人禽流行性感冒实验室检测.ppt

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人及禽流行性感冒实验室检测人及禽流行性感冒实验室检测泉州市卫生防疫站郑友限泉州市卫生防疫站郑友限点点点点题题题题20032003年月日，我国发现首例禽流感。

年月日，我国发现首例禽流感。

天以后，即月日，一个包括禽流感病天以后，即月日，一个包括禽流感病毒检测方法、检疫和防治规范的项系列国家毒检测方法、检疫和防治规范的项系列国家标准就发布实施了。

标准就发布实施了。

这是一个奇迹！

这个奇迹的出现有赖于国家标这是一个奇迹！

这个奇迹的出现有赖于国家标准化主管部门紧急启动了国家标准快速制定程准化主管部门紧急启动了国家标准快速制定程序，更有赖于我国的质检、农业部门长期以来序，更有赖于我国的质检、农业部门长期以来对禽流感病毒检验检疫和疫情防治的深入研究对禽流感病毒检验检疫和疫情防治的深入研究.检测方法检测方法核酸检测方法核酸检测方法病原学检测方法病原学检测方法血清学检测方法血清学检测方法核酸检测方法核酸检测方法荧光荧光RT-PCRRT-PCRNASBANASBART-PCRRT-PCRRT-PCRRT-PCR为一种很有用的技术，它能测出为一种很有用的技术，它能测出非常低水平的流感病毒基因组。

不管病非常低水平的流感病毒基因组。

不管病毒是活还是死的均可进行测定，因此毒是活还是死的均可进行测定，因此RT-RT-PCRPCR技术，无论在流感诊断，还是监测技术，无论在流感诊断，还是监测和研究中均得到广泛应用。

如和研究中均得到广泛应用。

如19971997年我年我国香港特区从患者中分离到国香港特区从患者中分离到H5N1H5N1毒株毒株，为证实分离的可靠性就曾用该法对储，为证实分离的可靠性就曾用该法对储存在冰箱中标本进行测定。

存在冰箱中标本进行测定。

要想使要想使RT-PCRRT-PCR具有敏感性和特异性，具有敏感性和特异性，引物序列的选择最为重要，其次要设试引物序列的选择最为重要，其次要设试验对照，严防实验室交叉污染。

验对照，严防实验室交叉污染。

PCRPCR发展的历史发展的历史19851985年，年，PE-CetusPE-Cetus公司公司KarryMullisKarryMullis博士博士发明。

发明。

19861986年，年，PEPE推出全世界第一台推出全世界第一台PCRPCR扩增扩增仪仪TC1TC1。

19931993年，年，NobelNobel奖授于奖授于PCRPCR发明者发明者KarryKarryMullisMullis博士。

博士。

DNADNA双螺旋结构双螺旋结构DNADNA复制过程复制过程denaturation（heat,highpH）renaturation（cool,neutralpH）5335DNADNA变性与复性变性与复性DenaturationandRenaturationDenaturationandRenaturationPCRPCR反应过程：

反应过程：

3Steps3Steps1.1.DenatureDenature:

94C-96C:

94C-96Cseparatedoublehelixtemplateintotwosinglesseparatedoublehelixtemplateintotwosinglestrandstrands2.2.AnnealAnneal:

37C-65C37C-65Cprimersbindtospecificinitiationsitesonprimersbindtospecificinitiationsitesonsingle-strandedDNAsingle-strandedDNA3.3.ExtendExtend:

72C72CDNApolymeraseusesdNTPstoadddNMPDNApolymeraseusesdNTPstoadddNMPunitstothegrowingstrands,accordingtothebunitstothegrowingstrands,accordingtothebasepairingrule;polymerizationasepairingrule;polymerizationPolymeraseChainReactionPolymeraseChainReactionPolymeraseChainReactionPolymeraseChainReaction（cont.）（cont.）RT-RT-PCRPCRPCRPCR（retrotranscriptionPretrotranscriptionPretrotranscriptionPretrotranscriptionPCRCRCRCR）的原理）的原理）的原理）的原理这种方法指的是以这种方法指的是以RNARNA为模板，经逆转录为模板，经逆转录获得与获得与RNARNA互补的互补的DNADNA链即链即cDNAcDNA，然后，然后以以cDNAcDNA链为模板进行的链为模板进行的PCRPCR反应。

