苏大分子生物学明解问答.docx

苏大分子生物学明解问答.docx

《苏大分子生物学明解问答.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《苏大分子生物学明解问答.docx（15页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

苏大分子生物学明解问答

分子生物学

snRNA：

小核RNA，只存在于细胞核或者核质核仁中的一类小分子量的RNA，具有独特功能并且独立存在的实体，在基因转录产物的加工过程中具有极其重要的意义。

siRNA：

即干扰RNA，一类小分子量的RNA，可以高效，特意地阻断体内同源基因的表达，促使同源MRNA降解，诱使细胞表现出特定的基因缺失。

反义RNA又称调节RNA，是指能与特定mRNA互补结合的mRNA片段，即碱基序列正好与有意义的mRNA互补的RNA分子。

三链DNA：

是在DNA双螺旋结构基础上形成的，由多聚嘧啶核苷酸或者多聚嘌呤核苷酸与DNA双螺旋形成的。

RNAi：

即RNAi干扰，siRNA高效特异地阻断体内同源基因表达，促使同源RNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型的现象。

卫星DNA：

又称随体DNA,不编码蛋白质和转录RNA的小片段高度重复一类小片段DNA序列，多富含GC碱基在DNA浮力密度实验中会在主峰旁形成些小峰而得名。

一般5-10bp短序列，人类为171bp，保护和稳定染色.

基因组：

表示某物种单倍体的总DNA。

对于二倍体高等生物其配子的DNA总和即为一组基因组。

8LTR：

即长末端重复序列，为RNA基因组的两端含有的U3RU5两个完全相同的正向重复序列。

具随机整和能力，可用作病毒载体

基因表达：

就是基因转录合成信使RNA，再以信使RNA为指导翻译成蛋白质的过程。

启动子：

是启动基因转录所必需的一段DNA顺式调控元件，位于转录起始点上游，是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能启动mRNA合成的序列。

终止子：

位于一个基因编码区下游提供终止信号的DNA序列，可以被RNA聚合酶识别并发出停止mRNA合成的信号。

锌指结构：

由两个半胱氨酸残基和两个组氨酸残基通过位于中心的锌离子结合成一个稳定的指状结构，并以锌辅基螯合形成的环状结构作为活性单位，在指状突出区表面暴露的残基及其极性氨基酸与DNA结合有关。

亮氨酸拉链：

存在与蛋白C末端，为两组走向平行.带亮氨酸的α—螺旋形成的对称二聚体，约为30个氨基酸，每两个亮氨酸之间隔有六个氨基酸，于是每两圈螺旋就有一个亮氨酸，排成一排，从而在2个α-螺旋的蛋白分子之间形成一条拉链。

RNA编辑：

是mRNA转录后因插入，缺失或核苷酸的替换，改变了DNA模板来源的遗传信息，从而翻译出氨基酸序列不同的多种蛋白。

增强子：

是使启动子的基因转录效率显著提高的一类顺式作用元件，其本身不具有启动子活性，是由多个独立的，具有特征性的核苷酸序列所组成。

限制性核酸内切酶：

是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶

Klenow酶：

为DNA聚合酶Ⅰ大片段，分子质量为7.6KD，是经过枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶分解DNA聚合酶Ⅰ，切除小亚基，保留的大亚基部分。

这种酶只有DNA聚合酶的活性和3/外切酶的活性，但是没有5/外切酶活性。

碱性磷酸酶：

为DNA聚合酶Ⅰ大片段，分子质量为7.6KD，是经过枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶分解DNA聚合酶Ⅰ，切除小亚基，保留的大亚基部分。

这种酶只有DNA聚合酶的活性和3/外切酶的活性，但是没有5/外切酶活性。

逆转录酶：

又称为依赖RNA的DNA聚合酶，它是一种有效地转录RNA成为DNA的酶，这种酶具有聚合酶活性和外切核酸酶活性。

DNA连接酶：

一种能够催化在2条DNA链间形成磷酸二酯键的酶，它并不能连接两条单链的DNA分子，被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。

RT-PCR：

即逆转录PCR，先在逆转录酶的作用下以mRNA为模板合成DNA,再以cDNA为模板进行PCR反应。

原位PCR：

直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增的方法。

Southern印迹：

将DNA经酶切后琼脂电泳分离，在凝胶中进行碱变性处理，再转移到硝酸纤维膜等固体载体上，用标记的DNA特异探针对固定在膜上的DNA进行杂交的方法。

主要用来检测DNA限制性内切酶图谱。

Northern印迹：

将RNA样品变性和通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，再转移到硝酸纤维素膜等固相载体上，用标记的DNA或RNA特异探针对固定在膜上的RNA进行杂交。

