分子生物学课件重点整理朱玉贤.docx
《分子生物学课件重点整理朱玉贤.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子生物学课件重点整理朱玉贤.docx（56页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。
分子生物学课件重点整理朱玉贤
第二章染色体与DNA
染色体（chromosome）是细胞在有丝分裂时遗传物质存在的特定形式，是间期细胞染色质结构紧密包装的结果。
真核生物的染色体在细胞生活周期的大部分时间里都是以染色质（chromatin）的形式存在的。
染色质是一种纤维状结构，叫做染色质丝，它是由最基本的单位—核小体（nucleosome）成串排列而成的。
原核生物（prokaryote）：
DNA形成一系列的环状附着在非组蛋白上形成类核。
染色体由DNA和蛋白质组成。
蛋白质由非组蛋白和组蛋白（H1,H2A,H2B,H3,H4）
DNA和组蛋白构成核小体。
组蛋白的一般特性：
P24
①进化上的保守性
②无组织特异性
③肽链氨基酸分布的不对称性：
碱性氨基酸集中分布在N端的半条链上。
④组蛋白的可修饰性:
甲基化、乙基化、磷酸化及ADP核糖基化等。
⑤H5组蛋白的特殊性：
富含赖氨酸（24%）（鸟类、鱼类及两栖类红细胞染色体不含H1而带有H5）
组蛋白的可修饰性
在细胞周期特定时间可发生甲基化、乙酰化、磷酸化和ADP核糖基化等。
H3、H4修饰作用较普遍，H2B有乙酰化作用、H1有磷酸化作用。
所有这些修饰作用都有一个共同的特点，即降低组蛋白所携带的正电荷。
这些组蛋白修饰的意义：
一是改变染色体的结构，直接影响转录活性；二是核小体表面发生改变，使其他调控蛋白易于和染色质相互接触，从而间接影响转录活性。
2、DNA
1）DNA的变性和复性
■变性（Denaturation）DNA双链的氢键断裂，最后完全变成单链的过程称为变性。
■增色效应（Hyperchromaticeffect）在变性过程中，260nm紫外线吸收值先缓慢上升，当达到某一温度时骤然上升，称为增色效应。
■融解温度（Meltingtemperature，Tm）变性过程紫外线吸收值增加的中点称为融解温度。
生理条件下为85-95℃
影响因素：
G+C含量，pH值，离子强度，尿素，甲酰胺等
■复性（Renaturation）热变性的DNA缓慢冷却，单链恢复成双链。
■减色效应（Hypochromaticeffect）随着DNA的复性，260nm紫外线吸收值降低的现象。
2）C值反常现象（C-valueparadox）C值是一种生物的单倍体基因组DNA的总量。
真核细胞基因组的最大特点是它含有大量的重复序列，而且功能DNA序列大多被不编码蛋白质的非功能DNA所隔开，这就是著名的“C值反常现象”。
（四）核小体（nucleosome）：
用于包装染色质的结构单位，是由DNA链缠绕一个组蛋白核[（H2A、H2B、H3、H4）*2的八聚体】构成的。
1、原核生物基因组结构特点
●基因组很小，大多只有一条染色体
●结构简炼
●存在转录单元（trnascriptionaloperon）
●多顺反子（polycistron）
重叠基因由基因内基因、部分重叠基因、一个碱基重叠组成。
2、真核生物基因组结构特点
●真核基因组结构庞大3×109bp、染色质、核膜
●单顺反子
●基因不连续性断裂基因（interruptedgene）、内含子（intron）、外显子（exon）
●非编码区较多多于编码序列（9:
1）
●含有大量重复序列
■不重复序列/单一序列：
在基因组中有一个或几个拷贝。
真核生物的大多数基因在单倍体中都是单拷贝的。
如：
蛋清蛋白、血红蛋白等功能：
主要是编码蛋白质。
■中度重复序列：
在基因组中的拷贝数为101～104。
如：
rRNA、tRNA
一般是不编码蛋白质的序列，在调控基因表达中起重要作用
■高度重复序列：
拷贝数达到几百个到几百万个。
●卫星DNA：
A·T含量很高的简单高度重复序列。
1、DNA的一级结构：
指4种脱氧核苷酸的连接及其排列顺序，DNA序列是这一概念的简称。
碱基序列
2）特征：
●双链反向平行配对而成
●脱氧核糖和磷酸交替连接，构成DNA骨架，碱基排在内侧
●内侧碱基通过氢键互补形成碱基对（A：
T，C：
G）。
2、DNA的二级结构：
指两条多核苷酸链反向平行盘绕所产生的双螺旋结构。
2）分类：
右手螺旋：
A-DNA，B-DNA
左手螺旋：
Z-DNA
3、DNA的高级结构：
指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构。
是一种比双螺旋更高层次的空间构象。
2）主要形式：
超螺旋结构（正超螺旋和负超螺旋）
（一）DNA的半保留复制（semi-nservativereplication）
1、定义：
由亲代DNA生成子代DNA时，每个新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式称半保留复制。