反应。

RNARNA扩增包括两个步骤：

在单引物的介导下和逆扩增包括两个步骤：

在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成转录酶的催化下，合成RNARNA的互补链的互补链cDNAcDNA；加热后加热后cDNAcDNA与与RNARNA链解离，然后与另一引物退链解离，然后与另一引物退火，并由火，并由DNADNA聚合酶催化引物延伸生成双链靶聚合酶催化引物延伸生成双链靶DDNANA，最后扩增靶，最后扩增靶DNADNA实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理PCRPCR技术是一种技术是一种DNADNA扩增技术。

它通过温扩增技术。

它通过温度的变化使得双链度的变化使得双链DNADNA解链、退火、延解链、退火、延伸。

通过多次这样的循环，模板伸。

通过多次这样的循环，模板DNADNA就就可以按几何级数速度扩增。

可以按几何级数速度扩增。

所谓实时荧光定量所谓实时荧光定量PCRPCR技术，是指在技术，是指在PCRPCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个号积累实时监测整个PCRPCR进程，最后通进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

方法。

荧光荧光信号信号荧光荧光信号信号荧光染料直接结合扩增产物SYBRgreenI特异性结合双链，释放荧光信号荧光标记引物特异性荧光探针Taqman双荧光标记探针molecularBeacon荧光标记探针荧光标记杂交双探针荧光染料荧光染料光能光能热能热能转移给临近的分子转移给临近的分子光基通常各自有一的光吸收峰。

在光的刺激下，荧团拥单荧光基吸收光的能量后通常以三方式放出能量：

团种释1）光能多光基吸收光能后仍以光能形式放能量，许荧团旧释且射光的峰大于吸收峰。

并发值2）能热某些光基吸收光能后，能量量散到荧团转换为热扩环境中，如Dabcyl。

3）移近的分子转给临近的分子足生能量移的要求当临满发转，能量光基到近的分子。

时从荧团传递临荧光标记信号的产生荧光标记基团在某波长的激发光刺荧光标记基团在某波长的激发光刺荧光标记基团在某波长的激发光刺荧光标记基团在某波长的激发光刺激下，激下，激下，激下，产生一个更长波长的发射光产生一个更长波长的发射光产生一个更长波长的发射光产生一个更长波长的发射光TaqmanTaqman荧光定量荧光定量PCRPCR技术技术特异性荧光标记探针Taq酶53外切酶活性TaqManTaqMan荧光探针工作原理荧光探针工作原理PCRPCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

探标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；吸收；PCRPCR扩增时，扩增时，TaqTaq酶的酶的5533外切酶活外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条，即每扩增一条DNADNA链，就有一个荧光分子形成链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与，实现了荧光信号的累积与PCRPCR产物形成完全同产物形成完全同步。

如图所示。

步。

如图所示。

SYBRGreen1荧光染料化学DNATargetSequenceDenaturation荧光标记杂交双探针荧光标记杂交双探针变性变性变性变性退火退火退火退火延伸延伸延伸延伸结束结束结束结束MolecularbeaconMolecularbeacon？

MolecularbeaconMolecularbeacon？

2423ABIPRISMABIPRISM70007000荧光定量荧光定量PCRPCR仪仪7000型荧光定量型荧光定量PCR仪获仪获2002年世界科学年世界科学家杂志“最佳仪器奖家杂志“最佳仪器奖”2002年年12月月9日发表日发表CtCt值的定义值的定义在荧光定量在荧光定量PCRPCR技术中，有一个很重要的技术中，有一个很重要的概念概念CtCt值。

值。

CC代表代表CycleCycle，tt代表代表ththresholdreshold，CtCt值的含义是：

每个反应管内的值的含义是：

每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

数。

图1.Ct值的确定反应进行一个循环，在合成了条新反应进行一个循环，在合成了条新链的同时，就水解了条探针，并释放出了链的同时，就水解了条探针，并释放出了相应数量的荧光基团。

仪器所接收到荧光信相应数量的荧光基团。

仪器所接收到荧光信号的强度与反应产物的量呈对应关系。

号的强度与反应产物的量呈对应关系。

如果以每一个循环结束时所测得的荧如果以每一个循环结束时所测得的荧光值为纵坐标，以循环数为横坐标作光值为纵坐标，以循环数为横坐标作图，即可得到一条连接每一个循环后荧光值图，即可得到一条连接每一个循环后荧光值的扩增曲线。

