控制中脑多巴胺神经以快速调节与忧郁相关的行为.docx

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控制中脑多巴胺神经以快速调节与忧郁相关的行为

（Rapidregulationofdepression-relatedbehavioursbycontrolofmidbraindopamineneurons）doi:

10.1038/nature11713

在大脑中，奖赏回路的腹侧被盖区（VTA ），存在着多巴胺神经元。

它在调节压力、回应方面扮演着重要的角色。

对于社会压力引起的反常行为，这种多巴胺神经元参与决定其易感性与复原性。

腹侧背盖区（VTA）多巴胺能神经元，显示两种体内模式脉冲：

低频率高强度脉冲，以及高频率阶段性脉冲。

众所周知，在反复的社会失败压力下，进行奖励信号编码的神经元的阶段性脉冲会向上调节。

（所谓的社会失败压力，是一个已被验证的忧郁小鼠模型）。

出人意料的是，这种病理生理效应仅在易感小鼠身上显现；而在复原性个体中，脉冲率并没有任何明显的变化。

然而，在有效时间内，缺乏有关的实验迹象来直接表明这与多巴胺神经元阶段性脉冲（用于提高易感（易忧郁）表现型）有关。

在这里，我们利用光遗传学的时间精度、细胞型以及投射通路特异性的优势，发现在自由活动的小鼠中,神经元中这些增强的阶性脉冲会对社会失败压力进行敏感地调节。

我们发现，在一只正经历着阈下的、社会失败模型的小鼠的腹侧被盖区（VTA）区，多巴胺神经元所激发的脉冲中，阶段的脉冲对光遗传学感应能快速地诱发了一个易感表现（从社会逃避的表现和减少的蔗糖现象角度考察），而高强度的脉冲则不能。

这些神经元的光遗传学阶段性刺激也在之前那些已经经受过反复的社会失败压力，并表现出复原性的小鼠中快速地诱发了一个易感型。

此外，我们还在投射通路的特异性中发现了其促进压力敏感性的差异：

投射向伏隔核

（NAC）的腹侧被盖区（VTA）神经元，一旦被阶段性激活，便能诱发社会失败压力的易感特性；而投射向向内侧前额叶皮质（mPFC）则不能。

相反的，光遗传学抑制VTA-NAC投影能诱发复原性，而抑制VTA-内侧前额叶皮质投射则促进易感性。

总的来说，这些研究揭示了新颖的抑郁症的脉冲图案，及特定的神经电路机制。

为了有选择性地作用于腹侧被盖区（VTA）多巴胺神经元，我们向热度酪氨酸羟化酶

（TH-Cre）转基因小鼠的腹侧被盖区（VTA）注射了一个表达光敏感通道（ChR2）的、融合了加强的黄色荧光蛋白（eYFP）的双液氧热度依赖腺病毒群（AAV）载体（AAV-DIO-ChR2-eYFP）。

我们首先验证了在活的TH-Cre小鼠VTA多巴胺神经元中AAV-DIO-ChR2-eYFP表达的特异性和效力。

接着，通过使用体内外的电生理学的记录而实现的对

VTA多巴胺神经元的ChR2-eYFP表达的功能确认则证实光遗传学刺激可以实现对这些神经元的精确瞬时控制（补充图1a-c）并且可以用于模仿在社会失败压力忧郁模型中产生阶段性脉在活体生理病理学的上调。

图1：

相对，而非互补地，VTA多巴胺神经在一个阈下社会失败的光刺激下包含有一个易感表型。

a,共焦影像显示了来自TH–Cre小鼠的TH-阳性多巴胺细胞中个AAV-DIO-

ChR2。

b,量化实验显示ChR2-表达的TH-阳性细胞占VTA中所有TH-阳性神经的62+-4%。

在TH-阴性神经（n=2-4组别来自n=4动物）。

c,光刺激协议模仿主位（0.5赫兹）或相位（20

赫兹）失败显示两个刺激协定，在10秒的时间内出现了超过5个阻止。

d,最高的面板，实验，时间表。

底部面板的细节示意图显示，在阈下社交失败刺激中有一个激光激励。

e,来自控制、主调和阶段的组别的社会交互数据（F2,3054.70,P,0.05;posthoctest,*P,0.05;

n57–14）。

f,在社会交互测试之后超过12-h测量蔗糖倾向（F2,2255.22,P,0.05;posthoctest,*P,0.05;n57–10）.错误线,6s.e.m.

