RegⅣ基因缺失CRD结构域片段获得及其表达载体的构建与转染.docx

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RegⅣ基因缺失CRD结构域片段获得及其表达载体的构建与转染

RegⅣ基因缺失CRD结构域片段获得及其表达载体的构建与转染

作者：

郭英,徐佳佳,商延芳,李楠,高峰,黄培林

【摘要】目的：

探讨应用基因重叠延伸拼接PCR（SOEPCR）技术构建RegⅣ基因缺失CRD结构域表达载体，并转染RegⅣ低表达结直肠癌细胞系。

方法：

应用SOEPCR法获得RegⅣ缺失CRD结构域片段，构建真核表达载体并转染RegⅣ低表达结直肠癌LoVo细胞，G418筛选，RTPCR检测鉴定。

结果：

经酶切鉴定筛选出的重组体测序结果与目的序列完全一致，重组载体构建成功，经pcDNA3.1RegⅣdomain△转染的LoVo细胞RegⅣdomain△呈阳性表达。

结论：

利用SOEPCR技术可成功构建RegⅣ基因缺失CRD结构域的表达载体。

【关键词】RegⅣ；碳水化合物识别域；结直肠癌；基因转染；基因重叠延伸拼接PCR

Reg基因家族属于clectin的超家族，参与肝、胰、胃和肠细胞的增殖分化，并且其作用可能与lectin这个结构域有关［12］；而lectin已被考虑作为肿瘤体内、体外筛选、检测、诊断、预后判断和靶向治疗的生物标记物，并用以评估抗肿瘤治疗的风险与反应［35］。

Reg基因家族中研究最多的是RegⅠ基因，它在组织损伤、糖尿病、肿瘤及可能的抗凋亡因子方面扮演重要的角色，而RegⅣ与RegⅠ序列同源，结构相似，最明显的特征是都具有clectin区域［6］。

为了研究RegⅣ基因在肿瘤发生中的作用，探究RegⅣ基因结构域的功能，本研究应用基因重叠延伸拼接PCR（genesplicingbyoverlappingextensionPCR,SOEPCR）法构建缺失该结构域的表达载体（domain△）,并转染结直肠癌上皮细胞，为深入研究RegⅣ基因在结直肠癌发生发展中的作用构建技术平台。

1材料与方法

1.1材料

E.coliDH5α大肠杆菌为东南大学分子病理研究所保存，pcDNA3.1/（-）质粒、Trizol、Lipofectamine2000为Invitrogen公司产品，DEPC购自南京凯基公司，RNase、MarkerⅣ购自南京天为时代公司，Marker2000、RTPCR试剂盒、EcoRⅠ、BamHⅠ、T4连接酶、PCRPurification试剂盒购自大连宝生物公司，100bpMarker购自上海申能博彩公司，G418购自Gibco公司，无内毒素质粒中提试剂盒购自Promega公司。

1.2方法

1.2.1细胞株与细胞培养LoVo细胞购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所，该细胞系低表达RegⅣ基因的结肠癌细胞株。

LoVo细胞接种于含10%新生小牛血清、100U·ml-1青霉素、100μg·ml-1链霉素的DMEM培养液中，37℃、5%CO2环境中培养，至对数生长期进行实验。

1.2.2SOEPCR法获得RegⅣ基因缺失碳水化合物识别域（carbohydraterecognitiondomain，CRD）结构域片段根据GenBankRegⅣ基因RegⅣdomain△cds序列和pcDNA3.1/（-）质粒特点，按照酶切位点对侧翼序列的要求［7］设计合成4条引物并附带相应的酶切位点：

P1F，5′CATGAATTCATGGCTTCCAGAAGCAGAA

GCATGCGGCTGTTG3′；P1R，5′CTGTTTTGGCCAGGC

AGCTCAGCAACAGCCGCATGCTTCTGCTTC3′;P2F，5′C

TGAGCTGCCTGGCCAAAACAGGAGTCCTGGGTGATAT

CATCATGAGAC3′；P2R5′CGCGGATCCCTATGGTCG

GTAACAGCTGGGTCTCATGATGATATCACCCAGGACT

C3′。

将上述引物稀释到50pmol·μl-1，各取1μl混合后加水到100μl。

反应体系为：

混合的引物5μl，引物P1F和P2R各0.5μl，dNTP1μl，10×buffer5μl，Taq酶1μl，水37μl，总体系50μl。

PCR反应程序为：

95℃变性5min，70℃退火并延伸5min,95℃预变性1min;然后95℃30s，65℃30s，72℃50s，共25个循环；最后72℃延伸10min；4℃保存。

反应结束后PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,PCRPurification试剂盒纯化回收。

