有机化合物的分离和提纯方法.docx

有机化合物的分离和提纯方法.docx

《有机化合物的分离和提纯方法.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《有机化合物的分离和提纯方法.docx（12页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

有机化合物的分离和提纯方法

有机化合物的分离和提纯

三、色谱法新固定相的研究

检测方法的研究

1.专家系统

2.色谱新方法

色谱法chromatography

色谱法又称“色谱分析”、“色谱分析法”、“层析法”，是一种分离和分析方法，在分析化学、有机化学、生物化学等领域有着非常广泛的应用。

色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。

色谱法起源于20世纪初，1950年代之后飞速发展，并发展出一个独立的三级学科-色谱学。

历史上曾经先后有两位化学家因为在色谱领域的突出贡献而获得诺贝尔化学奖，此外色谱分析方法还在12项获得诺贝尔化学奖的研究工作中起到关键作用。

历史

色谱法从二十世纪初发明以来，经历了整整一个世纪的发展到今天已经成为最重要的分离分析科学，广泛地应用于许多领域，如石油化工、有机合成、生理生化、医药卫生、环境保护，乃至空间探索等。

将一滴含有混合色素的溶液滴在一块布或一片纸上，随着溶液的展开可以观察到一个个同心圆环出现，这种层析现象虽然古人就已有初步认识并有一些简单的应用，但真正首先认识到这种层析现象在分离分析方面具有重大价值的是俄国植物学家Tswett。

Tswett关于色谱分离方法的研究始于1901年，两年后他发表了他的研究成果"一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用，提出了应用吸附原理分离植物色素的新方法。

三年后，他将这种方法命名为色谱法（Chromatography），很显然色谱法（Chromatography）这个词是由颜色（chrom）和图谱（graph）这两个词根组成的，派生词有chromatograph（色谱仪），chromatogram（色谱图），chromatographer（色谱工作者）等。

由于Tswett的开创性工作，因此人们尊称他为"色谱学之父"，而以他的名字命名的Tswett奖也成为了色谱界的最高荣誉奖。

色谱法发明后的最初二三十年发展非常缓慢。

液-固色谱的进一步发展有赖于瑞典科学家Tiselius（1948年NobelChemistryPrize获得者）和Claesson的努力，他们创立了液相色谱的迎头法和顶替法。

分配色谱是由著名的英国科学家Martin和Synge创立的，他们因此而获得1952年的诺贝尔化学奖。

1941年，Martin和Synge采用水分饱和的硅胶为固定相，以含有乙醇的氯仿为流动相分离乙酰基氨基酸，他们在这一工作的论文中预言了用气体代替液体作为流动相来分离各类化合物的可能性。

1951年，Martin和James报道了用自动滴定仪作检测器分析脂肪酸，创立了气-液色谱法；1958年，Golay首先提出了分离效能极高的毛细管柱气相色谱法，发明了玻璃毛细管拉制机，从此气相色谱法超过最先发明的液相色谱法而迅速发展起来，今天常用的气相色谱检测器也几乎是在五十年代发展起来的。

七十年代发明了石英毛细管柱和固定液的交联技术。

随着电子技术和计算机技术的发展气相色谱仪器也在不断发展完善中，到现在最先进的气相色谱仪已实现了全自动化和计算机控制，并可通过网络实现远程诊断和控制。

色谱的起源

色谱法起源于20世纪初，1906年俄国植物学家米哈伊尔·茨维特用碳酸钙填充竖立的玻璃管，以石油醚洗脱植物色素的提取液，经过一段时间洗脱之后，植物色素在碳酸钙柱中实现分离，由一条色带分散为数条平行的色带。

由于这一实验将混合的植物色素分离为不同的色带，因此茨维特将这种方法命名为Хроматография，这个单词最终被英语等拼音语言接受，成为色谱法的名称。

汉语中的色谱也是对这个单词的意译。

　　茨维特并非著名科学家，他对色谱的研究以俄语发表在俄国的学术杂志之后不久，第一次世界大战爆发，欧洲正常的学术交流被迫终止。

这些因素使得色谱法问世后十余年间不为学术界所知，直到1931年德国柏林威廉皇帝研究所的库恩将茨维特的方法应用于叶红素和叶黄素的研究，库恩的研究获得了广泛的承认，也让科学界接受了色谱法，此后的一段时间内，以氧化铝为固定相的色谱法在有色物质的分离中取得了广泛的应用，这就是今天的吸附色谱。