3、DNA半保留复制的生物学意义：
DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性，保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代。
（二）与DNA复制有关的物质
1、原料：
四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）
2、模板：
以DNA的两条链为模板链，合成子代DNA
3、引物：
DNA的合成需要一段RNA链作为引物
4、引物合成酶（引发酶）：
此酶以DNA为模板合成一段RNA,这段RNA作为合成DNA的引物（Primer）。
实质是以DNA为模板的RNA聚合酶。
5、DNA聚合酶:
以DNA为模板的DNA合成酶
●以四种脱氧核苷酸三磷酸为底物
●反应需要有模板的指导
●反应需要有3-OH存在
●DNA链的合成方向为53
性质
聚合酶Ⅰ
聚合酶Ⅱ
聚合酶Ⅲ
3'5'外切活性
+
+
+
5'3'外切活性
+
-
-
5'3'聚合活性
+中
+很低
+很高
新生链合成
-
-
+
聚合酶Ⅰ主要是对DNA损伤的修复；以及在DNA复制时切除RNA引物并填补其留下的空隙。
聚合酶Ⅱ修复紫外光引起的DNA损伤
聚合酶ⅢDNA复制的主要聚合酶，还具有3→5’外切酶的校对功能，提高DNA复制的保真性
6、DNA连接酶（1967年发现）：
若双链DNA中一条链有切口，一端是3’-OH，另一端是5’-磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。
但是它不能将两条游离的DNA单链连接起来
DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用
7、DNA拓扑异构酶（DNATopisomerase）：
拓扑异构酶І：
使DNA一条链发生断裂和再连接，作用是松解负超螺旋。
主要集中在活性转录区，同转录有关。
例：
大肠杆菌中的ε蛋白
拓扑异构酶Ⅱ：
该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA，作用是将负超螺旋引入DNA分子。
同复制有关。
例：
大肠杆菌中的DNA旋转酶
8、DNA解螺旋酶/解链酶（DNAhelicase）：
通过水解ATP获得能量来解开双链DNA。
E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。
rep蛋白沿3’5’移动，而解螺旋酶I、II、III沿5’3’移动。
9、单链结合蛋白（SSBP-single-strandbindingprotein）：
稳定已被解开的DNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。
（三）DNA的复制过程（大肠杆菌为例）
⏹双链的解开
⏹RNA引物的合成
⏹DNA链的延伸
⏹切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段
1、双链的解开------ftju制有特定的起始位点，叫做复制原点。
ori（或o）、富含A、T的区段。
从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫复制子
复制时，解链酶等先将DNA的一段双链解开，形成复制点，这个复制点的形状象一个叉子，故称为复制叉
双链解开、复制起始P44
大约20个DnaA蛋白在ATP的作用下与oriC处的4个9bp保守序列相结合
在HU蛋白和ATP的共同作用下,Dna复制起始复合物使3个13bp直接重复序列变性,形成开链
解链酶六体分别与单链DNA相结合（需DnaC帮助）,进一步解开DNA双链
2、RNA引物的合成
DnaB蛋白活化引物合成酶，引发RNA引物的合成。
引物长度约为几个至10个核苷酸，
3、DNA链的延伸
DNA的半不连续复制（semi-discontinuousreplication）：
DNA复制时其中一条子链的合成是连续的，而另一条子链的合成是不连续的，故称半不连续复制。
在DNA复制时，合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链为前导链；合成方向与复制叉移动的方向相反，形成许多不连续的片段，最后再连成一条完整的DNA链为滞后链。
在DNA复制过程中，前导链能连续合成，而滞后链只能是断续的合成53的多个短片段，这些不连续的小片段称为冈崎片段。
4、切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段（复制终止）
当复制叉遇到约22个碱基的重复性终止子序列（Ter）时，Ter-Tus蛋白复合物能使DnaB不再将DNA解链，阻挡复制叉继续前移。
P47
在DNA聚合酶Ⅰ催化下切除RNA引物；留下的空隙由DNA聚合酶Ⅰ催化合成一段DNA填补上；在DNA连接酶作用下，连接相邻的DNA链