原位杂交：

用标记的已知核酸序列为探针，使其与细胞或组织切片中核酸进行杂交检测的方法.Western印迹:

一种蛋白质的固定和分析技术，将蛋白质电泳分离后转移到硝酸纤维素膜等固体载体上，然后加入抗体形成抗原抗体复合物，利用发光或显色原理将结果显示到膜或底片上。

差异显示PCR：

又称为差异显示RT-PCR，用于分离在不同的真核细胞中差异表达的DNA并加以克隆，产生不同长度的DNA片段，电泳后比较两者差别。

基因组文库：

分离真核生物中某种DNA成分,通常是分离供体细胞中的染色体DNA，酶切后，将这些染色体DNA片段与某种载体相接，而后转入大肠杆菌，建立包含有真核细胞染色体DNA片断的克隆株,这种克隆株群体称基因组文库。

cDNA文库：

以mRNA为模板在反转录酶的作用下将形成的互补DNA（cDNA）建立基因文库（genelibrary）。

基因突变：

是基因组DNA分子在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变（通常它只涉及基因中部分序列的变化），并引起个体表型的改变,而使生物体发生遗传性变异。

基因突变技术：

用酶学和化学方法来切割或合成DNA，同时将突变碱基或序列导入克隆化的基因中，重组后回到生物体，引起生物功能的改变。

同义突变：

是指碱基被替代后,没有改变产物氨基酸序列,这是与密码子的简并性相关,如CTT、CTC、CTA、CTG的第3位碱基互相替代后其编码表达的产物均为亮氨酸,因此这种突变不产生突变效应。

错义突变：

是指碱基序列的改变引起了产物氨基酸的序列改变。

有些错义突变严重影响到蛋白质活性甚至完全失去活性，从而影响了表型。

如果该基因是必需基因，则该突变为致死突变。

无义突变：

某个碱基的改变可使某种氨基酸的密码子突变为终止密码子。

如赖氨酸的密码子AAG突变为终止密码子TAG,若无义突变的终止密码子使肽链合成过早终止,因而蛋白质产物一般没有活性,若是发生在基因DNA的3’末端处,它所表达产生的多肽常有一定活性或有部分活性,这种突变又称为渗漏变型（leakymutation）。

cdk：

即周期素依赖激酶，有丝分裂促进因子的组成成分，具有蛋白激酶活性的催化亚单位，活性依赖于同周期素结合。

CDⅠ：

即周期素依赖激酶抑制蛋白，是一种具有抑制cdk功能的新蛋白，能在细胞周期的特定时刻负调控cdk活性而控制细胞周期的进程。

周期素：

调节细胞周期的有丝分裂促进因子，依据其在周期中调控阶段的不同，将其分为G1期和S期和M期周期素，有一段高度保守的氨基酸序列与cdk互相结合，其合成与cdk结合或降解起到对细胞周期的调节作用。

V-onc：

病毒的癌基因，存在于病毒基因中，并与恶性转化能力密切相关的各种基因的统称。

C-onc：

在RV病毒基因组中有一个具有致癌活性的SRC基因片段，人们将存在与正常组织与V-onc同源的基因序列统称为C-onc。

守门基因：

在细胞恶性转化过程中与基因启动相关的基因，一旦突变失活就失去了对癌基因活化的负调控作用，以利癌基因启动活化而引起肿瘤。

看护基因：

指能保持细胞基因组稳定性而与细胞恶化转化过程中的癌基因启动不直接相关的基因。

抑癌基因，：

在细胞恶变形转化过程中能抑制癌基因表达及细胞的恶性表现，起显性负调节作用。

转染：

病毒（含噬菌体）DNA及其重组子DNA导入宿主细胞（或细菌）的过程称转染。

转导：

以噬菌体为媒介，将外源DNA导入细菌的过程称转导。

转化：

以质粒作为克隆载体将目的基因导入宿主细胞。

α-互补：

原理：

所谓基因内互补作用，在LacZ体系中,是指二个彼此互补的突变基因（突变体1缺失LacZ近操作基因区段LacI；突变体2带有完整的近操纵基因而无β-半乳糖苷酶活性），它们编码产生的无活性的多肽产物，但由于二个突变体之间通过α肽互补作用可呈现有功能的β-半乳糖苷酶活性,进而可分解底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）而产生半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-氯-青定蓝,使菌落呈现出蓝色反应。