分配色谱的出现和色谱方法的普及

1938年阿切尔·约翰·波特·马丁和理查德·劳伦斯·米林顿·辛格准备利用氨基酸在水和有机溶剂中的溶解度差异分离不同种类的氨基酸，马丁早期曾经设计了逆流萃取系统以分离维生素，马丁和辛格准备用两种逆向流动的溶剂分离氨基酸，但是没有获得成功。

后来他们将水吸附在固相的硅胶上，以氯仿冲洗，成功地分离了氨基酸，这就是现在常用的分配色谱。

在获得成功之后，马丁和辛格的方法被广泛应用于各种有机物的分离。

1943年马丁以及辛格又发明了在蒸汽饱和环境下进行的纸色谱法。

1952年马丁和詹姆斯提出用气体作为流动相进行色谱分离的想法，他们用硅藻土吸附的硅酮油作为固定相，用氮气作为流动相分离了若干种小分子量挥发性有机酸。

高效液相色谱

1960年代，为了分离蛋白质、核酸等不易汽化的大分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。

1960年代末科克兰、哈伯、荷瓦斯、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱的时代。

高效液相色谱使用粒径更细的固定相填充色谱柱，提高色谱柱的塔板数，以高压驱动流动相，使得经典液相色谱需要数日乃至数月完成的分离工作得以在几个小时甚至几十分钟内完成。

　　1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一书，标志着高效液相色谱法（HPLC）正式建立。

在此后的时间里，高效液相色谱成为最为常用的分离和检测手段，在有机化学、生物化学、医学、药物开发与检测、化工、食品科学、环境监测、商检和法检等方面都有广泛的应用。

高效液相色谱同时还极大的刺激了固定相材料、检测技术、数据处理技术以及色谱理论的发展。

原理

色谱过程的本质是待分离物质分子在固定相和流动相之间分配平衡的过程，不同的物质在两相之间的分配会不同，这使其随流动相运动速度各不相同，随着流动相的运动，混合物中的不同组分在固定相上相互分离。

根据物质的分离机制，又可以分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱等类别。

离子交换色谱

　　离子色谱分析法出现在20世纪70年代，80年代迅速发展起来，以无机、特别是无机阴离子混合物为主要分析对象。

　　离子交换色谱利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。

离子交换色谱的固定相一般为离子交换树脂，树脂分子结构中存在许多可以电离的活性中心，待分离组分中的离子会与这些活性中心发生离子交换，形成离子交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配。

固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相互争夺固定相中的离子交换中心，并随着流动相的运动而运动，最终实现分离。

柱色谱

　　柱色谱法是最原始的色谱方法，这种方法将固定相注入下端塞有棉花或滤纸的玻璃管中，将被样品饱和的固定相粉末摊铺在玻璃管顶端，以流动相洗脱。

常见的洗脱方式有两种，一种是自上而下依靠溶剂本身的重力洗脱，一种是自下而上依靠毛细作用洗脱。

收集分离后的纯净组分也有两种不同的方法，一种方法是在柱尾直接接受流出的溶液，另一种方法是烘干固定相后用机械方法分开各个色带，以合适的溶剂浸泡固定相提取组分分子。

柱色谱法被广泛应用于混合物的分离，包括对有机合成产物、天然提取物以及生物大分子的分离。

薄层色谱

薄层色谱法是应用非常广泛的色谱方法，这种色谱方法将固定相图布在金属或玻璃薄板上形成薄层，用毛细管、钢笔或者其他工具将样品点染于薄板一端，之后将点样端浸入流动相中，依靠毛细作用令流动相溶剂沿薄板上行展开样品。

薄层色谱法成本低廉操作简单，被用于对样品的粗测、对有机合成反应进程的检测等用途。

　　气相色谱

　　气相色谱是机械化程度很高的色谱方法，气相色谱系统由气源、色谱柱和柱箱、检测器和记录器等部分组成。

气源负责提供色谱分析所需要的载气，即流动相，载气需要经过纯化和恒压的处理。

气相色谱的色谱柱一般直径很细长度很长，根据结构可以分为填充柱和毛细管柱两种，填充柱比较短粗，直径在5毫米左右，长度在2－4米之间，外壳材质一般为不锈钢，内部填充固定相填料；毛细管柱由玻璃或石英制成，内径不超过0.5毫米，长度在数十米到一百米之间，柱内或者填充填料或者图布液相的固定相。

