生物技术制药复习题.docx
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生物技术制药复习题
生物技术制药复习题
第一章 绪论
第一节 生物技术的发展史
1、生物技术：
以生命科学为基础，利用生物体的特性和功能，设计构建具有与其性状的新物种
或新品系，并与工程结合，利用这样的新物种进行加工生产，为社会提供商品服务的一个综合
性技术体系。
它的范畴：
基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、生化工程。
基因工程是生
物技术的核心。
P1
2、蛋白质工程----第二代基因工程；海洋生物技术-----第三代生物技术 P1
3、生物技术发展史：
传统、近代（抗生素、发酵罐）、现代（DNA 重组）P3
1974 年，Boyer 和 Cohen 建立了 DNA 重组技术
1975 年，Koher 和 Milstein 建立了单克隆抗体技术
1982 年，第一个基因工程药物重组人胰岛素被批准上市
1989 年，我国第一个基因工程药物干扰素批准上市
2003 年，中国的重组腺病毒-p53 注射液成为石阶上第一个正式批准的基因治疗药物。
第二节 生物技术药物
1、生物技术制药：
生物技术制药：
采用现代生物技术人为地创造一些条件，借助某些微生物、
植物或动物来生产所需的医药品。
P4
2、生物技术药物：
采用 DNA 重组技术活其他生物技术研制的蛋白质或核酸类药物。
它与天然生
化药物、微生物药物、海洋药物和生物制品共同归为生物药物。
3、现代生物药物分为 4 类：
重组 DNA 技术制造的基因重组多肽、蛋白质类治疗剂；基因药物；
天然药物；合成与部分合成药物。
4、生物药物按用途分为：
治疗药物；预防药物；诊断药物。
5、生物技术药物的特征：
（1）分子结构复杂；
（2）具有种属特异性；（3）治疗针对性强、疗效高；（4）稳定性差
（5）基因稳定性；（6）免疫原性；（7）体内半衰期短；（8）受体效应；（9）多效性和网络
性效应；（10）检验的特殊性。
第三节 生物技术制药
1、生物技术制药的特征：
高技术、高投入、长周期、高风险、高收益。
P5
2、生物技术在制药中的应用有哪些？
P7
（1）基因工程制药：
① 开发基因工程药物，如干扰素（IFN）、红细胞生成素（EPO）等 ②基
因工程疫苗，如乙肝基因工程疫苗 ③基因工程抗体，它可以作为导向药物的载体 ④基因诊断
与基因治疗⑤应用基因工程技术建立新药的筛选模型 ⑥应用极影工程激活素改良菌种，产生新
的微生物药物 ⑦改进药物生产工艺 ⑧利用转基因动、植物生产蛋白质类药物。
（2）细胞工程制药①单克隆抗体技术 ②动物细胞培养 ③植物细胞培养生产次级代谢产物。
（3）酶工程制药 ：
酶与细胞的固定化及酶转化制药
（4）发酵工程制药：
发酵工艺改进、新药研制、菌种改造。
第二章 基因工程制药
第一节 概述（略）
第二节 基因工程药物的生产过程 P15
1、基因工程技术：
将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌
（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。
2、基因工程药物制造的主要程序 （过程）（重点和后面几节联系起来）
（1）目的基因的克隆（分离目的基因）：
通过逆转录、反转录-聚合酶链式反应、化学合成方
法来制备 cDNA，再通过核酸探针杂交或免疫反应来筛选目的基因
（2）目的基因与载体连接构
建 DNA 重组体：
通过限制性内切酶 DNA 连接酶等核酸酶，把目的基因组入载体的相关克隆位点，
常用的载体有质粒载体和噬菌体载体（3）将 DNA 重组体转入宿主菌构建工程菌：
常用的宿主菌
有大肠杆菌、酵母菌等，先使宿主菌处于感受态，再通过转化、转导等方式把重组 DNA 导入宿
主菌，以构建工程菌（4）工程菌发酵：
提供适当的培养基、反应器、控制好发酵过程中的各种
参数，如温度、PH、溶氧等，并通过升温来诱导产物表达（5）目的基因表达产物的分离纯化：
通过固液分离、初步纯化、高度纯化、成品加工来制备产品；若是胞内产物需要细胞破碎，若
是包涵体则需要变性和复性（6）产品的检验：
检测产品的质量和性能 。
第三节 目的基因的获得
1、利用基因工程生产蛋白质或多肽需要得到其基因，制备目的基因常用的方法有哪些？
P16
（1）逆转录法
以 mRNA 为模板，经逆转录的到 cDNA，构建 cDNA 文库，从 cDNA 文库中筛选目的基因。
由于 RNA
转录加工过程中，内含子序列已被剪切掉，因此，cDNA 文库中无内含子，适于在原核系统中表
达。
但是，cDNA 只包含蛋白质的结构基因部分，缺少有关的调控序列，因此在原核系统中表达，
还需要根据表达载体的结构，配以相应的调控序列。
（2）利用反转录-聚合酶链式反应制备基因
（3）化学合成法：