（四）复制的几种主要方式P42
1、双链环状、θ型复制、双向等速
2、滚环型：
（1）模板链和新合成的链分开;
（2）不需RNA引物，在正链3‘－OH上延伸
（3）只有一个复制叉;
3、D环复制---单向复制的特殊方式如：
动物线粒体DNA
（五）真核生物中DNA的复制特点
1、真核生物每条染色体上有多个复制起点，多复制子（约150bp左右）；
2、复制叉移动的速度较慢（约50bp／秒），仅为原核生物的1／10。
3、真核生物染色体在全部复制完之前,各个起始点不再重新开始DNA复制；真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。
4、真核生物有多种DNA聚合酶。
5、真核生物DNA复制过程中的引物及冈崎片段的长度均小于原核生物。
（真核冈崎片段长约100-200bp，原核冈崎片段长约1000-2000bp。
）
（六）原核和真核生物DNA的复制特点比较
1复制起点（ori）：
原核一个，真核多个；
2复制子：
原核一个，真核多个；
3复制子长度：
原核长；真核短；
4复制叉：
原核多个；真核多个；
5复制移动速度：
原核较快；真核较慢；
6真核生物染色体在全部完成复制前，各起始点的DNA复制不能再开始。
而在快速生长的原核生物中，复制起点上可以连续开始新的DNA复制。
7原核生物染色体的复制与细胞分裂同步，可以多次复制；真核生物染色体的复制发生在S期，是细胞分类的特定时期，而且仅此一次。
四、DNA的修复
DNA修复系统
功能
错配修复
恢复错配
碱基切除修复
切除突变的碱基
核甘酸切除修复
修复被破坏的DNA
DNA直接修复
SOS系统
修复嘧啶二体或甲基化DNA
DNA的修复，导致变异
1、错配修复（mismatchrepair）
●Dam甲基化酶使母链位于5’GATC序列中腺甘酸甲基化
●甲基化紧随在DNA复制之后进行（几秒种后至几分钟内）
●根据复制叉上DNA甲基化程度，切除尚未甲基化的子链上的错配碱基
2、碱基切除修复excisionrepair
所有细胞中都带有不同类型、能识别受损核苷酸位点的糖苷水解酶，它能特意切除受损核苷酸上的N-β-糖苷键，在DNA链上形成去嘌呤或去嘧啶位点，统称为AP位点。
一些碱基在自发或诱变下会发生脱酰胺，然后改变配对性质，造成氨基转换突变
*腺嘌呤变为次黄嘌呤与胞嘧啶配对
*鸟嘌呤变为黄嘌呤与胞嘧啶配对
*胞嘧啶变为尿嘧啶与腺嘌呤配对
3、核苷酸切除修复
1）通过特异的核酸内切酶识别损伤部位
2）由酶的复合物在损伤的两边切除几个核苷酸
3）DNA聚合酶以母链为模板复制合成新子链
4）DNA连接酶将切口补平
4、DNA的直接修复
在DNA光解酶的作用下将环丁烷胸腺嘧啶二体和6-4光化物还原成为单体
甲基转移酶使O6-甲基鸟嘌呤脱甲基生成鸟嘌呤，防止G-T配对
SOS反应（SOSresponse）：
是细胞DNA受到损伤或复制系统受到抑制的紧急情况下，细胞为求生存而产生的一种应急措施。
*包括诱导DNA损伤修复、诱变效应、细胞分裂的抑制以及溶原性细菌释放噬菌体等。
细胞癌变也与SOS反应有关。
两个作用
（1）DNA的修复；
（2）产生变异
五、DNA的转座
DNA的转座或叫移位（transposition）：
由可移位因子（transposableelement）介导的遗传物质重排现象。
转座子（transposonTn）：
存在于染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位。
已经发现“转座”这一命名并不十分准确，因为在转座过程中，可移位因子的一个拷贝常常留在原来位置上，在新位点上出现的仅仅是它的拷贝。
因此，转座有别于同源重组，它依赖于DNA复制。
原核生物转座子的类型：
1、插入序列（IS）
IS是最简单的转座子，不含有任何宿主基因，它们是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。
2、复合转座子（compositetransposon）
复合转座子是一类带有某些抗药性基因（或其他宿主基因）的转座子，其两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列
3、TnA家族
⏹TnA家族没有IS序列、体积庞大（5000bp以上）、带有3个基因，其中一个编码β-内酰胺酶（AmpR），另两个则是转座作用所必须的。
（三）转座作用的机制
⏹转座时发生的插入作用的普遍特征，是受体分子中有一段很短的（3～l2bp）、被称为靶序列的DNA会被复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。
⏹对于一个特定的转座子来说，它所复制的靶序列长度是一样的，如IS1两翼总有9个碱基对的靶序列，而Tn3两端总有5bp的靶序列。
⏹靶序列的复制可能起源于特定内切酶所造成的黏性DNA末端。
（三）转座作用的遗传学效应p63