柱箱是保护色谱柱和控制柱温度的装置，在气相色谱中，柱温常常会对分离效果产生很大影响，程序性温度控制常常是达到分离效果所必须的，因此柱箱扮演了非常重要的角色。

检测器是气相色谱带给色谱分析法的新装置，在经典的柱色谱和薄层色谱中，对样品的分离和检测是分别进行的，而气相色谱则实现了分离与检测的结合，随着技术的进步，气相色谱的检测器已经有超过30种不同的类型。

记录器是记录色谱信号的装置，早期的气相色谱使用记录纸和记录器进行记录，现在记录工作都已经依靠计算机完成，并能对数据进行实时的化学计量学处理。

气相色谱被广泛应用于小分子量复杂组分物质的定量分析。

高效液相色谱

　　高效液相色谱（HPLC）是目前应用最多的色谱分析方法，高效液相色谱系统由流动相储液体瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成，其整体组成类似于气相色谱，但是针对其流动相为液体的特点作出很多调整。

HPLC的输液泵要求输液量恒定平稳；进样系统要求进样便利切换严密；由于液体流动相粘度远远高于气体，为了减低柱压高效液相色谱的色谱柱一般比较粗，长度也远小于气相色谱柱。

HPLC应用非常广泛，几乎遍及定量定性分析的各个领域。

应用

色谱法的应用可以根据目的分为制备性色谱和分析性色谱两大类。

　　制备性色谱的目的是分离混合物，获得一定数量的纯净组分，这包括对有机合成产物的纯化、天然产物的分离纯化以及去离子水的制备等。

相对于色谱法出现之前的纯化分离技术如重结晶，色谱法能够在一步操作之内完成对混合物的分离，但是色谱法分离纯化的产量有限，只适合于实验室应用。

　　分析性色谱的目的是定量或者定性测定混合物中各组分的性质和含量。

定性的分析性色谱有薄层色谱、纸色谱等，定量的分析性色谱有气相色谱、高效液相色谱等。

色谱法应用于分析领域使得分离和测定的过程合二为一，降低了混合物分析的难度缩短了分析的周期，是目前比较主流的分析方法。

在中华人民共和国药典中，共有超过约600种化学合成药和超过约400种中药的质量控制应用了高效液相色谱的方法。

（一）薄层色谱法（thinlayerchromatography,TLC）

薄层色谱法系将试品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，使试品所含成分分离，所得色谱图与适宜的对照物按同法所得的色谱图对比，并可用薄层扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测定。

《中国药典》（2005年版）一部薄层色谱法用于定性鉴别的达1523项，用于含量测定的为45项，其中有4种药材采用薄层扫描法定量。

1.操作方法

（1）薄层板有市售薄层板（普通或高效板）和自制薄层板，可根据需要选用。

（2）点样通常在洁净干燥的环境，用专用毛细管或配合相应的半自动或自动点样器械将样品点样于薄层板上，一般为圆点状或窄细的条带状，点样基线距底边10～15mm，高效板一般基线距底边8～10mm。