1.2.3pcDNA3.1RegⅣdomain△重组质粒的构建将纯化的RegⅣdomain△片段（118bp，含酶切位点）和质粒pcDNA3.1/（-）（5.4kb）分别按如下反应体系进行双酶切反应：

RegⅣdomain△12μl，pcDNA3.1/（-）12μl，10×buffer4μl，EcoRⅠ1.5μl,BamHⅠ1.5μl,ddH2O21μl,然后置37℃水浴2h，行琼脂糖电泳后分别用PCRPurification试剂盒纯化回收。

将酶切纯化回收后的RegⅣdomain△片段和质粒pcDNA3.1/（-）分别按如下反应体系进行连接反应：

10×buffer1μl，T4连接酶1μl，pcDNA3.1/（-）3μl，RegⅣdomain△5μl，16℃过夜，然后转化用CaCl2制备的新鲜感受态细菌DH5α。

次日在含100μg·ml－1羧苄青的LB平板上挑取2个单菌落进行双酶切、PCR鉴定（PCR产物需用回收胶试剂盒纯化）。

PCR产物采用下游引物用ABI3730测序仪测序和读序,测序结果与GenBank已公布的序列进行比较，由金斯特科技公司完成。

1.2.4细胞转染［8］及G418抗性筛选接种1×105个细胞于6孔板中,待细胞融合到90%左右，用Lipofectamine2000转染质粒表达载体到LoVo细胞。

重组质粒pcDNA3.1RegⅣdomain△0.8μg置于50μlOptiMEM中，2μlLipofectamine2000置于50μlOptiMEM中，轻轻混匀，室温放置5min后合并为100μl，再轻轻混匀室温放置20min，加入24孔板培养的LoVo细胞中24h，然后传代1次，加300μg·ml-1G418筛选1周后行RTPCR；转染成功后改用100μg·ml-1G418维持培养，细胞的靶基因RegⅣdomain△可稳定表达。

2结果

2.1SOEPCR结果

SOEPCR法扩增出长度为118bp的RegⅣ基因缺失CRD结构域片段目的条带（图1）。

2.2pcDNA3.1RegⅣdomain△重组质粒的双酶切鉴定pcDNA3.1RegⅣdomain△经EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切得到5.4kb的pcDNA3.1空载体条带和118bp的目的RegⅣdomain△基因条带（图2），与预期条带大小一致。

2.3重组质粒pcDNA3.1RegⅣdomain△的PCR鉴定重组质粒以P1F、P2R为引物行RTPCR鉴定，得到118bp的目的RegⅣdomain△基因条带（图3）。

2.4测序结果

PCR产物采用下游引物进行反向测序，与GenBank已公布的序列进行比较（基因编码AY007243），证实获得阳性重组质粒pcDNA3.1RegⅣdomain△（图4）。

2.5重组质粒pcDNA3.1RegⅣdomain△转染LoVo细胞后的RTPCR鉴定重组质粒pcDNA3.1RegⅣdomain△经过Lipotamine2000转染LoVo细胞后进行G418筛选，RTPCR检测转染的LoVo细胞RegⅣdomain△呈阳性表达，而转空质粒及未转染的LoVo细胞表达阴性（图5）。

3讨论

RegⅣ是近年发现的Reg家族在大肠腺瘤中高表达的差异表达基因，定位于1号染色体长臂，有一个保守的钙依赖碳氢化合物识别域C型lectin（CTL），又称CRD，位于RegⅣ蛋白的30～155区（db_xref="CDD:

22664"，NP_114433）［45］。

Oue等［9］研究发现，该基因在正常胃肠道及胰腺表达水平非常低，在炎症或肿瘤时可见原位或异位高表达，认为它的高表达与腺瘤的形成、腺癌的发生以及肠癌的分化程度、分期、淋巴结转移相关，可能是消化系统癌微转移的特异性标记物。

为了验证RegⅣ基因是否也是通过它的结构域起作用，我们实验小组应用了SOEPCR技术将剪切结构域后的两段基因片段拼接起来，得到RegⅣ缺失CRD结构域基因。

PCR技术是现代分子生物学的一个巨大突破，它能在体外迅速、大量、灵敏地扩增基因片段。

但是经PCR技术扩增的大量相关基因片段如何能有效拼接却是一个很值得探讨的问题。

传统的方法是引入限制性内切酶位点，这不但操作繁杂，而有时为了构建限性位点还会影响解读三联密码的正确性。

基因拼接的新方法，即SOE法，能巧妙地解决这个问题。

SOEPCR又称重组PCR（recombinantPCR），它是将两个或多个基因片段通过末端互补、重叠延伸的方法进行体外基因拼接的简单、快速的基因重组技术［10］，其原理如图6所示。