（1）转座引起插入突变
（2）转座产生新的基因（3）转座产生的染色体畸变（4）转座引起的生物进化
反转录转座子（retrotransposon）：
指通过RNA为中介，反转录成DNA后进行转座的可动元件。
第三章生物信息的传递（上）——从DNA到RNA
转录（transcription）：
生物体以DNA为模板合成RNA的过程。
参与转录的物质
原料:
NTP（ATP,UTP,GTP,CTP）
模板:
DNA
酶:
RNA聚合酶
其他蛋白质因子
RNA合成方向：
5'到3'
转录的不对称性：
在RNA的合成中，DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。
与mRNA序列相同的那条DNA链称为编码链；将另一条根据碱基互补原则指导mRNA合成的DNA链称为模板链。
DNA分子上转录出RNA的区段，称为结构基因。
转录单元（transcriptionunit）一段从启动子开始至终止子结束的DNA序列。
二、参与转录起始的关键酶与元件
（一）RNA聚合酶
●原核生物RNA聚合酶（大肠杆菌为例）---全酶=核心酶+σ因子
亚基
基因
相对分子量
亚基数
组分
功能
α
rpoA
36500
2
核心酶
核心酶组装，
启动子识别
β
rpoB
151000
1
核心酶
β和β'共同形成
RNA合成的活性中心
β'
rpoC
155000
1
核心酶
ω
？
11000（需查）
1
核心酶
？
σ
rpoD
70000
1
σ因子
存在多种σ因子，
用于识别不同的启动子
真核细胞的三种RNA聚合酶特征比较
酶
位置
转录产物
相对活性
对α-鹅膏蕈碱的敏感性
RNA聚合酶Ⅰ
核仁
rRNA
50-70%
不敏感
RNA聚合酶Ⅱ
核质
hnRNA
20-40%
敏感
RNA聚合酶Ⅲ
核质
tRNA
约10%
存在物种特异性
RNA聚合酶与DNA聚合酶的区别
RNA聚合酶
DNA聚合酶
大小（M）
大，4.8×105dol
小，1.09×105dol
引物
无
有
产物
较短，游离
较长，与模板以氢键相连
作用方式
一条链的某一段
两条链同时进行
外切酶活性
无
5’3’，3’5’
校对合成能力
无
有
修复能力
无
有
（二）启动子（promoter）
启动子定义：
指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。
TATA区：
酶的紧密结合位点（富含AT碱基，利于双链打开）
TTGACA区：
提供了RNA聚合酶全酶识别的信号
转录起点---与新生RNA链第一个核甘酸相对应DNA链上的碱基。
真核生物启动子的结构
核心启动子（corepromoter）
●定义：
指保证RNA聚合酶Ⅱ转录正常起始所必需的、最少的DNA序列，包括转录起始位点及转录起始位点上游TATA区
●作用：
选择正确的转录起始位点，保证精确起始
2、上游启动子元件
●包括CAAT盒（CCAAT）和GC盒（GGGCGG）等
●作用：
控制转录起始频率。
（三）转录起始复合物---二元闭合复合物、二元开链复合物、三元复合物。
（原核）
三、转录的基本过程
1、起始位点的识别：
RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并与之相结合的过程。
RNA聚合酶全酶
（2）与模板结合
2、转录起始
①RNA聚合酶全酶
（2）与模板结合
•DNA双链解开
•在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物
5-pppG-OH+NTP5-pppGpN-OH3+ppi
转录起始复合物:
RNApol
（2）-DNA-pppGpN-OH3
3、RNA链的延伸
●亚基脱落，RNA–pol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；
●在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。
注意：
9个核苷酸以前还在启动子区，容易脱落，一旦形成9个以上的核苷酸并离开启动子区，转录正式进入眼神阶段。
4、转录终止
终止子（terminator）：
位于基因的末端，在转录终止点之前有一段回文序列（反向重复序列）约6-20bp。
真核生物终止:
由一段特定序列5′－AATAAA－3′和回文序列（反向重复序列）组成。
分为两类：
●强终止子－内部终止子：
不依赖Rho（ρ）因子的终止。
●弱终止子－需要ρ因子（rhofactor），又称为ρ依赖性终止子（Rho-dependentterminator）
不依赖因子的终止
当RNA链延伸到转录终止位点时，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯键，RNA-DNA杂合物分离，转录泡瓦解，DNA恢复成双链状态，而RNA聚合酶和RNA链都被从模板上释放出来，这就是转录的终止。