当检测标本中含有所要检测病的扩增曲线。

当检测标本中含有所要检测病原体的核酸序列时，所得到的曲线呈原体的核酸序列时，所得到的曲线呈“”型；而当标本中不含病原体，则过程型；而当标本中不含病原体，则过程不发生，探针不被水解，不产生荧光信号，不发生，探针不被水解，不产生荧光信号，其扩增曲线为一水平线。

也就是说，扩增曲其扩增曲线为一水平线。

也就是说，扩增曲线为线为“”型时，就检出了禽流感病毒；当型时，就检出了禽流感病毒；当扩增曲线为水平线时，就没有禽流感病毒检扩增曲线为水平线时，就没有禽流感病毒检出。

出。

荧光域值（荧光域值（thresholdthreshold）的设定）的设定PCRPCR反应的前反应的前1515个循环的荧光信号作为荧个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-153-15个循环的荧光信号的标准偏差的个循环的荧光信号的标准偏差的1010倍，即倍，即：

threshold=10SDthreshold=10SDcycle6-15cycle6-15CtCt值与起始模板的关系值与起始模板的关系研究表明，每个模板的研究表明，每个模板的CtCt值与该模板的值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，贝数越多，CtCt值越小。

利用已知起始拷贝值越小。

利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代代表起始拷贝数的对数，纵坐标代CtCt值值（如图（如图22所示）。

因此，只要获得未知样所示）。

因此，只要获得未知样品的品的CtCt值，即可从标准曲线上计算出该样值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

品的起始拷贝数。

传统定量传统定量PCRPCR常用方法常用方法-内参照法内参照法：

在不同的在不同的PCRPCR反应管中加入已定量的内标反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。

上游和引物，内标用基因工程方法合成。

上游引物用荧光标记，下游引物不标记。

在模引物用荧光标记，下游引物不标记。

在模板扩增的同时，内标也被扩增。

在板扩增的同时，内标也被扩增。

在PCRPCR产产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板定量待检测模板内标在传统定量中的作用内标在传统定量中的作用由于传统定量方法都是终点检测，即由于传统定量方法都是终点检测，即PCRPCR到达平到达平台期后进行检测，而台期后进行检测，而PCRPCR经过对数期扩增到达平经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。

同一个模板在台期时，检测重现性极差。

同一个模板在9696孔孔PPCRCR仪上做仪上做9696次重复实验，所得结果有很大差异次重复实验，所得结果有很大差异，因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。

，因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。

加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。

但即使如此，传统的定量方法也都只能准确性。

但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。

算作半定量、粗略定量的方法。

相同模板在同一台PCR仪上进行96次扩增的扩增曲线图终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR无需内标无需内标实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术有效地解决了传统定量只技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品过对每个样品CtCt值的计算，根据标准曲线获得定值的计算，根据标准曲线获得定量结果。

因此，实时荧光定量量结果。

因此，实时荧光定量PCRPCR无需内标是建无需内标是建立在两个基础之上的：

立在两个基础之上的：

CtCt值的重现性值的重现性CtCt值与起始模板的线性关系值与起始模板的线性关系利用外标准曲线的实时荧光定量利用外标准曲线的实时荧光定量PCRPCR是迄是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。

病原体检测等诸多领域。

使用卡那霉素抗性基因特异引物（使用卡那霉素抗性基因特异引物（200nM）200nM）及及PlatinumPlatinumSYBRGreenqPCRSuperMix-UDGSYBRGreenqPCRSuperMix-UDG和和ROXROX参考染参考染料，对料，对1010倍系列稀释（倍系列稀释（107107到到1010个拷贝）个拷贝）pCR2.1pCR2.1质粒进行实时定量质粒进行实时定量PCRPCR。