问答

何谓反义RNA？

其功能和医学意义如何？

答：

又称为调节RNA，是指能与特定mRNA互补结合的mRNA片段，也即碱基序列与有意义的mRNA互补的RNA分子。

功能：

a阻断mRNA的翻译，b抑制DNA复制和mRNA的转录，c选择性的关闭基因。

意义：

参与基因调控：

可用于基因治疗；

什么叫做核酶？

如何发挥作用？

有何应用价值？

答：

即一类具有催化活性的核糖核酸。

主要催化RNADE剪接反应和剪切反应。

应用意义：

通过设计合成特异性切割病毒以及病毒的RNA的核酶，对病毒和肿瘤的基因治疗将发挥重要作用。

9.何谓RNAi？

其作用机理和应用前景如何？

答：

：

即RNAi干扰，siRNA高效特异地阻断体内同源基因表达，促使同源RNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型的现象。

作用机理：

分为起始阶段和效应阶段。

起始阶段Dicer酶以依赖ATP的方式切割外源性的双链RNA为小分子干扰RNA，清除病毒，阻断转座子表达；效应阶段小分子干扰RNA结合核酶复合物形成RNA诱导活化的复合物及RISC，然后RISC结合至mRNA转录本上并切割它，从而发挥作用。

应用前景：

大通量研究基因功能的工具；基因敲除中的应用；用于基因治疗；基因表达的调控。

什么叫做基因？

何谓基因的新概念？

基因的主要功能是什么?

答：

基因就是指编码有功能蛋白质多肽链或RNA分子所必须的全部核酸序列。

所谓基因的新概念是随着近年分子生物实验技术的发展从分子水平上研究基因的结构和功能，提出的移动基因，断裂基因，重叠基因，假基因等基因的新概念。

功能：

编码蛋白质或者RNA分子构成染色体的重要组成部分构成DNA的功能单位。

何谓转位子和转位作用？

转位的后果如何？

答：

一种大于2000bp的可以在染色体基因组上移动，甚至可以在不同染色体间跳跃的基因序列，也可以称为插入因子{IS因子}。

转位作用：

转位子具有双向整合特性，可以插入其他基因及自身基因不同位点上的移动方式。

后果：

引起突变或者突变。

何谓基因工程的四大里程碑和三大技术发明？

答：

四大里程碑：

1944年Oswald报道肺炎球菌转化实验；1953年Jameswaston和FrancisCrick阐明了DNA双螺旋结构；遗传密码子的破译；基因转移载体的发现。

三大技术发明：

工具酶的发明；基因合成和测序；PCR基因扩增仪的应用。

构建原核表达载体应具备哪些基本要素？

答：

一个强启动子以及两侧的调控序列，正确的阅读框架即全程的核糖体结合位点，载体质粒的拷贝能力及稳定性，被转译出蛋白的表达形式和存在地方，蛋白的性质和稳定性，以及选择合适的宿主。

外源基因在大肠杆菌中表达需要的条件有哪些？

答：

条件：

一：

保持有正确的方向和阅读框架，二：

原核mRNA聚合酶能够识别插入的基因，三:

转译出来的蛋白分子在菌体不会被大肠杆菌内不至于受菌体蛋白酶的降解。

影响外源基因在大肠杆菌中表达的因素有哪些？

答：

包括以下这些因素：

启动子强度和宿主菌的选择，mRNA的一，二级结构，转录和终止，质粒的拷贝及其稳定性，cDNA密码子的选用，培养条件的控制和表达产物的后加工处理。

名词解释：

真核表达调控的顺式作用元件有哪些？

其作用特点是什么？

答：

顺式作用元件有：

启动子，增强子，沉默子，衰减子，终止子。

作用特点：

是能够与DNA结合蛋白质结合的特定序列的DNA片段，决定转录起始位点和RNA聚合酶的转录效应。

真核表达调控的反式作用因子有哪些？

其作用特点？

答：

反式作用元件：

主要分为通用转录因子和转录调节因子两大类。

作用特点：

一，同一DNA序列可被不同蛋白质识别；二：

同一蛋白质因子可与多种不同DNA序列发生联系，多通过蛋白质-蛋白质先结合再影响DNA。

三：

蛋白质-蛋白质或蛋白质-DNA的结合，导致构象上细微的改变，从而发挥调控作用。

四：

反式作用元件在合成过程中有相当大的可变性和可塑性。

真核表达载体所必备的条件有哪些？

其选择性标记基因有哪些？

答：

条件：

标记基因：

胸苷激酶基因选择标记；二氢叶酸还原酶基因选择标记；新霉素抗性基因选择标记；氯霉素乙酰转移酶基因选择标记；黄嘌呤-鸟嘌呤转移基因。

常用的真核表达载体有哪些？

并简述其特点。

答：

主要有一下几种：

逆转录病毒载体，痘类病毒载体，HSV-I单纯疱疹病毒载体。

特点：

一，逆转录病毒载体：

对细胞的感染效率高，并能表达整合的病毒基因；可以同时感染大量细胞；长时间感染细胞并不会发生毒害作用；宿主范围十分广泛；可以进行DNA的单拷贝整合；但稳定性差，安全性差，重组病毒滴度不高而且局限于感染分裂细胞。

二，痘类病毒载体：

对多种细胞敏感易于培养利于大量生产制备；对外环境相对稳定并易于保存运输；接种途径简单易行；利于多价疫苗的研究开发；利于大片段的外源性基因的插入，且不影响病毒的正常复制和表达，但是基因组分子量大不易操作，没有mRNA的剪切功能故不宜采用基因组DNA，需使用无内含子的cDNA。

三，HSV-I单纯疱疹病毒载体：

比较大利于大片段的外源性基因插入提供条件，而且插入容量大；可以感染神经细胞。

简述真核，原核俩大表达系统的优缺点？

答：

一，真核生物DNA只有一小部分是裸露的，有核膜包裹；原核生物大部分属于非结合状态，且无核膜的阻隔，转录的mRNA直接在胞质中进行蛋白合成。

二，真核生物DNA都有内含子，可以剪接加以去除；原核生物mRNA的剪接加工能力。

三，真核生物可以在需要时可以重排某些DNA片段和扩增特定基因的机制，而原核生物没有。

四，真核生物有三种mRNA酶，可参与不同类型的RNA分子转录作用，而原核生物只有一种RNA酶。

五，真核生物产生的mRNA分子寿命大多比原核生物长。

六，真核生物具有对初级转录产物的剪接能力。

七，真核生物不存在操纵子结构，原核生物多是。

八，真核生物基因多拷贝，而原核生物含有很少的重复序列。

影响Ⅱ型核算内切酶活性的因素有哪些？

如何克服？

答：

一、DNA的纯度。

限制性核酸内切酶消化DNA底物的反应速率，很大程度上取决于所使用的DNA本身的纯度。

在DNA制剂中的你、某些污染物质，如蛋白质、酚、氯仿、究竟、乙二胺四乙酸（EDTA）、SDS（十二烷基硫酸钠）以及高浓度的盐离子等，都有可能抑制核酸内切酶的活性。

克服的方法为：

a、增加限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高达10单位甚至更多些；b、扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑制因素被相应的稀释；c、延长酶催化反应的保温时间。

二、DNA的甲基化程度。

限制性内切酶不能够切割甲基化的核苷酸序列，因此甲基化会强烈的影响酶的活性。

为了避免这种问题，在基因克隆中是使用失去了甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNA。

三、酶切消化反应的温度。

不同的限制性核酸内切酶具有不同的最适反应温度，而且彼此之间有相当大的变动范围。

大多数限制酶的标准反应温度是37°C，但也有例外。

温度过高或过低都会影响酶的活性甚至最终导致其完全失活。

四、DNA分子结构。

有些限制酶切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需的酶量要比消化线性DNA高出许多倍，而有些限制性核酸内切酶切割他们自己处于不同部位限制位点的效率也有明显的差别。

五、限制性核酸内切酶的缓冲液。

不同的内切酶对盐浓度要求不一样。

同时还有其他一些如巯基试剂、适宜PH值、甘油体积分数等对不同的内切酶来说要求也不同

基因片段与载体间的平末端连接有什么方法？

答：

连接平末端DNA分子的方法有两种：

一、T4连接酶连接法。

T4DNA连接酶除了能封闭具有3/-OH和5/-P末端的双链DNA的缺口外，在存在ATP和加入高浓度酶的条件下，它还能够连接具有完全配对碱基的平末端DNA分子，但其连接效率比黏性末端要低的多。