终止位点上游一般存在一个富含GC碱基的二重对称区，RNA形成发夹结构；
在终止位点前面有一段由4-8个A组成的序列，RNA的3’端为寡聚U
发夹式结构和寡聚U的共同作用使RNA从三元复合物中解离出来。
依赖因子的终止
因子：
六聚体蛋白、水解各种核甘三磷酸促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。
（二）、真核生物的转录过程
1.转录起始
真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化，转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，其起始过程比原核生物复杂。
（1）.转录起始前的上游区段
•顺式作用元件（cis-actingelement）：
影响自身基因表达活性的非编码DNA序列。
例：
启动子、增强子、弱化子等
•增强子：
在启动区存在的能增强或促进转录的起始的DNA序列。
但不是启动子的一部分。
特点：
1.远距离效应；2.无方向性；3.顺式调节；4.无物种和基因的特异性；5.具有组织特异性；6.有相位性；7.有的增强子可以对外部信号产生反应。
（2）.转录因子：
能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，现已发现数百种，统称为反式作用因子（trans-actingfactors）。
反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的，则称为转录因子（transcriptionalfactors,TF）。
参与RNA-polⅡ转录的TFⅡ--TFⅡD、TFⅡA、TFⅡB、TFⅡF、TFⅡE、TFⅡH
（3）转录起始前复合物（pre-initiationcomplex,PIC）
真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子。
（4）模板理论（piecingtheory）
一个真核生物基因的转录需要3至5个转录因子。
转录因子之间互相结合，生成有活性、有专一性的复合物，再与RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。
2.转录延伸
真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。
RNA-pol前移处处都遇上核小体。
转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。
3.转录终止——和转录后修饰密切相关。
四、转录后加工
5’端加帽、3’端加尾、RNA的剪接、RNA的编辑
1、在5’端加帽
5’端的一个核苷酸总是7-甲基鸟核苷三磷酸（m7Gppp）。
mRNA5’端的这种结构称为帽子（cap）。
帽子结构功能：
①能被核糖体小亚基识别，促使mRNA和核糖体的结合；
②m7Gppp结构能有效地封闭mRNA5’末端，以保护mRNA免受5’核酸外切酶的降解，增强mRNA的稳定。
2、3’端加尾--多聚腺苷酸尾巴---AAUAAA：
★准确切割。
。
★加poly（A）
多聚腺苷酸尾巴功能：
提高了mRNA在细胞质中的稳定性。
3、RNA的剪接
生物体内内含子的主要类型：
U-AG、AU-AC、Ⅰ类内含子、Ⅱ类内含子Ⅲ类内含子
参与RNA剪接的物质：
snRNA（核内小分子RNA）、snRNP（与snRNA结合的核蛋白）、核内RNA（U1、U2、U4、U5、U6）
4、RNA的编辑
*编辑（editing）是指转录后的RNA在编码区发生碱基的突变、加入或丢失等现象。
五、原核生物与真核生物mRNA的特征比较
1、原核生物mRNA的特征
●半衰期短
●多以多顺反子的形式存在
单顺反子mRNA：
只编码一个蛋白质的mRNA。
多顺反子mRNA：
编码多个蛋白质的mRNA。
Z：
β-半乳糖苷酶Y：
透过酶A：
乙酰基转移酶
ZYA为结构基因
●5’端无“帽子”结构，3’端没有或只有较短的poly（A）结构。
●SD序列：
原核生物起始密码子AUG上游7-12个核苷酸处有一被称为SD序列的保守区。
mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。
P85
2、真核生物mRNA的特征
“基因”的分子生物学定义：
产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核甘酸序列。
●5’端存在“帽子”结构
●多数mRNA3’端具有poly（A）尾巴（组蛋白除外）
●以单顺反子的形式存在
六、RNA合成与DNA合成异同点
相同点：
1、都以DNA链作为模板
2、合成的方向均为5’→3’
3、聚合反应均是通过核苷酸之间形成的3’,5’-磷酸二酯键，使核苷酸链延长。
不同点：
复制
转录
模板
两条链均复制
模板链转录
（不对称转录）
原料
dNTP
NTP
酶
DNA
升级会员 