实验三动物性食品生物性污染的检验.ppt

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实验三、动物性食品生物性污染实验三、动物性食品生物性污染实验三、动物性食品生物性污染实验三、动物性食品生物性污染物的检验物的检验物的检验物的检验动物性食品卫生学实验动物性食品卫生学实验一一.生物性污染的来源生物性污染的来源微生物污染微生物污染（microorganism（microorganismpollutionpollution）寄生虫污染寄生虫污染（parasiticalpollution）（parasiticalpollution）昆虫污染昆虫污染（insecticalpollution）（insecticalpollution）PathogensSpoilageOrganismsVirusesBacteriumFoodborneFoodborneInfectionInfectionMicroorganismsUnpleasantsmellandtasteFungi内源性污染内源性污染外源性污染外源性污染外源性生物性污染是动物性食品微生物污染的主要途径外源性生物性污染是动物性食品微生物污染的主要途径二二.生物性污染的评价指标生物性污染的评价指标菌落总数菌落总数细菌总数细菌总数大肠菌群值大肠菌群值（MPN）致病菌检测致病菌检测（PCR法法）其他其他实验目的实验目的掌握动物性食品菌落总数、大肠菌群测定掌握动物性食品菌落总数、大肠菌群测定及常见致病菌及常见致病菌PCRPCR检测的原理、步骤和方检测的原理、步骤和方法法了解动物性食品菌落总数的卫生标准，进了解动物性食品菌落总数的卫生标准，进行卫生判定行卫生判定1.1.鲜乳的微生物学检验鲜乳的微生物学检验菌落总数的测定菌落总数的测定检验处理检验处理242h或或482h361报告报告菌落记数菌落记数每皿加入适量营养琼脂每皿加入适量营养琼脂选择选择3个适宜稀释度，吸取个适宜稀释度，吸取1ml加入灭菌平皿加入灭菌平皿作成几个倍数的稀释液作成几个倍数的稀释液注意事项注意事项无菌操作无菌操作稀释度的选择稀释度的选择平均菌落数在平均菌落数在30-30030-300之间的稀释度为之间的稀释度为宜；宜；每个稀释度作两个平皿每个稀释度作两个平皿记数要求记数要求30-30030-3003003003030300300或或30302.2.鲜乳大肠菌群值的测定鲜乳大肠菌群值的测定报告报告根据证实为大肠菌群阳性的管数，查根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPNMPN检索表，报检索表，报告每告每100mL（g）100mL（g）检样中大肠菌群的最可能数。

检样中大肠菌群的最可能数。

判定标准判定标准3.常见致病菌的快速检测常见致病菌的快速检测SE的的PCR检测检测原理原理以扩增的以扩增的DNADNA分子为模板，以一对分别与模分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNADNA聚合酶的聚合酶的作用下，按半保留复制的机制沿着模板链延伸直作用下，按半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的至完成新的DNADNA合成。

不断重复这一过程，可使合成。

不断重复这一过程，可使目的目的DNADNA片段得到扩增。

因为新合成的片段得到扩增。

因为新合成的DNADNA也可也可以作为模板，因而以作为模板，因而PCRPCR可使可使DNADNA的合成量呈指数的合成量呈指数增长。

增长。

PCRPCR的基本成分的基本成分模板模板DNADNA特异性引物特异性引物（SEF14）（SEF14）热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶dNTPdNTP二价阳离子二价阳离子缓冲液缓冲液过程过程（高温变性、低温退火、中温延伸高温变性、低温退火、中温延伸）引物设计引物设计利用引物设计软件利用引物设计软件Primer5.0Primer5.0针对针对SEF14SEF14主要结构亚单位主要结构亚单位sefAsefA的基因序列设计引的基因序列设计引物物:

上游引物上游引物UsefAUsefA为为5-5-ATGCGTAAATCAGCATCTGATGCGTAAATCAGCATCTG-3-3；下游引物；下游引物LsefALsefA为为5-5-TTAGTTTTGATACTGCTGAACTTAGTTTTGATACTGCTGAAC-3-3样品处理（模板制备）样品处理（模板制备）以以12000rpm12000rpm离心离心5min,5min,上清液即含基因组上清液即含基因组DNADNA待检肉样乳待检肉样乳1g/mL1g/mL以以9mL9mL增菌液混合研增菌液混合研碎，制成食品匀浆液碎，制成食品匀浆液3737振荡培养振荡培养33小小时时取样液取样液1mL1mL以以2000rpm2000rpm离心离心2min,2min,取上清取上清液液以以8000rpm8000rpm离心离心5min,5min,沉淀以沉淀以50uL50uL悬浮悬浮沸水浴沸水浴10min10min后后迅速置冰浴迅速置冰浴5min5min反应体系反应体系10Buffer2.5uLdNTP2.0MgCl22.0上游引物（20uM）1uL下游引物（20uM）1uL模板2uLTaqDNAPolymerase0.25灭菌ddH2Oupto25uL反应参数反应参数1.Initialdenature955min2.Denature9560s3.Anealing4760s4.Elongation7260sReturnto2for30cycle5.Finalelongation7210minKeep45min琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳电泳条件：

电泳条件：

argrose1%U80VT50minPCR产物产物+Loadingbuffer琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳分析结果分析结果E-mail:

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15823280210