圆点状直径一般不大于3mm，高效板一般不大于2mm；接触点样时注意勿损伤薄层板表面。

条带状宽度一般为5～l0mm。

高效板条带宽度一般为4～8mm，可用专用半自动或自动点样器械喷雾法点样。

点间距离可视斑点扩散情况以相邻斑点互不干扰为宜，一般不少于8mm，高效板供试品间隔不少于5mm。

（3）展开将点好供试品的薄层板放入展开缸中，浸入展开剂的深度为距原点5mm为宜，密闭。

除另有规定外，一般上行展开8～15cm，高效薄层板上行展开5～8cm。

溶剂前沿达到规定的展距，取出薄层板，晾干，待检测。

展开前如需要溶剂蒸气预平衡，可在展开缸中加入适量的展开剂，密闭，一般保持15～30分钟。

溶剂蒸气预平衡后，应迅速放入载有供试品的薄层板，立即密闭，展开。

如需使展开缸达到溶剂蒸气饱和的状态，则须在展开缸的内侧放置与展开缸内径同样大小的滤纸，密闭一定时间，使达到饱和再如法展开。

必要时，可进行二次展开或双向展开。

（4）显色与检视供试品含有可见光下有颜色的成分可直接在日光下检视，也可用喷雾法或浸渍法以适宜的显色剂显色或加热显色，在日光下检视。

有荧光的物质或遇某些试剂可激发荧光的物质可在365nm紫外光灯下观察荧光色谱。

对于可见光下无色，但在紫外光下有吸收的成分可用带有荧光剂的硅胶板（如硅胶GF254板），在254nm紫外光灯下观察荧光板面上的荧光猝灭物质形成的色谱。

（5）记录薄层色谱图像一般可采用摄像设备拍摄，以光学照片或电子图像的形式保存。

也可用薄层扫描仪扫描记录相应的色谱图。

3.测定法

（1）鉴别取适宜浓度的对照品溶液与供试品溶液，在同一薄层板上点样、展开与检视，供试品溶液所显主斑点的颜色（或荧光）和位置应与对照溶液的斑点一致。

（2）限度检查采用与定量配制的对照品对照或对照品稀释对照。

供试品溶液色谱中待检查的斑点与相应的对照品溶液或系列对照品溶液的相应斑点比较，颜色（或荧光）不得更深；或照薄层色谱扫描法操作，峰面积值不得大于对照品的峰面积值。

（3）含量测定照薄层色谱扫描法，测定供试品中相应成分的含量。

（二）高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography,HPLC）

高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。

注入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。

高效液相色谱法具有分离效能高、分析速度快、重现性好、准确度和灵敏度高等优点，其应用范围之广，是其它分析仪器所不能比拟的。

随着仪器的普及和蒸发光散射检测器、质谱检测器的商品化，本法已成为生药含量测定的首选和主流方法。

《中国药典》（2005年版）一部应用高效液相色谱法测定含量的中药品种达479种，涉及518项，其中药材就有98种。

1.对仪器的一般要求

（1）色谱柱最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。

反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶（如氰基硅烷键合相和氨基硅烷键合相等）也有使用。

正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。

离子交换填充剂用于离子交换色谱；凝胶或高分子多孔微球等填充剂用于分子排阻色谱等；手性键合填充剂用于对映异构体的拆分分析。

填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、比表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等）以及色谱柱的填充，直接影响待测物的保留行为和分离效果。

孔径在15nm（1nm=l0?

）以下的填充剂适合于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填充剂。

以硅胶为载体的一般键合固定相填充剂适用pH2～8的流动相。

当pH大于8时，载体硅胶会被溶解；当pH小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。

当色谱系统中需使用pH大于8的流动相时，应选用耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶、包覆聚合物填充剂、有机-无机杂化填充剂或非硅胶填充剂等；当需使用pH小于2的流动相时，应选用耐酸的填充剂，如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶、有机-无机杂化填充剂等。

这些特殊的色谱柱已有商品供应。

（2）检测器最常用的检测器为紫外检测器（ultravioletdetector,UVD），其他常见的检测器有二极管阵列检测器（diodearraydetector,DAD）、荧光检测器（fluorescencedetector,FLD）、示差折光检测器（refractiveindexdetector,RID）、蒸发光散射检测器（evaporativelight-scatteringdetector,ELSD）、电化学检测器（electrochemicaldetector,ECD）和质谱检测器（massspectrometricaldetector,MSD）等。

紫外、二极管阵列、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与待测溶液的浓度有关，还与化合物的结构有关。

示差折光检测器和蒸发光散射检测器为通用型检测器，对所有的化合物均有响应；蒸发光散射检测器对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与待测物的质量有关。

二极管阵列检测器可以同时记录待测物在规定波长范围内的吸收光谱，故可用于待测物的光谱测定和色谱峰的纯度检查。

紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与待测溶液的浓度在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器响应值与待测溶液的浓度通常并不呈线性关系，必要时需对响应值进行数学转换后进行计算。

不同的检测器，对流动相的要求不同。

如采用紫外检测器，所用流动相应至少符合紫外-可见分光光度法对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机相中有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。

蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不允许使用含不挥发盐组分的流动相。

（3）流动相可采用固定比例（等度洗脱）或按规定程序改变比例（梯度洗脱）的溶剂组成作为流动相系统。

由于C-18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低于5％，否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定。

3.测定法

（1）内标法加校正因子测定供试品中某个成分含量精密称（量）取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子测定用的对照品溶液。

取一定量注入仪器，记录色谱图。

测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子：

校正因子（f）=式（3-8）

式中As为内标物质的峰面积或峰高；AR为对照品的峰面积或峰高；CS为内标物质溶液的浓度；CR为对照品溶液的浓度。

再取含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品中待测成分和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量：

含量（Cx）=f×式（3-9）

式中Ax为供试品峰面积或峰高；Cx为供试品溶液的的浓度；A′s为内标物质的峰面积或峰高；C′s为内标物质的浓度。

f为校正因子。

当配制校正因子测定用的对照品溶液和含有内标物质的供试品溶液，使用等量同一浓度的内标物质溶液时，Cs=C′s，则配制内标物质溶液不必精密称（量）取。

（2）外标法测定供试品中某个成分含量精密称（量）取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图。

由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定供试品中某成分含量时，以定量环或自动进样器进样为好。

