4060%（3）避免同一碱基的连续出现4个（4）避免碱基反向互补碱基对应4bp（5）与非靶基因序列有70%以上的同源性，应重新设计,三、探针标记原理,理想探针标记物的特征：

探针标记物：

1）同位素标记；2）非同位素标记,1高灵敏度2三不影响：

探针分子配对、理化特性、杂交特性3检测方法特异性：

污染小、价格低4对酶影响小,

（一）放射性同位素标记物,

（1）标记探针的同位素：

32P、3H、35S、131I、125I、14C优点：

1，检测特异性高；2，灵敏度高：

10-1410-8物质可检测；3，对酶无影响；4，对碱基配对无影响缺点：

污染,125I，3H，14C用于蛋白质标记；32P，3H，35S用于核酸标记，其中32P和35S使用频率高。

32P标记核苷酸的位或位，35S则是标记核苷酸的位.,

（二）非放射性标记物,。

半抗原如生物素等；。

配体如抗生物素蛋白卵白素；。

莹光素如罗丹明；。

化学发光。

图13-9生物素标记探针检测核酸过程示意图,荧光标记物,ddGTP,ddATP,ddTTP,ddCTP,四、探针放射性同位素标记法,1，缺口平移法1）试剂：

DNA聚合酶I，原料dATP、dGTP、dTTP、32p-dCTP、待标记DNA片段。

2）基本原理,1。

双链DNA在DNA内切酶，Mg存在下，将DNA一条链上随机切开若干个切口，切口处为3-末端。

2。

DNA聚合酶I在3-末端逐个加入标记核苷酸，由于该酶具有53外内切酶作用，故同时在5端的核苷酸逐个切除。

这样3端和5端同时进行，导致切口沿着DNA链移动而为缺口平移。

3。

新合成的核苷酸链与旧核苷酸链完全相同，不同的是由同位素标记的核苷酸代替了无标记的核苷酸。

DNA聚合酶I的作用1）从3-末端催化链的沿长；2）从5-末端外切酶的活性。

3）方法,2。

随机引物法,1）试剂：

DNA聚合酶I，原料dATP、dGTP、dTTP、32p-dCTP、待标记DNA片段，引物。

2）优点：

比活性高，结果较稳定。

3）基本原理,1。

加入变性剂，使双链DNA打开；2。

加入引物，（6-8个核苷酸），与打开DNA链结合；3。

加入同位素标记核苷酸和DNA聚合酶I，使之在引物的3-末端沿53按碱基互补合成新的DNA链。

4）随机引物法的方法,五、非放射性探针标记,分类：

酶标记法：

标记物+单核苷酸标记核苷酸链化学标记法：

标记物+核苷酸链标记核苷酸链标记物：

生物素、地高辛光生物素、补骨脂素、2-乙酰氨基芴,酶,化学反应,1。

光敏生物素标记核酸,光敏物与生物素结合而成。

芳香叠氮-生物素连接臂芳香叠氮-连接臂-生物素核苷酸链芳香叠氮-连接臂-生物素核苷酸链,2。

酶促生物素标记核酸,生物素-连接臂-dNTPDNA聚合酶I酶I,生物素-连接臂-标记DNA,3。

酶标,酶（AP，HRP）碱性基团（对苯醌-聚乙烯亚胺）变性DNA酶-对苯醌-聚乙烯亚-DNA,六、核酸探针检测,1。

放射性探针检测自显影2。

非放射性探针检测,2、非放射性探针检测方法,1）两步法：

a.探针与检测体系偶联，形成中间物b.中间物再与显色系统反应，得出杂交结果,1）类型：

a.直接法；b.间接免疫法；c.直接亲和法；d.间接亲和法；e.间接免疫亲和法2）显色体系：

A.AP显色体系B.HRP显色体系,3.非放射性探针检测显色体系,1）AP显色体系：

ASO-AP+BCIPBCI-OH+PiBCI-OH+NBT蓝紫色沉淀,pH9.5,2）HRP显色体系：

HRP+H2O2HRP。

H2O2ODA-NH2+HRP。

H2O2ODA-N=N-ODA棕色沉淀+HRP+H2O,第三节核酸分子杂交技术,分类：

一、液相分子杂交，二、固相分子杂交,一、液相分子杂交,两条杂交的核酸链游离在溶液中，在一定条件下（温度、时间等）进行杂交，然后除去没有杂交的探针，得到杂交核酸分子。

二、固相分子杂交,待测靶核苷酸预先固定在固体支持物上，标记的探针则游离在溶液中进行杂交，最后使杂交分子留在支持物上,固相分子杂交分类,。

膜上印迹杂交（最常用）。

细胞原位杂交,。

滤膜杂交的基本过程,（）核酸制备（）电泳（）印迹（）预杂交（）杂交（）洗膜（）检测,。

固相支持物选择,特点：

）结合核酸强；）不影响杂交反应；）结合核酸稳定；）非特异性吸附少；）机械性能好。

1、硝酸纤维膜：

是目前使用最多的固相支持物，对单链DNA具有较强的吸附作用。

RNA经过一些特殊的变性剂处理后，也易于结合到此膜上，尤其是在高盐浓度下，其结合能力可使80-100g/cm2吸附的单链DNA或RNA在真空干烤后依靠疏水作用而吸附在膜上。