只适用于克隆小分子肽的基因
2、利用逆转录法获得目的基因的基本过程 P16
（1）mRNA 的纯化 ：
从表达目的基因的细胞中提取总 RNA，用寡聚脱氧胸苷（dT）纤维素柱从
总 RNA 中提取纯化 mRNA。
（2）cDNA 的合成：
以 mRNA 为模板，利用逆转录酶合成 cDNA 第一链，再用 DNA 聚合酶合成
cDNA 的双链。
（3）cDNA 克隆：
利用合适的连接方法，将产生的双链 cDNA 片段插入到合适的载体中。
（4）构建 cDNA 文库 ：
将 cDNA 与载体连接的重组体转入大肠杆菌中，产生的克隆群体为 cDNA
文库。
（5）从 cDNA 文库中筛选目的基因 ：
得到 cDNA 文库后，通常采用核酸探针杂交法和免疫反应
鉴定法从数以万计的 DNA 片段中筛选出目的基因。
3、载体分为：
表达型载体和非表达型载体。
P17
第四节 基因表达
1、基因表达：
指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。
P20
2、基因高效表达研究：
指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到
另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。
P20
3、基因表达的微生物宿主细胞分为两大类：
P21
第一类为原核细胞（常用的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等）；
⑴大肠杆菌（目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系）：
表达基因产物形式多样，
大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。
因分泌能力不足，真核蛋白
质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。
蛋白质不能糖基化。
产物蛋白
质 N 端多余一个蛋氨酸残基。
其内毒素很难除去。
⑵枯草芽胞杆菌：
分泌能力强，蛋白质不形成包含体。
产物蛋白质不能糖基化。
有很强的胞外
蛋白酶对产物降解。
⑶链霉菌：
作为外源性基因表达受到重视。
不致病、使用安全、分泌能力强、表达产物可糖基
化。
第二类为真核细胞（常用的真核微生物有酵母、丝状真菌等）
⑴酵母：
酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。
其基因组小，世代时间短，有单
倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。
能外分泌，产物可糖基化。
已有不少真核基因成功
表达
⑵丝状真菌：
分泌能力强，能正确进行翻译后加工（肽剪切糖基化）有成熟的发酵和后处理工
艺。
4、目前使用最广泛的宿主菌是大肠杆菌和酿酒酵母。
P22
5、大肠杆菌基因表达载体 P23
（1）pBV220 系统
pBV220 系统国内使用最多的载体,其组成：
①来源于 pUC8 多克隆位点；②核糖体 rrnB 基因终
止信号；③pBR322 第 4225～3735 位；④pUC18 第 2066～680 位；⑤λ 噬菌体 cIts857 抑制子
基因及 PR 启动子；⑥pRC23 的 PL 启动子及 SD 序列
（2）pET 系统
6、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 P22
外源基因表达产量与细胞浓度和细胞表达产量呈正相关。
单个细胞产量取决于：
（1）外源基因的剂量 ：
一般来说细菌内基因拷贝数增加，基因的表达产物也增加。
（2）外源基因的表达效率
① 启动子的强弱：
启动子是在转录水平上影响基因表达的因素。
需要寻找强的启动子。
② 核糖体结合位点的有效性：
大肠杆菌核糖体结合位点对真核基因在细菌中的高效表达是十分
重要的。
③ SD 序列和起始密码 ATG 的间距：
表达非融合蛋白的关键是原核 SD 序列和真核起始密码
ATG 之间的距离，距离过长过短都影响真核基因的表达。
④ 密码子组成：
应选择使用大肠杆菌偏爱的密码子。
（3）表达产物的稳定性：
（4）细胞的代谢负荷 ：
必须使宿主细胞的代谢负荷不至过重，又能高效表达出外源基因产物。
（5）工程菌的培养条件
外源基因的高水平表达，不仅涉及宿主、载体和克隆基因三者之间的相互关系，而且与其所处
的环境条件息息相关，必须进行优化。
7、真核基因在大肠杆菌中的表达形式 P26
⑴以融合蛋白的形式表达药物基因
以原核多肽和真核蛋白结合在一起称融合蛋白。
优点：
操作简便，表达蛋白在菌体内稳定，易实现高效表达；
缺点：
只能作抗原用。
⑵以非融合蛋白的形式表达药物基因
