梅毒螺旋体抗体明胶颗粒凝集试验(TPPA)及其在梅毒检测中的应用..pptx

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梅毒螺旋体抗体明胶颗粒凝集试验(TPPA)及其在梅毒检测中的应用..pptx

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梅毒螺旋体抗体明胶颗粒凝集试验（TPPA）及其在梅毒检测中的应用梅毒概况梅毒是由梅毒螺旋体引起的一种慢性、系统性性传播疾病。

人体受感染后，螺旋体很快播散到全身，几乎可侵犯全身各组织与器官，临床表现多种多样，且时显时隐，病程较长中华人民共和国传染病防治法规定要管理的性病是爱滋病、淋病和梅毒，应加以重点防治。

卫生部性病防治管理办法则规定除上述3种病以外，还有生殖器疱疹、尖锐湿疣、软下疳、非淋菌性尿道炎（NGU）、性病淋巴肉芽肿均为监测性疾病梅毒早期主要侵犯皮肤及粘膜，晚期除侵犯皮肤、粘膜外，还可侵犯心脏血管系统及中枢神经系统；另一方面，梅毒又可多年无症状呈潜伏状态梅毒主要通过性接触传染，也可因其它方式密切接触或输入患者的血液而传染。

梅毒孕妇可通过胎盘使胎儿在宫内受感染或出生时接触母亲有病损的产道受染梅毒和一些其他性病均与艾滋病密切相关，从社会学角度来看，凡人群中梅毒发病率高，意味着人群中性乱现象严重，提供了艾滋病流行的条件；从医学角度来说，患有梅毒的人，因有局部溃疡，可明显增加带有CD4受体信息的目标细胞，故对HIV感染的易感性增加2-10倍。

同样，HIV感染者伴有梅毒，其生殖道排出的HIV的量要比仅有HIV感染者排出的量大得多在HIV感染者中，梅毒血清学反应有时会出现难于解释的现象，因此对于临床怀疑梅毒感染而血清学试验又表现为阴性者，建议考虑HIV检查梅毒与HIV感染暗视野显微镜检查法：

是目前国内主要的梅毒病原学诊断方法。

适用于对一期梅毒及二期梅毒早期的检测。

取材部位以硬下疳为主，亦可从宫颈、阴道、淋巴结等处取材。

阳性可确诊，阴性不能排除梅毒诊断镀银染色法：

与暗视野检查法的临床意义基本相同。

利用梅毒螺旋体具有亲银性，可被银溶液染成棕黑色，再通过普通高倍显微镜进行观察直接免疫荧光法（DFA）：

是目前国外采用较多的方法，其特异性及敏感性均优于暗视野检查法。

将特异性的抗梅毒螺旋体单克隆抗体用荧光素标记，如标本中存在梅毒螺旋体，则通过抗原抗体特异性结合，在荧光显微镜下可见到发苹果绿色的梅毒螺旋体梅毒的病原学检测人类对梅毒无先天免疫性，尚无疫苗接种进行人工免疫，仅能在受感染后产生感染性免疫。

已完全治愈的早期梅毒患者仍可以再感染感染梅毒后，首先产生IgM型抗梅毒螺旋体抗体，感染2周后即可测出，早期梅毒抗梅治疗39个月后或晚期梅毒治疗2年后，大部分病人IgM可转阴性，再感染时又出现阳性，故IgM型抗体的存在是活动性梅毒的表现感染梅毒四周左右产生IgG型抗梅毒螺旋体抗体，即使经足量抗梅治疗，梅毒螺旋体抗原消失后很长时间，IgG抗体仍可通过记忆细胞的作用继续产生，甚至终生在血清中可测出梅毒的免疫性

（一）梅毒的免疫性

（二）另一种具有抗体性质的物质叫反应素（reagin），是梅毒螺旋体破坏人体组织过程中释放出的一种抗原性心磷脂刺激机体所产生的抗体。

反应素一般在感染后57周（或下疳出现后23周）产生。

经正规治疗后可逐渐消失胎儿在宫内感染梅毒螺旋体后，胚胎晚期（69个月）已能合成IgM型抗体，出生后第3个月开始形成IgG型抗体；IgM抗体不能通过胎盘，而IgG抗体能通过胎盘，如患儿血清中检侧出19S-IgM抗梅毒螺旋体抗体是诊断先天梅毒的有力证据非梅毒螺旋体抗原血清试验：