二、同聚物加尾法。

先用末端核苷酰转移酶给平末端DNA分子3/-OH基团端加上同聚物尾巴，再用DNA连接酶进行连接。

为了在平末端的DNA分子上产生带有3/-OH的单链延伸，需要用5/特异的核酸外切酶处理DNA分子，以便移去少数几个末端核苷酸。

将要连接的DNA分子3/-OH基团端延伸出poly（dA）和poly（dT）或者poly（dG）和poly（dC）尾巴后，互补的尾巴就会连接起来，连接分子的裂口可通过大肠杆菌DNA聚合酶的作用予以补上，留下的单链缺口则可由DNA连接酶封闭。

基因重组是常用哪几种载体？

其共同特点如何？

答：

共同特征：

①自主复制②易于扩增分离纯化③有非必需区④有单一酶切位点（多克隆位点）单一酶切位点：

一种酶在一个载体上只有一个酶切位点多克隆位点：

一个载体上的某一个区域含有多个单一酶切位点⑤有选择标记基因⑥表达载体还应有表达调控元件（启动子、增强子、终止子,SD序列）

作为理想的质粒载体有哪些基本条件？

答：

作为理想的质粒载体，应具备以下几个条件

（1）能自主复制，即本身是复制子

（2）具有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位点中插入外源基因片段，不影响本身的复制功能；（3）在基因组中有1-2个筛选标记，为寄主细胞提供易于检测的表型特征，（4）分子量要小，多拷贝，易于操作。

核酸探针标记常用哪些方法？

答：

1，缺口平移法，2，随机引物法，3末端标记法，又分为DNA聚合酶IKlenow片段标记法，T4DNA聚合酶标记法，T4核苷酸激酶标记法，末端脱氧核苷酸转移酶标记法。

目的基因克隆时常用哪些方法分离和获得基因？

答：

一、化学合成二、聚合酶链反应（PCR）方法扩增目的基因

三、建立基因组DNA文库

四、构建cDNA文库筛选目的基因

五、其他方法㈠构建差示文库筛选特殊基因差示文库；㈡mRNA差异显示法获得目的基因；㈢基因改造可获得新型目的基因

构建基因组文库的意义及构建过程如何？

答：

意义：

提供全套遗传信息,即完整的基因组DNA,可以研究基因组中5’端控制基因转

录的调控序列,内含子的分布和作用,以及重复序列的数量分布及大小

过程：

⑴分离纯化基因组DNA,提取哺乳动物细胞染色体DNA；⑵制备全部基因组的

DNA片断。

①机械断裂法:

用超声波或高速搅拌DNA溶液断裂片段两端没有与克隆载体匹配的粘末端，因此插入载体之前还需要进行修饰加工，少用②限制性内切酶降解（鸟枪法）

过去用EcoRⅠ,现在用Sau3A断裂片段两端有与克隆载体匹配的粘末端，可以直接与处理过

的载体连接。

⑶DNA片断与载体的连接包装常用载体：

粘性质粒λ噬菌体酵母人工染色体

①基因组DNA+粘性质粒——重组DNA——转化细菌——菌落

②基因组DNA+λ噬菌体——重组DNA—包装成噬菌体——感染细菌——噬菌斑

1个克隆含有基因组的某个片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和。

构建cDNA文库的意义？

常用载体及构建过程如何？

答：

过程：

1.制备mRNA1）取材：

mRNA约占总RNA的1－5％，所以应选用目的基因mRNA表达最丰富的组织细胞为材料来源，如获胰岛素基因，由应以胰岛β细胞为原始生物材料，细胞因子基因应选用经抗原或丝裂原刺激培养的淋巴细胞为材料；2）从总的RNA中分离mRNA：

将提取的mRNA在寡聚脱氧胸苷酸[oligo（dT）]纤维素中进行亲和层析

2.第一股cDNA合成1）以Oligo（dT）为引物：

从模板3’末端开始，沿模板的3’→5’方向合成,对于较长的mRNA分子很难得到全长cDNA；2）随机引物：

以6～8个核苷酸为随机引物，从mRNA的不同结合点合成全长cDNA第一链（RNA-DNA）

3.第二股cDNA的合成⑴自身引导法；⑵置换合成法；⑶外加引物合成法

4.cDNA与载体连接和导入宿主细胞

目的基因与载体的连接方法有哪些？

基因重组时在俩个酶切位点中其中有一个不相匹配时，你如何解决连接问题？

答：

连接方法：

㈠粘性末端的连接：

1．单酶切点的粘性末端（全同源性粘性末端）⑴高背景⑵双向插入,不能定向

2.双酶切片段的定向克隆①粘－粘非同源互补的粘性末端，重组方案中最有效简捷的途径。

②粘－平

㈡平端连接法：

1.同聚物加尾法；2.用衔接物连接法；3.适配子连接法（带有相应酶切点的粘性末端）；4.T－A克隆法TaqDNA聚合酶在扩增目的基因DNA的同时,能不依赖模板而在扩增产物两3’端加上两个游离的“A”。