非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的 mRNA 的 AUG 为起始，在其氨基端不
含细菌多肽序列。
优点：
保持原有蛋白活性；
缺点：
易被蛋白酶破坏。
⑶分泌型表达药物基因（外源基因融合到编码原核蛋白信号肽序列的下游）
优点：
在周质中稳定，有活性，不 含蛋氨酸残基；
缺点：
产量不高， 信号肽不被切割。
8、载体相关定义
载体：
在基因工程重组 DNA 技术中将 DNA 片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制
的 DNA 分子。
克隆载体：
从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的 DNA 作为载体，在其上插入合适大小的外
源 DNA 片段，将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量繁殖。
表达载体：
在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的
基因能够表达的载体。
穿梭载体：
指含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复制的载体（例如既能
在原核生物中复制,又能在真核生物中复制的载体）。
9、载体的复制系列可分四类：
P27
（1）Yep 类（酵母附加体质粒）
（2）YRp 类（酵母复制型质粒）
（3）YCp 类（酵母着丝粒质粒）（4）YIp 类（酵母整合型质粒）
10、影响目的基因在酵母菌中表达的因素
⑴外源基因的拷贝数
⑵外源基因的表达效率：
①启动子 ②分泌信号的效率 ③终止序列的影响
⑶外源蛋白的糖基化
⑷宿主菌株的影响：
①菌体生长力强 ②菌体内源蛋白酶要较弱 ③菌体性能稳定 ④分泌能力强
11、精确表达载体 P28
酵母载体有两类：
普通表达载体和精确表达载体。
精确表达载体：
要求在启动子或前导肽编码序列的适当部位有内切酶位点，以利于接入外源基
因，并使它在表达和加工后氮末端氨基酸序列与天然产物相同，既无多余的氨基酸，也无缺失
的氨基酸的克隆载体。
第五节 基因工程菌生长代谢的特点
1、碳源物质为细胞提供能量，当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时，菌体会产
生乙酸，导致培养基的 pH 值下降，从而影响菌体的生长。
适当提高 pH，可减少乙酸的抑制作
用；P31
第六节 基因工程菌的不稳定性
1、质粒不稳定分为那两类？
P32
工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象，质粒不稳定分为分裂不稳定和结构不稳定。
质粒的分裂不稳定是指工程菌在分裂时出现一定比例的不含质粒的子代菌的现象。
与含质粒菌
产生不含质粒子代菌的频率；这两种菌比数率差异的大小有关
质粒的结构不稳定是指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。
基
2、提高质粒稳定性的方法 P33
（1）选择合适的宿主菌：
遗传稳定
（2）选择合适的载体：
高拷贝数；（3）选择压力：
如加抗
生素提高稳定性；（4）分阶段控制培养：
先使菌体生长至一定密度；再诱导外源基因的表达
（5）控制培养条件 （6）固定化
第八节 重组工程菌的培养
1、基因工程菌的培养方式 P36
（1） 分批培养
（2）补料分批培养：
将种子接入发酵反应器中进行培养,经过一段时间后间歇或连续地补加新
鲜培养基，使菌体进一步生长的方法。
（3）连续培养
（4）透析培养
（5）固定化培养
2、基因工程菌的培养工艺 P37
（1） 培养基的影响
（2） 接种量的影响（3）温度的影响（4）溶氧量的影响（5）诱导时机的
影响（6）诱导表达程序的影响：
一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达。
（7） pH 的影响：
生长 pH 在 6.8～7.4 左右，后期外源蛋白的表达其最佳 pH 为 6.0～6.5。
第九节 高密度发酵
1、什么是高密度发酵？
影响高密度发酵的因素有哪些？
可采取哪些方法实现高密度发酵？
P41
（1）高密度发酵：
一个相对概念，一般指培养基中工程菌的菌体浓度在 50gDCW/L 以上，理论
上的最高值可达 200gDCW/L。
（2）影响高密度发酵的因素：
培养基；溶氧浓度；pH；温度；代谢副产物
（3）实现高密度发酵的方法 P43
①发酵条件的改进
a.培养基的选择（普遍采用 6g/L 的甘油为碳源）；b.建立流加式培养的方式；c.提高供氧能力
②构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌
a.阻断乙酸产生的主要途径；b.对碳代谢流进行分流；c.限制进入糖酵解途径的碳代谢流；d.