是以心磷脂、卵磷脂及胆固醇作为抗原检查血清中的反应素，用于初筛试验及疗效观察。

可以分为以下四种试验，原理基本相同：

1、性病研究实验室玻片试验（VDRL）：

由于试剂需现配现用，故而国内实验室很少采用。

但VDRL是唯一可用于神经性梅毒诊断的血清学方法2、快速血浆反应素环状卡片试验（RPR）：

在特制的纸片上进行，加入一定量特制的炭粉，可使抗原抗体出现凝集，用肉眼可观察结果。

3、甲苯胺红试验（TRUST）：

在试剂中加入甲苯胺红代替炭粉颗粒，使结果更易于观察。

4、不加热血清反应素试验（USR）梅毒的血清学试验

（一）非梅毒螺旋体抗原血清试验的缺陷：

1、特异性：

由于在多种疾病，如急性病毒性感染、自身免疫性疾病、结缔组织病、静脉吸毒者以及怀孕妇女中均可出现反应素，所以此类试验有时会出现假阳性反应2、敏感性：

非梅毒螺旋体抗原血清试验有时出现弱阳性或阴性结果，而临床上又像二期梅毒，此时应将此血清稀释后做定量试验，如出现阳性结果，则为抗体过量引起的前带现象。

12二期梅毒病人可出现此现象而发生梅毒血清假阴性反应。

此外，由于感染梅毒后反应素的出现晚于特异性梅毒螺旋体抗体，晚期梅毒反应素又可能转阴，因此这类试验不适于一、三期梅毒，对隐性梅毒和神经梅毒也不敏感。

因此此类试验做梅毒初筛时，存在一定数量的漏检非梅毒螺旋体抗原血清试验的优点：

1、非梅毒螺旋体抗原血清试验表现为滴度随疗程逐渐下降，故可以作为疗效观察的指标2、此类方法价格低廉梅毒的血清学试验

（二）梅毒螺旋体抗原血清试验：

用梅毒螺旋体作为抗原检测血清中的抗螺旋体IgM和/或IgG抗体，其敏感性和特异性均较高。

常用的有以下五种方法：

1、荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）2、梅毒螺旋体血球凝集试验（TPHA）3、梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA）4、梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验（TP-ELISA）5、梅毒螺旋体快速诊断试验（TP-RT）梅毒的血清学试验（三）荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）FTA-ABS是所有螺旋体试验中最敏感的方法，特异性也很高，被认为是检测梅毒的“金标准”但是，该方法在技术操作上也是最困难的，试验的操作以及结果的判读都必须加以核实。

试验可靠性的关键是标准化的结果判断、高质量的荧光标记抗体以及适当的稀释度。

由于实验室操作繁琐以及主观判读经常产生错误结果，因此增加标记荧光标记染料的复染可以减低标准化过程中的错误并增加其可读性及重复性实验需有优质的荧光显微镜和技术熟练的操作人员才能得到准确的结果，故常不被临床实验室作为首选方法梅毒的血清学试验（四）梅毒螺旋体血球凝集试验（TPHA）原理：

用超声裂解的梅毒螺旋体为抗原，致敏经醛化、鞣化的羊或禽类红细胞，此致敏红细胞与人血清或血浆中的梅毒螺旋体抗体结合，产生肉眼可观察的凝集反应优点：

该方法比FTA-ABS易操作且稳定性好，它的敏感性除早期梅毒外与FTA-ABS相似，对大样本进行批量检测时，TPHA也比FTA-ABS易操作，是国内实验室常用的梅毒螺旋体确证试验方法不足：

由于红细胞具有生物活性，可能产生非特异性凝集，且保存时间较短，批间差较大,故实际使用中也存在一些问题。

目前国内使用的商品化TPHA试剂盒均未通过国家的批批检梅毒的血清学试验（五）梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA）原理：

TPPA的原理与TPHA基本相同，它以人工合成的惰性明胶颗粒代替TPHA试验的红细胞作为载体，是TPHA的升级产品优点：

1、试剂稳定，批间差小2、结果判读更为清晰明确3、敏感性和特异性较TPHA进一步提高4、通过了国家的批批检不足：

结果判定主观，较难实现自动化梅毒的血清学试验（六）梅毒螺旋体酶联免疫试验（TP-ELISA）原理：

以梅毒螺旋体抗原包被聚丙乙烯板，再加入待检血清以及酶标抗原，形成双抗原夹心，同时检测IgG、IgM抗体。

少数试剂采用间接法，检测IgG优点：

1、敏感性和特异性较高2、价格较低，适合于对大量样品的筛查3、可实现操作的自动化、客观化不足：

各家ELISA试剂盒采用的抗原和工艺不同，使测定的敏感性和特异性产生较大的差异，临床实验室在选用ELISA试剂前应认真进行评估梅毒的血清学试验（七）梅毒螺旋体快速诊断试验（TP-RT）原理：