为了探究在重复（十天）社会失败压力后VTA多巴神经元的阶段性脉冲增长的功能性结果，我们检查了正经历阈下的社会失败小鼠的ChR2-表达VTA多巴胺神经元中光学诱导对于高强度的（0.5-HZ）或阶段性的（20-HZ）脉冲（图1c;5尖峰/10秒）的影响（图

1d）。

经历着这种低于最低限度社会失败模型的小鼠没有出现社会逃避或者其他的类似抑郁的行为（补充图1d），但他们更容易受到后续压力的影响。

我们在小鼠经历阈下的社会失败模型时刺激VTA多巴胺神经元，并从社会交往和糖水偏爱这两个行为作为失败压力的后遗症进行测定：

如有社会回避以及对糖水偏爱减弱的行为，则表征着我们的重复（十天）社会失败模型诱发了易感表现型。

比较受高强度刺激ChR2-eYFP的小鼠和受阶段性刺激

eYFP刺激的小鼠，当目标小鼠在场时社会交往的明显下降（图1e和补充图1E-G）以及对糖水偏爱的显著下降（图1）表明受到了阶段性刺激的小鼠在显出抑郁性表现型方面有强劲增长。

这些数据证实了在置于压力时，增强了的VTA多巴胺神经阶段性脉冲（而非高强度脉冲）在提高抑郁性行为异常敏感性方面的功能重要性。

为了直接测试阶段性多巴胺神经脉冲和压力敏感性之间的的因果关系，我们将小鼠至于阈下的失败中，然后再在社会交往实验中刺激起VTA多巴胺神经元（补充图 2a）。

在目标CD1小鼠（或者目标鼠C57）存在的情况下，在社会交往实验中对VTA多巴胺神经元的阶段性刺激立刻诱发了一个易感表现型（增加的社会回避）（补充图 3），这是一个在受高强度刺激的ChR2小鼠或者受阶段性刺激eYFP控制的小鼠身上没有发现的影响（图2a，补充图2b-d）。

与高强度刺激ChR2小鼠或者阶段性刺激eYFP控制小鼠相比，在短暂的2.5-分钟社会交往测试过程中受到阶段性刺激的ChR2表达小鼠也表现出糖水偏爱

（图2b）。

这些发现是惊人的因为它们揭露了这些通常需要重复的社会失败压力的忧郁行为的快速的诱发。

与或在社会失败压力过程中或在社会失败后VTA 多巴胺神经元刺激对于提高抑郁行为的能力形成对照的是，我们发现在动物幼崽中这些神经元阶段性刺激没有产生于社会交往、糖水偏爱或者焦虑相关影响（补充图 4）。

这些发现表明在这里演示的这些VTA多巴胺神经激活的正向抑郁性影响是需要特定环境的，从这种多巴胺神经元的激活作用在其他体系中对于正向抑郁的影响来说这是一个重要的发现。

更进一步，慢性轻微的压力源或者身体上反感的刺激会抑制VTA多巴胺神经元活动，然而更多剧烈的压力源则会增加这种活动，这就是剧烈的社会压力通常表现。

同时，最近的研究表明慢性轻微的压力和慢性的社会压力也现出可以使大脑区的若干个神经传导物质域在细胞外的程度上产生不同的变化。

这些发现提高了某种可能性。

即除了环境，压力的剧烈程度是多巴胺经脉冲压力调节的另一个重要决定因素。

我们接着研究VTA 多巴胺神经元阶段性脉冲是否可以将复原型小鼠转变为易感性小鼠。

运用我们的标准重复（十天）社会失败模型，基于已知与正常蔗糖偏爱、以及其他行为上或生物化学的节点高度对应正常的社会交往得分我们可以辨别保持复原型的小鼠群。

根据在那些可以阻碍由压力诱发增长的应激性的神经元的特殊适应性，我们之前的工作已经表明复原型小鼠VTA多巴胺神经元表现出正常的脉冲频率以及图样。

为了测试VTA多巴胺神经元的增长性的阶段性脉冲对复原型小鼠的效果，我们转向使用（HSV）-ChR2和已知免疫组织化学和功能验证的控制载体（补充图5a-d）。

相比于需要10到14天表达最大化的AAV载体，HSV载体具有表达转基因快的优势。

在这个实验中，野生型小鼠被暴露于标准重复的社会失败压力下，接着在第十一天用社会接触测试去识别出上述小鼠中的复原性小鼠。

复原型小鼠被注射了HSV-eYFP或HSV-CHR2-eYFP，然后在它们经历光感基因阶段性刺激的阶段被第二个社会接触实验分析（补充图5e,f）。

虽然受光感基因且被注射HSV-eYFP的小鼠仍然是复原型的，但是被注射HSV-ChR2-eYFP的小鼠的VTA的光感刺激的阶段性脉冲立即把它们的行为表现型从复原型转变成了易感型，因为在互动区域的时间有所下降（图2c和补充图5g-i）。