反应在。

反应在5050孵育孵育22分钟，然分钟，然后后9595，22分钟，接着进行分钟，接着进行5050个循环，个循环，9595，1515秒；秒；6060，3030秒。

仪器使用秒。

仪器使用ABIPRISM7700ABIPRISM7700。

实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的检测特点的检测特点敏感性高、特异性强：

用禽流感病毒的探针、引敏感性高、特异性强：

用禽流感病毒的探针、引物检测常见的其他禽类病毒，未发现交叉反应物检测常见的其他禽类病毒，未发现交叉反应。

节约检测时间节约检测时间。

不易污染：

荧光技术通过连接电脑不易污染：

荧光技术通过连接电脑分析过程中产生的荧光信号，实现了实时分析过程中产生的荧光信号，实现了实时、在线检测扩增过程，而无需对扩、在线检测扩增过程，而无需对扩增产物进行后处理，克服了传统的技术易增产物进行后处理，克服了传统的技术易污染的缺点，可实现在同一个标准的操作程序条污染的缺点，可实现在同一个标准的操作程序条件下进行稳定、可靠的检测。

件下进行稳定、可靠的检测。

NASBANASBANASBANASBA（Nucleicacidsequence-basedaNucleicacidsequence-basedamplification,NASBAmplification,NASBA，依赖核酸序列的扩，依赖核酸序列的扩增技术）增技术），又称自主序列复制系统，又称自主序列复制系统（self-（self-sustainedsustainedsequencesequencereplicationreplication，3SR）3SR）或再生长序列复制技术。

或再生长序列复制技术。

19901990年年GuGuatelliatelli等首先报道了这一技术。

等首先报道了这一技术。

检测原理检测原理检测原理检测原理NASBANASBA是一项连续、等温、基于酶反应的核酸扩增技是一项连续、等温、基于酶反应的核酸扩增技术。

该技术使用三种酶（反转录酶、核糖核酸酶术。

该技术使用三种酶（反转录酶、核糖核酸酶HH、噬菌体噬菌体T7T7核糖核酸聚合酶）和两条寡核苷酸引物。

上核糖核酸聚合酶）和两条寡核苷酸引物。

上游引物游引物55末端含有噬菌体末端含有噬菌体T7T7的依赖于的依赖于DNADNA的的RNARNA聚聚合酶的启动子序列，下游引物的合酶的启动子序列，下游引物的55末端含有和钌标电化末端含有和钌标电化学发光检测探针互补的序列。

在扩增步骤中，两个学发光检测探针互补的序列。

在扩增步骤中，两个55端端都整合进扩增序列中，这样既成为产生互补都整合进扩增序列中，这样既成为产生互补RNARNA序列序列的模板，又能特异性结合检测步骤中的的模板，又能特异性结合检测步骤中的ECLECL探针。

扩探针。

扩增底物与增底物与ECLECL探针形成复合物，携带该复合物的磁珠探针形成复合物，携带该复合物的磁珠被电极的表面磁性捕获。

电极上的电压引起电化学发光被电极的表面磁性捕获。

电极上的电压引起电化学发光（ECLECL）反应。

已杂交上的钌标磁珠发出的光和扩增反应。

已杂交上的钌标磁珠发出的光和扩增反应产生的反应产生的RNARNA扩增产物总量成比例对应。

扩增产物总量成比例对应。

检测步骤：

检测步骤：

检测步骤：

检测步骤：

核酸提取核酸提取核酸提取核酸提取核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸扩增电化学发光法检测扩增产物电化学发光法检测扩增产物电化学发光法检测扩增产物电化学发光法检测扩增产物核酸提取核酸提取核酸提取核酸提取核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸扩增电化学发光法检测扩增产物电化学发光法检测扩增产物电化学发光法检测扩增产物电化学发光法检测扩增产物扩增之后，采用电化学发光反应（扩增之后，采用电化学发光反应（ECLECL）或酶）或酶联抗体捕获法（联抗体捕获法（MPMP）都可进行诊断。

）都可进行诊断。

在在ECLECL检测系统中，通过一个用来确定检测系统中，通过一个用来确定RNARNA扩扩增子存在的额外的捕获探针，检测系统的特异增子存在的额外的捕获探针，检测系统的特异性得到加强，扩增反应完成后，一部分产物添加性得到加强，扩增反应完成后，一部分产物添加含有捕获探针和含有捕获探针和ECLECL探针的杂交溶液中探针的杂交溶液中。