双抗原夹心免疫层析试验或间接法免疫渗滤试验，多采用胶体金进行标记，同时检测IgG、IgM抗体（双抗原夹心法）或单测IgG抗体（间接法）优点：

1、简便、快速，不需要特殊的仪器2、适合于单人份操作，可用于较紧急的场合不足：

1、临床评估资料不多，敏感性、特异性尚有待进一步考查2、无法实现自动化，结果判断主观3、测定结果受温度和时间的影响较大4、未通过国家的批批检5、价格较高梅毒的血清学试验（八）关于梅毒血清学试验程序的探讨

（一）先以非梅毒螺旋体抗原血清试验（RPR、TRUST等）进行初筛，再以梅毒螺旋体抗原血清试验（TPPA、TPHA、ELISA等）进行确认优点：

非梅毒螺旋体抗原血清试验价格低廉，使梅毒检测的成本可以保持在低水平缺点：

非梅毒螺旋体抗原血清试验的敏感性较差，导致临床上易出现漏检的情况同时进行梅毒螺旋体抗原血清试验和非梅毒螺旋体抗原血清试验优点：

这是从技术上而言的最佳方案缺点：

人力和试剂成本较高先进行梅毒螺旋体抗原血清试验，阳性时再进行非梅毒螺旋体抗原血清试验关于梅毒血清学试验程序的探讨

（二）梅毒螺旋体抗原血清试验（TPPA等）（-）阴性报告（+）非梅毒螺旋体抗原血清试验（RPR等）（+）现症梅毒抗梅治疗，疗效观察（-）询问梅毒既往感染和治疗史（有）（无）既往感染随访或抗梅治疗关于梅毒血清学试验程序的探讨（三）一些适合使用梅毒螺旋体抗原血清试验（TPPA等）进行筛查的情况：

皮肤、性病门诊输血前检查手术前检查入院检查产前检查检验检疫赛乐迪亚（Serodia）TPPA梅毒螺旋体抗体明胶颗粒凝集试验明胶凝集试验（PA）与ELISA的原理比较PAELISA显色明胶凝集试验（PA）与ELISA操作步骤的比较ELISAPA加入样品和稀释液第一步反应洗涤洗涤第二步：

酶反应显色第三步：

加入底物结果判读孵育凝集图像反应温度对ELISA及PA的影响102030反应温度（）PAELISA反应速率样品对ELISA及PA检测结果的影响样品类型PAELISA血清OO血浆OO脂血O黄疸O溶血OX：

与底物有关加热灭活OX：

假阳性O：

无影响：

部分有影响X：

有影响明胶颗粒的制备明胶阿拉伯胶醋酸染料/色素偏磷酸乙醇水3.0m表面电荷-0.760-0.830明胶颗粒（电镜照片）明胶颗粒的致敏5%明胶颗粒/0.15MPBS（pH7.2）5ppm丹宁酸/0.15MPBS（pH7.2）孵育（37，15min）生理盐水洗涤（2000rpm，5min）活化的明胶颗粒/0.15MPBS（pH59）抗原孵育（37，60min）生理盐水洗涤（2000rpm，5min）5%致敏明胶颗粒/悬浮液*冷冻干燥*0.15MPBS（加入正常兔血清、明胶、阿拉伯胶等）SerodiaTPPA的操作步骤5、混匀，加盖，孵育2个小时6、结果判读1、加入样品稀释液100l25l25l25l43孔号122、加入测试样品25l孔号43212孔号1最终稀释倍数341:

401:

80致敏颗粒25l25l4、加入明胶颗粒未致敏颗粒3、样品的倍比稀释25l25l孔号1最终稀释倍数341:

201:

40225l25l弃去TPPA操作中的注意事项不要将生产批号不同的试剂混合在一起使用试剂应2-8保存，不可冻结试剂试剂在使用前应事先从冰箱中取出,平衡至室温后再进行操作试验应在FASTEC硬质微量反应U型板中进行,该板洗涤后可重复使用,但重复使用次数不宜超过三次最好将反应板放置在一块白色湿布上进行加样、稀释过程，以防止静电可能带来的影响致敏粒子和未致敏粒子在滴加前应充分摇匀。

加样、稀释完毕后应轻轻拍打反应板边缘以进行混匀，注意勿使液体溅入邻近的孔中，不要使用旋涡混匀器反应应在室温下静置2小时以上，不要使用水浴箱或恒温箱，结果观察完毕前不要振摇反应板SerodiaTPPA的结果判读（定性试验）SerodiaTPPA的结果判读（定量试验）反应温度的影响抗体效价512152530371：

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80样品3样品2样品1样品11【】反应时间的影响012可判定的凝集图像4724【小时】抗体效价1：

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80样品1样品2样品3样品11抗凝剂的影响样品血清血浆柠檬酸EDTA肝素11：