优点杂交信号本底较低。

缺点由于是靠疏水作用结合DNA，这种结合并不十分牢固，随杂交及洗膜过程DNA会慢慢脱离硝纤膜而使杂交信号下降。

对小分子量的DNA片段（200bp）结合能力不强。

靠高盐与DNA结合，故不适用于电转移。

易破碎。

2、尼龙膜：

对单链和双链DNA及RNA的结合能力达到350-500g/cm2。

对小分子量的核酸片段也有较强的结合能力。

不一定通过真空干烤，只需短时间紫外线照射，核酸中的部分嘧啶碱即可与膜上带正电荷的氨基相互交联，从而使结合更加牢固。

优点吸附力强（共价结合）、机械性能好（不易破碎、可重复使用）。

缺点对蛋白具有高度亲和力，不宜使用于非同位素探针；杂交信号的本底也高。

3、PVDF膜：

与尼龙膜相似，其疏水性碳氟化合物可加强与核酸中磷酸成分的离子反应，而比尼龙膜结合力更强，且在预杂交中很容易被封闭。

杂交本底低，结实耐用，可多次杂交。

1.Southern印迹杂交,主要步骤：

Southern印迹杂交方法,1Southern印迹酶切纯化DNA样品琼脂糖电泳分离变性液使之变性变性单链DNA转到膜上固定膜80OC干燥待杂交备用,DNA或RNA电泳分离核酸片段转移至固相支持物（印迹技术）杂交洗去未杂交探针杂交信号检测,带有DNA片段的凝胶,Southern印迹杂交的技术流程,白瓷盘,玻璃板,滤纸,凝胶,尼龙膜,滤纸,吸水纸,玻璃板,重物,吸水纸转膜,2Southern薄膜杂交膜预杂交杂交放射自显影冲洗底片分析结果其它还有：

Northern印迹杂交斑点杂交原位杂交等。

预杂交,为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异性结合，在杂交前可用封闭物将这些非特异位点封闭。

在杂前的这些处理过程称为预杂交。

常用于预杂交的封闭物：

变性的非特异性DNA：

常用鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA。

当与滤膜一起孵育后，除滤膜上已吸附样品DNA的区域外，它们可被吸附到所有其它区域，使整个背景覆盖一层。

由于它们与探针无同源性，在交杂反应中可大大减少探针的非特异性结合，使背影清晰。

高分子化合物：

某些高分子化合物具有封闭膜上非特异位点的能力。

一般常用Denhardt溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖。

目录,Western印迹杂交,将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电泳并染色后，转移到滤膜上固定，再用“抗体-抗原”免疫反应或“DNA-protein”结合反应鉴别滤膜上的蛋白质。

WesternBlot的作用原理,表达重组胰岛素的主要步骤,2电泳检测法,凝胶电泳检测,加样孔,DNAMarker,空质粒,重组质粒,重组质粒酶切,重组质粒的PCR扩增片段,二、影响杂交的因素,1.核酸分子的浓度和长度,2.温度：

比Tm低2530较适宜,3.离子强度：

离子强度杂交反应率,4.杂交液中的甲酰胺甲酰胺能降低核酸杂交的Tm，含30%50%甲酰胺的杂交溶液温度能降低到3042。

使用甲酰胺的优点：

低温下探针更稳定；能更好地保留非共价结合的核酸。

注意：

待测核酸顺序与探针顺序同源性高的杂交，用水溶液时取68，用50%甲酰胺溶液时取40。

待测核酸顺序与探针同源性不高时，以50%甲酰胺溶液在3540杂交。

5.核酸分子的复杂性直接影响复性几率。

6.非特异性杂交反应：

在杂交前将非特异性位点进行封闭，以减少对探针的非特异性吸附作用。

常用封闭物：

变性非特异DNA：

鲑鱼精子DNA，小牛胸腺DNA高分子化合物：

Denhardt溶液脱脂奶粉,第二节核酸探针,一、探针的选择原则,1.高度的特异性,2.制备探针的难易性和检测手段的灵敏法,二、探针的种类,蛋白杂交,一、蛋白质的免疫印迹（western）场所：

硝酸纤维素膜待检分子：

蛋白探针：

抗体杂交的方式：

经电泳分离不同的蛋白，转印到硝酸纤维素膜上，用特定的抗体与蛋白杂交，检测特定的蛋白。

二、所用抗体1、一抗：

针对待测分子的抗体2、二抗：

针对一抗的抗体，标记有放射性同位素或生物素,三、操作过程,蛋白的制备,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同的蛋白质,蛋白印迹,封闭,+阳极,-阴极,多孔垫片,滤纸,凝胶,载体,杂交（一抗与特定蛋白结合）,漂洗去除多余的一抗,二抗与一抗结合,漂洗去多余的二抗,结果检测,