此外，相比于HSV-EYFP注射的小鼠的腹侧被盖区引起快感缺乏特质就证明了这种位相放电减少蔗糖的偏好。

图2：

在社会交互测试中，VTA多巴胺神经的相位刺激即刻在两个社会失败范例中包括一个易感的显型。

a,在控制，主调，相位组中的社会交互数据（F2,2254.00,P,0.05;posthoctest,*P,0.05;n57–11）.蓝光刺激被用在测试中（a与c中的蓝色水平条）b,在社会交互测试之后超过12-h测量蔗糖倾向（F2,2553.47,P,0.05;posthoctest,*P,0.05;n58–

11）。

c,社会交互数据在第17天进行测试（t1552.72,*P,0.05;two-tailedt-test,n511–18）.

d,在社会交互测试之后超过12-h测量蔗糖倾向（t1752.34,*P,0.05;two-tailedt-test,n56–12）.e,样品追溯显示在一些小鼠的VTA多巴胺神经的体外自发活动，这些小鼠是在阈下的社会失败刺激后，在社会交互测试24小中承受了主位和相位的刺激的TH-Cre小鼠（见实验时间轴的补充图5j）。

柱状图，对比of阈下的激励在VTA多巴胺神经fromeYFP控制，主位和相位刺激的小鼠（F2,5053.19,P,0.05;posthoctest,*P,0.05;n517–19）。

f,相对于有eYFP控制的小鼠，在相位刺激小鼠中，用于激发起一个单一阻止的电流大大减少（t2151.8,*P,0.05;one-tailedt-test,n512–16）.g,相对于e-YF控制和主位刺激的小鼠来说，相位刺激的小鼠的多巴胺细胞在对于递增的对流刺激的应答中来显示出更强的总体增强的细胞兴奋。

（F2,140516.13,P,0.001;posthoctest,*P,0.05**P,0.005;n55–17）.错误线,6s.e.m.

鉴于腹侧被盖区神经元的光遗传学活化后约12小时的蔗糖偏好的显著损伤，我们认为这样的刺激可能会导致在腹侧被盖区多巴胺神经元的兴奋性持久的变化。

为了研究这一假说，我们测量那些曾经历过阈下的社会失败压力并随后在社会交流测试中受体内光遗传学刺激的TH-Cre重组酶的小鼠的这些神经元细胞膜内在特性（补充图5）。

通过测试上升的自发和诱发活性在光学刺激后的8到12小时，阶段性的刺激诱导了上升的腹侧被盖

区多巴胺神经元的兴奋度相比于EYFP和由声刺激后的小鼠。

这些结果表明，阈下的失败之后急性光遗传学活化会导致持久的VTA多巴胺神经元的神经适应，这支持观察 到的蔗糖偏爱的持续下降。

腹侧被盖区多巴胺神经元覆盖整个大脑。

在VTA-NAC通路在奖励机制的作用是众所周知的，但它也被联系于应激反应，如具有腹侧被盖区，内侧前额叶皮质的通路。

因此，我们有兴趣研究这两个不同的腹侧被盖区投射通路在促进易感和恢复表型的作用。

我们首先研究了VTA-NAC回路通过专门标注VTA神经元投射到伏隔核，这个步骤的完成是通过注射逆行绿色荧光示踪lumafluor到NAC和测量经过重复社会失败压力（10天）的易感性和恢复性小鼠的染料阳性 VTA-NAC神经元的放电频率控制（解剖验证见补充图6a）。

我们发现，易感性的小鼠的NAC投射的VTA多巴胺神经元的脑切片呈显著更高的脉冲速率相比于恢复性小鼠的脑切片（图3a，b）， 这与我们以前的工作中的上升的阶段性脉冲活动保持一致。

接下来，我们使用光遗传学技术来选择性地刺激这个VTA-NAC通路。

要完成这一步，我们把表达了Cre（PRV-Cre）的复制缺陷型逆向复制的伪狂犬病病毒注射到NAc中，把Cre依赖性 AAV-DIO-ChR2–eYFP注射到野生型小鼠的VTA中（补充图