引入血红蛋白基因
③构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌
第十节 基因工程药物的分离纯化
1、表达的产物都是多肽或蛋白质 ，它的制得具有以下特点：
P46
（1）表达产物在初始料中含量较低；
（2）含有大量细胞及代谢产物；（3）表达产物稳定性差，
易失活变性；（4）表达产物的种类繁多、结构不一、活性各异；（5）对其质量要求纯度高、
无菌、无热原。
2、分离纯化的基本过程
若是论述题最好对过程进行一定的介绍
3、建立分离纯化工艺的根据 P46
（1）含目的产物的起始料的特点
基因工程菌的发酵产物其上游过程的各种因素对分离、纯化工艺有影响。
包括：
①菌种的类型
及其代谢特性。
②原材料培养基的来源及其质量。
③生产工艺及条件。
（2）物料中杂质的种类和性质。
（3）目的产物特性。
（4）产品质量的要求
4、细胞破碎与固液分离
⑴细胞收集：
离心法、膜分离法。
⑵细胞破碎：
机械破碎法、非机械破碎法；物理法、化学法、生物法
⑶固液分离：
离心、膜过滤、双水相萃取
5、细胞破碎的方法；P47
（1）物理方法：
匀浆法、珠磨法、超声波法
（2）化学法：
渗透冲击法（高渗+低渗）、增溶法（表面活性剂等）
（3）生物法：
酶溶法
6、分离纯化常用的色谱分离方法有那些？
P50
分离纯化主要依赖色谱分离方法。
色谱技术是医药生物技术下游过程精制阶段的常用手段，其
优点是该法具有多种多样的分离机制、设备简单、便于自动化控制和分离过程中无发热等 有害
效应。
色谱技术分为离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱、高 压液
相色谱等。
（1）离子交换层析 P51
离子交换介质由三部分构成：
（1）不溶性高分子聚合物—载体；
（2）共价键结合于载体上---
活性基团或功能集团（3）与活性基团带相反电荷---平衡离子或反离子（决定是阴离子交换树
脂还是阳离子交换树脂）如：
酸性阳离子交换树脂 R-SO3H
蛋白质的等电点和表面电荷的分布主要影响离子交换的性能。
它由平衡、上样、洗脱（分为梯度洗脱和阶段洗脱 2 种）、再生 4 个主要步骤构成。
（2）疏水层析 P54
利用蛋白质分子表面上的疏水区域和介质中的疏水基团之间的相互作用，无机盐的存在能使相
互作用力增强。
流动相为 pH6～8 盐水溶液。
常用的介质是多聚糖（如琼脂糖）和硅胶。
（3）亲和层析 P4756
亲和层析是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附，如抗体与抗原、受
体与激素、酶与底物之间的作用。
洗脱时分为特异性洗脱和非特异性洗脱。
（4）凝胶过滤层析 P59
凝胶过滤是以具有大小一定的多孔性凝胶作为分离介质，小分子能进入孔内，在柱中缓慢移动，
而大分子不能进入孔内，快速移动，大分子量物质先流出，小分子物质后流出。
利用这种移动
差别可使大分子与小分子分开。
7、用于分离纯化的技术应满足那些要求？
P62
（1）技术条件温和，能保持目的产物的生物活性。
（2）选择性好，能从复杂的混合物中有效地将目的产物分离出来，达到较高纯化倍数。
（3）收率要高。
（4）两个技术之间不需要对物料加以处理或调整，这样可以减少工艺步骤。
（5）整个分离纯化过程要快速，能够满足高生产率的要求。
第十一节 变性蛋白的复性
1、外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成 P63
2、包涵体：
指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