重组DNA向受体细胞的导入方法有哪些？

答：

：

一.转化:

以质粒作为克隆载体将目的基因导入宿主细胞。

转化作用就是一种基因型细胞（感受态细菌）从周围介质中吸收来自另一种基因型细胞的DNA,进而使原来细胞的遗传基因和遗传性发生相应变化的现象。

常见转化方法有㈠原生质体转化法；㈡化学转化法；㈢电穿孔法。

㈠原生质体转化法:

除去细胞壁后加外源DNA，经吸收恢复再生培养，如枯草杆菌。

㈡化学转化法:

将对数生长期的细菌在0℃下,用预冷的CaCl2溶液低渗处理,以使菌体的细胞壁和细胞膜通透性增加,菌体膨胀成球形。

DNA易于进入细菌的细胞内。

㈢电穿孔法：

利用高压脉冲电场,在宿主细胞表面形成暂时性的微孔,质粒DNA可乘隙而入,在脉冲过后,微孔复原。

二、通过接合作用传递质粒DNA：

质粒由F+向F－菌的转移过程叫接合作用传递质粒,又称质粒的接合传递。

凡带有在染色体上整合F质粒的细菌又称高频重组株系（Hfr株系）。

Hfr株系不稳定，F质粒可发生接合传递质粒DNA,F+菌株可失去F质粒,F－菌也可获得F质粒,其转移难以人为控制,又不稳定，通常不用作克隆载体。

三、通过转染/转导作用传递遗传物质。

㈠转染：

病毒（含噬菌体）DNA及其重组子DNA导入宿主细胞（或细菌）的过程称转染。

㈡转导：

以噬菌体为媒介，将外源DNA导入细菌的过程称转导。

原理：

1.重组外源基因的噬菌体DNA,体外包装成噬菌体，感染宿主菌，同时导入外源基因。

2.噬菌体的主动感染将含有外源DNA片段的重组噬菌体DNA导入宿主菌体内。

2影响CaCl2转化率的因素有哪些？

答：

（1）选择合适的菌株；

（2）生长期的影响；（3）0°C放置时间的影响：

研究发现细菌经0°CCaCl2处理后转化率随时间的推移而增加，24h达最高转化率，而后转化率逐渐下降。

此法制备的感受态菌需新鲜制备，当天使用有效。

通常不采用4°C保存过久的感受态。

（4）其他，在CaCl2法的基础上，联合其他二价阳离子如Mn2+，Cu2+、用DMSO、还原剂和六氨基三氯化钴都能提高转化率。

如何利用LacZ标记基因筛选阳性克隆？

答：

答：

在LacZ体系中,是指二个彼此互补的突变基因（突变体1缺失LacZ近操作基因区段LacI；突变体2带有完整的近操纵基因而无β-半乳糖苷酶活性），它们编码产生的无活性的多肽产物，但由于二个突变体之间通过α肽互补作用可呈现有功能的β-半乳糖苷酶活性,进而可分解底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）而产生半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-氯-青定蓝,使菌落呈现出蓝色反应。

然而，当外源基因DNA片段插入载体中LacZα肽区段的多克隆位点后,就会阻断α序列的读码结构,使其编码的α肽失去活性,使重组子所在的细菌不能完成α-互补,因此带有外源基因重组子的细菌形成白色菌落。

根据这种β-半乳糖苷酶的显色反应，可以检测和筛选出携有外源基因重组子克隆。

此法又称蓝白筛选法

何谓寡核苷酸介导的点突变技术？

寡核苷酸介导的点突变技术基本上可分为两类：

用单链噬菌M13做载体的寡核苷酸引物诱变技术；另一类是用双链质粒做载体的盒式诱变技术。

寡核苷酸引物诱变技术：

用含突变碱基的引物启动M13噬菌体复制子代链，转染大肠杆菌后，子代噬菌体基因有50%发生突变，通过筛选、鉴定、回收可观察突变基因的表型改变效应。

盒式诱变：

是以各种双链质粒DNA做为载体，采用人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段置换改造基因中两个限