6c）。

免疫组化和生物电的验证确认了使用PRV-Cre重组酶表达功能的ChR2在腹侧被盖区细胞投射到伏隔核的可行性（补充图6d-h）。

然后，小鼠进行阈下的社会失败压力测试，

24小时后在社会相互作用试验期间进行光基因刺激（补充6i）。

光学诱导的而不是声音诱导的阶段性脉冲在VTA-NAc神经元导致了易感性表现型，具体表现为上升的社会侵略性和下降的蔗糖偏好（图3c,d和补充6j,k）。

尽管多巴胺神经元在这个途径中的绝大多数是被光学刺激的，但是只有少数非多巴胺神经元被我们的方法标记了。

进一步的工作将需要研究这些非多巴胺细胞对应激反应的任何潜在影响。

为了调查抑制VTA-NAC通路对应激反应的表达的影响，我们注射AAV-DIO-halorhodopsin（NpHR）-EGFP（NpHR的3.0版本）入VTA,接着PRV-Cre注射入NAC（补充图7a,b）。

功能验证证实，黄光（563nm）可靠地抑制腹侧被盖区神经元放电

在体外和体内（补充图7c，d）和，重要的是，我们并没有观察到这些神经元的任何在行为实验中使用模拟光而引起的NpHR激活的反弹效果（补充图7e）。

此外，解剖量化表明腹侧被盖区细胞投射到伏隔核表现显著的NpHR表达（补充图7f,g）。

首先，小鼠被置于标准的重复社会失败压力模型，随后在第11天做一个社会互动测试，以确定易感性老鼠的eYFP控制和NpHR组（补充图7h）。

受光感基因技术刺激的且被注射DIO-eYFP的小鼠仍然是易感性的在第二次社会互动测试（两次测试都是在目标存在于缺失情况下进行），然而被DIO-NpHR-eYFP注射的小鼠的VTA-NAc投射的抑制效果立即导致了恢复型的表现型，表现为在互动区域花费的时间的上升和对蔗糖偏好的上升（图3e和补充图7i,j）。

这些小鼠经历了一个长期的社会失败压力模型和早期社会交往测试。

因此，可能易感性小鼠的上升的VTA-NAc通路的活性光基因衰减，和先前社会互动测试的记忆的再活化导致了那些被注射NpHR小鼠花更多时间在互动区域在第二次社会互动测试，这些都是在目标小鼠出现或缺失时测试的。

图3 ：

调节与社会失败的易感性相关VTA-NAc通路后引发的双向作用。

a, 来自

VTA片中的VTA–NAc神经的样品追踪数据。

b,来自控制组，复原组与易感组的小鼠的VTA-NAc神经的燃速（F2,89515.77,P,0.001;posthoctest,*P,0.001;n512–52）.c,在对于控制组、主位组、相位组光学刺激中得到的社会交互实验数据（F2,2054.43,P,0.05;posthoctest,*P,0.05;n55–10）.在测试中用到了蓝光刺激（蓝光水平条）.d,在社会交互测试之后超过12-h测量蔗糖倾向（F2,1854.80,P,0.05;posthoctest,*P,0.05;n55–9）.e,对于原先易感小鼠的VTA-NAc神经的光学介入社会交互（Notarget:

t1554.2,*P,0.001;two-tailedt-test,n58–9;Target:

t1552.6,*P,0.05;two-tailedt-test,n58–9）.测试中用到了黄光刺激

（黄色水平条）.f,在社会交互测试之后超过12-h测量蔗糖倾向（t1452.3,*P,0.05;two-tailedt-test,n58–9）.错误线,6s.e.m.

我们还进行了实验去研究内侧前额叶皮质投射腹侧被盖区多巴胺神经元在促进易感表型的功能的重要性（图4）。

我们首先注射逆向红色荧光示踪lumafluor到内侧前额叶皮质来标记投射到内侧前额叶皮质的腹侧被盖区神经元（补充图8a，b）。

出人意料的是，在经过重复社会失败压力实验（10天）后， 相比于控制组和恢复型小鼠的脑切片，小鼠脑切片中的VTA-内侧前额叶皮质神经元的脉冲率急剧下降（图4a，b）。