（见（见图）。

捕获探针特异性对应于目的图）。

捕获探针特异性对应于目的RNARNA扩增子扩增子，同时，同时ECLECL探针是属别特异并且互补于探针是属别特异并且互补于RNARNA扩扩增子。

在温育过后，已杂交的扩增子和增子。

在温育过后，已杂交的扩增子和ECLECL探探针形成复合物，携带该复合物的磁珠被电极的表针形成复合物，携带该复合物的磁珠被电极的表面磁性捕获。

电极上的电压引起电化学发光（面磁性捕获。

电极上的电压引起电化学发光（EECLCL）反应。

已杂交上的钌标磁珠发出的光和扩）反应。

已杂交上的钌标磁珠发出的光和扩增反应生成的增反应生成的RNARNA扩增子总量成比例对应。

扩增子总量成比例对应。

的检测特点的检测特点11、特异性强：

是一种快速、等温的、特异性强：

是一种快速、等温的扩增技术，通过逆转录酶和扩增技术，通过逆转录酶和聚合酶进行的扩增反应，因为反应条件温和聚合酶进行的扩增反应，因为反应条件温和以及比短的反应时间，因此转录更加忠实以及比短的反应时间，因此转录更加忠实于模板，错配率很低，因而特异性更强。

禽流感于模板，错配率很低，因而特异性更强。

禽流感病毒检测方法仅检测到禽流感病毒，病毒检测方法仅检测到禽流感病毒，未检测出其他禽类病毒、其他禽类疫苗和未检测出其他禽类病毒、其他禽类疫苗和鸡胚尿囊液。

鸡胚尿囊液。

的检测特点的检测特点22、快速：

由于反转录过程被直接合并到扩、快速：

由于反转录过程被直接合并到扩增反应中，因此最适合分析增反应中，因此最适合分析样品。

在标准条件下，这项测试能在样品。

在标准条件下，这项测试能在小时左右结束。

小时左右结束。

33、敏感性高：

反应产物是单链、敏感性高：

反应产物是单链，因而可采用杂交检测系统来提高，因而可采用杂交检测系统来提高该技术的敏感性和特异性。

其敏感性已与该技术的敏感性和特异性。

其敏感性已与传统的鸡胚接种法相当。

传统的鸡胚接种法相当。

的检测特点的检测特点44、适用于检测样品的范围广：

由于、适用于检测样品的范围广：

由于技术的反转录过程被直接合并到扩增反应中，因技术的反转录过程被直接合并到扩增反应中，因此最适合分析样品。

样品中此最适合分析样品。

样品中、肝素、柠檬酸盐、血红蛋白、肝素、柠檬酸盐、血红蛋白、白蛋白和脂质等的污染将不会对结果造成影响，白蛋白和脂质等的污染将不会对结果造成影响，因而适用于可能不适合其他试验检测的样品如泄因而适用于可能不适合其他试验检测的样品如泄殖腔拭子、咽喉拭子、粪便、血液、动物源性食殖腔拭子、咽喉拭子、粪便、血液、动物源性食品、笼垃圾物等的检测。

品、笼垃圾物等的检测。

病原学检测方法病原学检测方法SPFSPF鸡胚分离法鸡胚分离法MDCKMDCK细胞分离法细胞分离法SPFSPF鸡胚分离流感病毒鸡胚分离流感病毒取取9-119-11日胚龄鸡胚，经羊膜腔和尿囊腔接日胚龄鸡胚，经羊膜腔和尿囊腔接种标本种标本0.20.2mlml，每份标本接种，每份标本接种3-43-4只胚，只胚，置置33-3533-35培养培养72h72h。

然后将鸡胚置。

然后将鸡胚置44过夜（或置过夜（或置-20-20冰箱冰箱1h1h再置再置44数小数小时），分别收获尿囊液和羊水并检查时），分别收获尿囊液和羊水并检查HAHA活活性，如具有一定的性，如具有一定的HAHA滴度即可进行病毒鉴滴度即可进行病毒鉴定。

如定。

如HAHA阴性，可盲传一代，如阴性，可盲传一代，如HAHA仍为仍为阴性则弃之。

阴性则弃之。

MDCKMDCK细胞分离流感病毒细胞分离流感病毒组织及细胞培养：

组织及细胞培养：

组织培养的原理主要是为病毒易感的组