（3）面积归一化法是测量色谱图上某色谱峰和除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算某色谱峰占总面积的百分率。

该法通常用于对照品纯度的检查。

高效液相色谱法样品进样前的溶液应澄清，通常需经微孔滤膜（0.45μm）滤过。

（三）气相色谱法（gaschromatography,GC）

气相色谱法系采用气体为流动相（载气）流经装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。

物质或其衍生物气化后，被载气带入色谱柱进行分离，各组分先后进入检测器，用记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。

气相色谱法对含挥发性成分的生药应用较广，精密度高，分离效果比薄层色谱好，但所得数据只有保留时间，多数情况下是在高温下进行，若成分不气化，就不能进行分析，故应用范围受到限制。

虽可通过衍生化法或应用特殊色谱柱分析不易挥发的成分，但远不如高效液相色谱方便、准确。

《中国药典》（2005年版）气相色谱法用于中药分析的品种有47种，其中有4种药材用此法定量。

另外还有两种药材的农药残留也是用GC法分析。

1.对仪器的一般要求

气相色谱仪由载气源、进样部分、色谱柱、柱温箱、检测器和数据处理系统组成。

进样部分、色谱柱和检测器的温度均在控制状态。

（1）载气源气相色谱法的流动相为气体，称为载气，氦、氮和氢可用作载气，可由高压钢瓶或高纯度气体发生器提供，经过适当的减压装置，以一定的流速经过进样器和色谱柱；根据供试品的性质和检测器种类选择载气，常用载气为氮气。

（2）进样部分进样方式一般可采用溶液直接进样或顶空进样。

溶液直接进样采用微量注射器、微量进样阀或有分流装置的气化室进样；采用溶液直接进样时，进样口温度应高于柱温30～50℃；进样量一般不超过数微升；柱径越细，进样量应越少，采用毛细管柱时，一般应分流以免过载。

顶空进样适用于固体和液体供试品中挥发性组分的分离和测定。

将固态或液态的供试品制成供试液后置于密闭小瓶中，在恒温控制的加热室中加热至供试品中挥发性组分在非气态和气态达至平衡后，由进样器自动吸取一定体积的顶空气注入色谱柱中。

（3）色谱柱色谱柱为填充柱或毛细管柱。

填充柱的材质为不锈钢或玻璃，内径为2~4mm，柱长为2~4m，内装吸附剂、高分子多孔小球或涂渍固定液的载体，粒径为0.25~0.18mm、0.18~0.15mm或0.15~0.125mm。

常用载体为经酸洗并硅烷化处理的硅藻土或高分子多孔小球，常用固定液有甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。

毛细管柱的材质为玻璃或石英，内壁或载体经涂渍或交联固定液，内径一般为0.25mm、0.32mm或0.53mm，柱长5~60m，固定液膜厚0.1~5.0μm，常用的固定液有甲基聚硅氧烷、不同比例组成的苯基甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。

新填充柱和毛细管柱在使用前需老化以除去残留溶剂及低分子量的聚合物，色谱柱如长期未用，使用前应老化处理，使基线稳定。

（4）柱温箱由于柱温箱温度的波动会影响色谱分析结果的重现性，因此柱温箱控温精度应在±l℃，且温度波动小于每小时0.1℃。

温度控制系统分为恒温和程序升温两种。

（5）检测器适合气相色谱法的检测器有火焰离子化检测器（flameionizationdetector,FID）、热导检测器（thermalconductivitydetector,TCD）、氮磷检测器（nitrogen-phosphorusdetector,NPD）、火焰光度检测器（flamephotometricdetector,FPD）、电子捕获检测器（electroncapturedetector,ECD）、质谱检测器（massspectrometricdetector,MSD）等。

火焰离子化检测器对碳氢化合物响应良好，适合检测大多数的化合物；氮磷检测器对含氮、磷元素的化合物灵敏度高；火焰光度检测器对含磷、硫元素的化合物灵敏度高；电子捕获检测器适于含卤素的化合物；质谱检测器能给出供试品某个成分相应的结构信息，可用于结构确证。

常用检测器为火焰离子化检测器，用氢气作为燃气，空气作为助燃气，在使用火焰离子化检测器时，检测器温度一般应高于柱温，并不得低于150℃，以免水汽凝结，通常为250～