这一结果与一份论述在这一区域体外多巴胺活跃度下降的报告保持一致。

接下来，我们用光感基因技术去选择性的刺激VTA-mPFC通路。

为了达成这一目的，我们注射把PRV-Cre病毒载体注射到

mPFC中，把Cre依赖型AAV-DIO-ChR2-eYFP和注射到野生型小鼠的VTA中（补充图

8c），确认使用PRV-Cre去表达功能ChR2在VTA细胞投射到内侧前额叶皮质的正确性

（补充图8d-h）。

在那些先前经历过阈下的社会失败压力的小鼠接受社会互动测试时，相比于声音刺激和控制病毒载体，这些VTA-内侧前额叶皮质神经元的光诱导阶段性脉冲对社会交往和蔗糖偏好没有效果（图4c,d和补充图8i,j）。

接下来，我们研究抑制VTA-mPFC 通路对注射DIO-NpHR-eYFP到VTA并注射PRV-Cre到内侧前额叶皮质的压力反应的效果（补充图9a-d）。

在社会互动测试那些之前经历过阈下的社会失败压力的小鼠时，通过激活NpHR的VTA-mPFC通路的活化光学抑制导致了易感性的表现型（图4e和补充图9e,f）。

有趣的是，这里没有蔗糖偏好的区别

（图4f）。

我们的研究在VTA多巴胺神NAc投射阶段性神经脉冲为易感性编码信号的样例中，为VTA多巴胺神经脉冲与抑郁模型敏感性建立起了直接联系。

这项研究与已被提出的VTA-NAc 多巴胺神经元阶段性脉冲的在这一模型中作用相一致：

我们之前的研究表明VTA-NAc路径是对于易感性与复原性来说是决定性因素，并且在阶段性脉冲在生理病理学角度的提升是选择性地在易感性小鼠中产生。

观察发现VTA多巴胺神经元阶段脉冲在编码

社会失败后的抑郁性情绪以及条件性位置偏爱方面都有一个功能性的作用，这表明这些神经的脉冲图样以及紧随而后的对于抑郁或者奖励模型编码之间是高度相关的。

这种对于压力与奖励之间相拮抗的编码却是更为复杂的，因为它不仅仅是选择性的脉冲图样，同时也是依赖于压力的剧烈程度的，同时还显示出清晰的投射路路径敏感性。

图4：

调节对社会失败易感的VTA–mPFC通路的作用。

a,在VTA片中VTA–mPFC神经的样品追踪。

b, 来自控制组，复原组，易感组小鼠的VTA–mPFC神经的燃度（F2,.38515.07,P50.0005;posthoctest,*P,0.005;n511–15）.c,在光学刺激下获得的来自控制组，主位组，相位组小鼠VTA–mPFC神经社会交互数（F2,3951.29,P50.29;

n511–17）。

d,在社会交互测试之后超过12-h测量蔗糖倾向（F2,3350.19,P50.82;n510–16）.e,在VTA–mPFC神经光学介入中获得的社会交互数据（t2952.5,*P,0.05;two-tailedt-test,n512–19）.f,在社会交互测试之后超过12-h测量蔗糖倾向（t2950.38,P.0.05,n512–

19）.错误线,6s.e.m.

并且，在调解快速抗抑郁效果方面，我们所观察到的回应光刺激时，敏感性表现型的快速作用，相符于已被推论的中脑缘多巴胺神经元功能。

类似地，过度激活阳离子通道，作为在VTA-NAc神经的VTA多巴胺神经元中高强度脉冲到阶段性脉冲的过渡的一个关键性通道，在易感性小鼠中被增加；而抑制因子显示出快速而持久的类似抗抑郁的功效。

更进一步来说，克他命的快速抗抑郁效果，睡眠的匮乏以及深层大脑刺激支持着快速可逆大脑机制的存在，并且支持着调节神经回路来治疗抑郁想法。

与这些研究相一致地，当抑郁产生于重复剧烈的社会压力下是，我们的研究展示了一种VTA-NAc路径抑制的快速的

“救援”效应。

与之显出鲜明对比的是，我们的发现VTA-mPFC路径与VTA-NAc路径有着不同的功能。

这与近期的一个研究类似，这一实验具有显著差别的VTA多巴胺神经元群应对奖励性和厌恶性刺激时所展示的不同的角色。

再者，我们观察到是VTA-NAc路径而非VTA-mPFC路径的调整诱发了类似于快感缺乏的影响，这表明是VTA-NAc路径而非VTA-mPFC路径在抑郁前提下编码与奖励相关的信息时起着功能性作用。

我们在特定投射方面的发现由此便为VTA多巴胺神经元在个体适应重复压力及抑郁性行为异变中的复杂作用提供了一种新的视角。