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640血清灭活的影响样品灭活前灭活后11：

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640生物活性物质的影响添加物质和添加浓度样品1样品2样品3样品12样品13样品14结合胆红素（mg/dl）未加1：

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80未结合胆红素（mg/dl）未加1：

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80血红蛋白（mg/dl）未加1：

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80乳糜微粒（浊度）未加1：

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80试剂复溶后的稳定性抗体效价03810151:

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80样品3样品2样品1E1:

320复溶后天数批间重复性试验样品第1批第2批第3批最大频数变动范围11：

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1600孔21：

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6400孔31：

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3200孔101：

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1280+1孔（E）1：

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3200孔TPPA与TPHA的比较

（一）用TPPA和TPHA分别检测梅毒螺旋体感染家兔后产生的抗体感染TPPATPHATPPA用TPPA和TPHA分别检测梅毒螺旋体感染家兔后产生的IgG抗体感染TPHATPPA与TPHA的比较

（二）TPPA与TPHA的比较（三）用TPPA和TPHA分别检测梅毒螺旋体感染家兔后产生的IgM抗体感染TPPATPHAVeguchi.M.、.J.Jpn.A.I.D.68，1994TPPA、TPHA和RPR检测新感染的梅毒患者经抗梅治疗后的抗体转化情况PA，HA1：

1601.2MU/天，青霉素GRPR1：

161：

801：

8CUTOFF1：

401：

41：

2天（-）（+）（-）FTA-IgM（-）（-）（-）（+）FTA-IgG（+）TPPA与TPHA的比较（四）TPPA与TPHA的比较（五）样品号FTA-ABS阴性阴性阴性未测阴性阴性未测阴性阴性阴性阴性阴性1:

808016032064012802560用TPPA检测12份TPHA的非特异性血清（抗兔睾丸抗体），并与FTA-ABS的结果进行比较TPPA与TPHA对89例可疑梅毒患者血清检测结果的比较TPHATPPA11120020073两种方法的总符合率为94.4TPPA与TPHA的比较（六）TPPA与TPHA的比较（七）No.TPHATPPAFTA-ABS临床诊断IgGIgM31:

801:

80晚期隐性梅毒101:

801:

80早期梅毒（治疗后）111:

80（1:

80）晚期隐性梅毒15（1:

80）1:

80晚期隐性梅毒16（1:

80）1:

80早期梅毒（治疗后）上述TPPA与TPHA结果不符合的5例样品与FTA-ABS测定结果的比较TPHATPPA2010102020030两种方法的总符合率为99.8TPPA与TPHA对2045例健康献血员、孕妇及类风湿患者血清检测检测结果比较TPPA与TPHA的比较（八）No.TPHATPPAFTA-ABS148726169109236上述TPPA与TPHA结果不符合的5例样品与FTA-ABS测定结果的比较TPPA与TPHA的比较（九）分组nTRUST（+）阳性率TPPA（+）阳性率正常对照组5000一期梅毒3836（95%）38（100%）二期梅毒109（90%）10（100%）三期梅毒22（100%）2（100%）隐性梅毒1312（92%）13（100%）合计阳性率59（93.7%）63（100%）TPPA与TRUST的比较

（一）TPPA与TRUST对63例梅毒患者及50例健康人血清检测结果的比较TPPA与TRUST的比较

（二）TPPA与TRUST对80例梅毒患者检测结果的比较TPPA滴度1:

801:

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6401:

1280合计TRUST（）8325669TRUST（）51511合计13336180分组nELISA（+）阳性率TPPA（+）阳性率正常对照组5000一期梅毒3838（100%）38（100%）二期梅毒1010（100%）10（100%）三期梅毒22（100%）2（100%）隐性梅毒1313（100%）13（100%）合计阳性率63（100%）63（100%）TPPA与ELISA的比较

（一）TPPA与ELISA对63例梅毒患者及50例健康人血清检测结果的比较分组nELISA（+）阳性率TPPA（+）阳性率正常对照组6700一期梅毒4947（95.9%）49（100%）二期梅毒3737（100%）37（100%）三期梅毒1614（87.5%）16（100%）隐性梅毒2423（95.8%）24（100%）合计阳性率121（96.0%）126（100%）TPPA与ELISA的比较

（二）TPPA与ELISA对126例梅毒患者及67例健康人血清检测结果的比较TPPA与ELISA的比较（三）TPPA与ELISA对30例梅毒患者及60例健康人血清检测结果的比较分组nELISA（+）阳性率TPPA（+）阳性率正常对照组604（6.7%）0（0.0%）梅毒患者血清3029（96.7%）30（100.0%）TPPA的敏感性、特异性均为100%；ELISA的敏感性为96.7%,特异性为93.3%谢谢！

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