通过重组PCR对基因进行拼接的过程完全不依赖于限制性内切酶和连接酶,可以从根本上摆脱DNA片段内部酶切位点的束缚,无需在质粒、嗜菌体中进行,可直接在体外获得重组基因产物,具有传统的DNA重组技术无法比拟的优势。

若在引物中引入突变的碱基序列，则在产物中将按预先设计要求出现定点突变，可将基因重组和基因突变同时进行,重组率和突变率接近100%。

重组PCR技术除了用于两个或多个基因的拼接外,还可用于构建嵌合载体和嵌合基因、位点插入、位点删除、亚克隆和蛋白质工程、建立突变文库等。

尽管重组PCR技术显示出许多优势,但在应用中仍存在某些不足,如将进行重组的基因片段在1kb内,用此方法较好，大于1kb的片段用此方法拼接则有一定的困难。

此外,Taq酶有一定的错配率,在选择重组PCR技术进行基因克隆或表达时应慎重［1114］。

因此，为保证SOEPCR的特异性、保真度，需要考虑以下因素：

设计重叠引物时，重叠区域至少应有15～20bp；选择具有3′→5′外切校正活性的Taq酶，如Pfupolymerase、Pyrobest；待拼接片段须纯化；Mg2+浓度要低；循环数以20～25为宜。

常用的基因转染技术是利用一定的载体和导入方法将外源基因或靶基因导入靶细胞，并使其在靶细胞内表达。

本研究利用SOEPCR技术，获得了RegⅣ基因缺失CRD结构域片段，进而应用脂质体转染技术成功进行了该表达载体的构建与转染，为进一步确定RegⅣ基因结构域与全长基因功能之间的关系提供研究依据。

【参考文献】

［1］ZHANGYW,DINGLS,LAIMD.Reggenefamilyandhumandiseases［J］.WorldJGastroenterol，2003,9（12）:

26352641.

［2］WEISWI,KAHNR,FOURMER,etal.StructureofthecalciumdependentlectindomainfromaratmannosebindingproteindeterminedbyMADphasing［J］.Science,1991，25（4）:

16081615.

［3］ZHANGYW,LAIMD,GUXM,etal.RegⅣ,adifferentiallyexpressedgeneincolorectaladenoma［J］.ChineseMedicalJournal，2003,116（6）:

918922.

［4］ZHANGYW,LAIMD,LVBJ,etal.OverexpressionofRegⅣincolorectaladenoma［J］.CancerLetters，2003,200

（1）:

6976.

［5］VIOLETTES,FESTORE,PANDERAVASILEI,etal.RegⅣ,anewmemberoftheregeneratinggenefamily,isoverexpressedincolorectalcarcinomas［J］.IntJCancer,2003,103

（2）:

185193.

［6］张宇伟，来茂德.非同位素反向Northern筛选法［J］.遗传，2004,26（3）:

353355.

［7］高峰，黄培林，郑声琴，等.RegⅣ基因在结直肠癌细胞系中的mRNA表达及pcDNARegⅣ的构建与转染［J］.东南大学学报：

医学版，2006，3（25）:

147150.

［8］WUG,NOMOTOS,HOQUEMO,etal.DeltaNp63alphaandTAp63alpharegulatetranscriptionofgeneswithdistinctbiologicalfunctionsincanceranddevelopment［J］.CancerRes，2003，63（6）:

23512357.

［9］OUEN,MITANIY,AUNGPP,etal.ExpressionandlocalizationofRegⅣinhumanneoplasticandnonneoplastictissues:

RegⅣexpressionisassociatedwithintestinalandneuroendocrinedifferentiationingastricadenocarcinoma［J］.Pathol,2005,207

（2）:

185198.

［10］洪晓武，熊思东，张亚平，等.人、黑猩猩和叶猴FKN全基因的克隆及体外表达的比较研究［J］.中国免疫学杂志，2007，4（23）:

326330.

［11］李敏,杨谦.一种高效构建同源重组DNA片段的方法——融合PCR［J］.中国生物工程杂志,2007,27（8）:

5358.

［12］XIONGAS,YAOQH,PENGRH,etal.Asimple,rapid,highfidelityandcosteffectivePCRbasedtwostepDNAsynthesismethodforlonggenesequences［J］.NucleicAcidsRes,2006,28

（1）:

9296.

［13］王艳君，杨谦.一种快速获得基因密码子偏爱性改造的方法［J］.中国生物工程杂志，2008,28（8）:

9699.

［14］王艳君，杨谦.角毛壳菌几丁质酶基因chi58多点突变及在毕赤酵母中的高效表达［J］.微生物学通报，2008,35（10）:

15441549.