3、包涵体的分离和溶解 P63
（1）包涵体的分离：
重组菌破碎后，离心得沉淀部分，再用低浓度变性剂（脲或盐酸胍）、去
垢剂（Triton X-100）、脱氧胆酸钠洗涤。
（2）包涵体溶解：
般用强的变性剂如脲（6-8M）、盐酸胍（6M），或用去垢剂，如 SDS、正十
六烷基三甲基铵氯化物等，溶解涵体蛋白质。
（3）包涵体复性：
稀释复性和透析复性；含二硫键的蛋白的复性；封闭蛋白的疏水蔟促进复性；
凝胶过滤层析复性；小分子添加剂促进的复性；分子伴侣或折叠酶促进的复性；人工分子伴侣
的复性
第十二节 基因工程药物的质量控制
1、由基因重组技术所获得的蛋白质药物产品进行鉴定时，常作那些项目分析？
P68
（1）肽图分析
肽图分析是用酶法或化学法降解目的蛋白质后，对生成的肽段进行的分离分析。
它是一种可检
测蛋白质一级结构中细微变化的最有效方法，该技术灵敏高效的特点使其成为对基因工程 药物
的分子结构和遗传稳定性进行评价和验证的首选方法。
（2）氨基酸成分分析
在氨基酸成分分析中，一般含 50 个左右的氨基酸残基的蛋白质的定量分析是接近理论值的，即
与序列分析结果一致。
（3）部分氨基酸序列分析
部分氨基酸序列分析（N 端 15 个氨基酸）可作为重组蛋白质和多肽的重要鉴定指标。
（4）重组蛋白质的浓度测定和分子量测定
蛋白质浓度测定方法主要有凯氏定氮法、双缩脲法、染料结合比色法、福林-酚法和紫外法等。
蛋白质分子量测定最常用的方法有凝胶过滤法和 SDS-PAGE 法，凝胶过滤法是测定完整的蛋白质
分子量，而 SDS-PAGE 法测定的是蛋白质亚基的分子量。
（5）蛋白质二硫键分析
二硫键和巯基与蛋白质的生物活性密切相关，基因工程药物产品的硫-硫键是否正确配对 是一
个重要问题。
第三章 动物细胞制药
第一节 概述
细胞工程：
是指以细胞为对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的地利用或
改造生物遗传特性，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科学技术。
P79
第二节 动物细胞的形态和生理特点（重点）
1、离体培养的动物细胞分为那些类型？
P81
动物细胞适应功能,形态各异。
离体培养细胞分两类：
贴壁细胞；悬浮细胞
（1）贴壁细胞
生长须有贴附的支持物表面， 自身分泌或培养基中提供的贴 附因子才能在该表面上生长。
两种形态：
成纤维细胞型和上皮细胞型
（2）悬浮细胞：
生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长。
如淋巴细胞。
（3）兼性贴壁细胞：
生长不严格依赖支持物。
如中国地鼠卵巢细胞，小鼠 L929 细胞。
2、什么是接触抑制现象？
P84
当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片时，即每个细胞与其周围的细胞相互接触时，
细胞就停止增殖。
此时若能保持充足的营养，细胞仍可存活相当一段时间，但细胞密度不再
增加，所以该现象又称之谓接触抑制或密度依赖抑制现象。
一旦细胞转化为异倍体后，该现
象随之消失，细胞可多层生长。
细胞密度也就可大大增加。
3、动物细胞的生理特点 P83
（1）细胞的分裂周期长
动物细胞分裂所需的时间一般为 12～48h，它不仅随细胞种属的不同而不同，就是同一种属的，
不同部位的细胞其所需的时间也不同。
周期=间期+分裂期 间期（G1+S+G2） 分裂期（M）
（2）细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象
（3）正常二倍体细胞的生长寿命是有限的
（4）动物细胞对周围环境十分敏感。
动物细胞对各种物理化学因素，如渗透压，pH，离子浓度，
剪切力，微量元素等的变化耐受力很弱。
（5）动物细胞对培养基的要求高
氨基酸、维生素，多种无机盐和微量元素，细胞生长因子、贴壁因子。
（6）动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同
动物细胞的蛋白质合成除了在游离的核糖体上进行外，还在与糙面内质网上结合的核糖
体上进行。
（游离核糖体合成蛋白质用于细胞质基质内。
粗面内质网的核糖体合成蛋白质是分
泌的和膜中的整合蛋白多为糖蛋白。
）
3、动物细胞作为宿主细胞生产药物的特点；P85
（1）优点：
产品多分泌在胞外，收集纯化方便，得到较完善的翻译后修饰，特别是糖基化，因
此与天然产品更一致，适于临床
（2）缺点：
培养条件要求高，成本贵，产量低
第三节生产用动物细胞的要求和获得
1、生产用动物细胞的种类及其特点 P86
用于生产的动物细胞有三类，即原代细胞、已建立的二倍体细胞系、以及可无限期传代
的转化细胞系，以及用这些细胞进行融合和重组的工程细胞。
（1）原代细胞
原代细胞是直接取自动物组织、器官，经过分碎，消化而获得的细胞悬液。
用得最多的是鸡胚
细胞，原代兔肾或鼠肾细胞，以及血液的淋巴细胞。
（2）二倍体细胞系
原代细胞经过传代、筛选、克隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选，并纯化出某种具有一定
特征的细胞株。
该细胞株仍具备“正常”细胞的特点，一般均从动物的胚胎组织中获取。
（3）转化细胞
这类细胞是通过某个转化过程形成的，它常常由于染色体的断裂变成了异倍体，从而失去了
“正常”细胞的特点，而获得了无限增殖的能力。
由于转化的细胞具有无限生命力，而且常常
倍增时间较短，对培养条件和生长因子等要求较低，故更适于大规模工业化生产的需要。
（4）其他：
融合细胞系（物理法如高压电场和化学法如仙台病毒、聚乙二醇）和重组工程细胞系
2、真核细胞基因表达载体的构建，使用的载体有两类：
（1）病毒载体：
牛痘病毒、腺病毒、
逆转录病毒、杆状病毒；
（2）质粒载体：
穿梭质粒载体 P88
3、重组 DNA 导入动物细胞的常用方法：
融合法、化学法、物理法、病毒法，最常用磷酸钙沉淀
法、 电穿孔法 P89
4、生产用的工程细胞必须建立两个细胞库：
原始细胞库（MCB）、生产用细胞库（MWCB）或工
作细胞库（WCB）P91
第四节 动物细胞的培养条件和培养基
1、动物细胞的培养条件 P92
（1）器材的清洗和消毒
①器材的清洗:
浸泡、刷洗、泡酸、冲洗 ②器材的消毒灭菌:
物理消毒/化学消毒
（2）水质 :
电阻值大于 18MΩ,去热原。
（3） pH:
7.2～7.4
（4）渗透压:
290～300mOsm/kg
（5）温度:
哺乳动物 37±0.5 C；
（6）空气:
氧的饱和质 60%,氧分压 4～0.7kPa
2、培养动物细胞的培养基的种类和组成 P95
动物细胞培养基大致可以分成三类：
天然培养基，合成培养基和无血清培养基。
（1）天然培养基：
血清、羊水、腹水等,成分复杂、成分不稳定
（2）合成培养基：
成分明确、大量供应，DME、MEM、DMEM 等（第一个合成培养基是 199 培养
基；①氨基酸：
12 种必需氨基酸+谷氨酰胺②维生素：
形成辅基和辅酶③糖类：
能源，用葡萄
糖和谷氨酰胺④无机盐：
维持渗透压⑤其它成分：
核酸前体和氧化还原剂如谷胱甘肽⑥添加
5%～10%小牛血清：
作用是提供生长因子和激素；提供
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