有机化合物分离纯化策略.ppt

有机化合物分离纯化策略.ppt

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AutomatedFlashChromatographyApplicationsFlash快速色谱在天然化学和有机合成的应用,UniversalTechnology环球（香港）科技有限公司,2,概述,分离纯化的概念分离：

混合物或混合体目的物（单体或混合物）纯化：

目的物含量较高（90%）的混合物目的物单体或纯品分离纯化：

去除杂质，逐步获得提高目的物纯度或含量的过程,3,分离纯化的目的和意义,1.分子结构研究2.生物活性研究3.作为衍生物合成合成的原料4.直接应用：

医药、农药、兽药、植物生长活性物质、食品添加剂、化妆品、化工原料等。

4,有机化合物分离纯化的基本技术,萃取技术液液萃取技术液固萃取技术结晶与重结晶技术色谱技术纸色谱薄层色谱柱色谱蒸馏与精馏技术普通蒸馏减压蒸馏精馏干燥技术,5,TELEDYNEISCO,TeledyneIsco是全自动快速制备色谱技术的开创者，在1997年引入CombiFlash生产线，用于有机物提纯的全自动快速制备色谱的研发与生产，Isco最先推出多样品并行和顺序工作系统，在药物开发和天然产物领域的分离工作取得了突出的进展。

6,各种制备型液相色谱：

快速色谱（约2bar/30psi）低压液相（20bar/300psi）彼此压力范围会有交叠,7,制备型液相色谱的关键因素,分辨率,速度,载样量,对某一个参数进行优化会影响其他分离参数：

增加洗脱液的流速会降低分辨率。

分辨率会因为上样量过大而下降。

色谱柱的载样量又取决于柱子的直径、长度，吸附剂的颗粒度及装柱的紧密程度。

填料,提高纯化的策略,梯度选择上样量填料上样方法RediSep色谱柱,9,O,O,N,H,O,N,M,e,O,M,e,O,O,N,H,O,N,M,e,O,M,e,Cbz-Phe-WeinrebAmide（B）,Cbz-Val-WeinrebAmide（A）,30%EtOAcinHeptane,Rf,A,=0.18,Rf,B,=0.10,CourtesyofHoechstMarionRoussel,纯化优化:

梯度的优点,10,20%,EtOAc,in,Heptane,30%,EtOAc,in,Heptane,25%,EtOAc,in,Heptane,Rf,A,=0.18,Rf,B,=0.098,Rf,A,=0.13,Rf,B,=0.08,Rf,A,=0.09,Rf,B,=0.026,等梯度分离,在12克柱分离后从每个收集管中取样分析,11Pure,11PureFractions,5PureFractions,1Impure,5Pure,3PureFractions,3Impure,4Pure,CourtesyofHoechstMarionRoussel,11,梯度程序对分离的影响,200mg样品12g柱,连续梯度,0,5,10,15,20,25,30,35,0,10,20,30,Time（min.）,%ofEtOAcin,Heptane,16个,PureCompounds,CourtesyofHoechstMarionRoussel,纯化优化,实例研究:

3种不同极性物质的分离,13,Isocratic20%ethylacetateinhexane,14,Isocratic30%ethylacetateinhexane,15,Isocratic50%ethylacetateinhexane,16,Isocratic70%ethylacetateinhexane,17,TLCTellsUs,20%EthylAcetate:

Topspotisolation30%EthylAcetate:

Secondspotisolation50%EthylAcetate:

Bottomspotisolation,18,TLC,TLC主要回答两个问题什么样的溶剂和固定相可以纯化该化合物？

什么浓度的溶剂组合可以成功分离该化合物?

19,使用线性梯度洗脱,20,梯度的好处,由于物质在最佳的极性位置被洗脱，所以峰形更尖提高了纯度提高的色谱柱上样量,21,使用梯度的原则,用TLC进行方法研究试验选择具有最佳选择性的溶剂系统分离前无需知道确切的溶剂系统浓度从尽可能低的浓度开始梯度洗脱以确保不丢失目标物质,22,利用薄层Rf进行梯度设定,Clickon“RftoGradient”tab,23,24,25,上样量问题,RediSep12g柱的上样量,在10%上样量时峰变宽和保留时间延长十分明显,0.5%上样量，即0.06g,26,色谱柱上样量,27,梯度时间vs.分辨率,0,5,10,15,Minutes,1volume,2.5volumes,5volumes,10volumes,20volumes,可以控制梯度的时间（洗脱体积）以保证最高纯度的同时减少分离过程的时间,28,SuggestedMethodDevelopmentProcess,常用分离条件-固定相和流动相的选择,29,Usefultactics:

Ifstep1and2dontshowanymigration,gotostep5如果采用方法1和2样品没有任何移动，则采用方法5Ifstep1and2showstreakingspots,gotostep6如果1和2出现拖尾现象则采用6IfyourcompounddoesnotabsorbintheUV（non-chromophoresample）,gotostep5andworkat214nm如果1和2中没有紫外吸收，采用6选择波长214nm,IdentifyingOptimalPurificationConditions（方法选择原则）,30,MobilePhaseOptions流动相选择,Standardsolventsystems标准溶剂系统:

EtOAc/hexaneorheptaneMeOH/DCMConsideralternativesolventsystemse可选择的溶剂系统:

MTBE（甲基数丁基醚）/hexaneallows214nmdetectionIPA（异丙醇）/hexanea“green”solventsystem（suitablealternativetoMeOH/DCMandfullycompatiblewithsilicagelupto100%IPA）,31,固定相选择,氨基取代碱性氧化铝中性氧化铝酸性氧化铝Florisil硅酸镁,氰基取代双羟基（双醇）强阴离子交换（SAX）强阳离子交换（SCX）,正相硅胶C18反相硅胶,32,RediSep正相硅胶柱,微酸性介质活性基团Si-OH氢离子很容易解离实际活性基团Si-O-使用寿命较短，通常用于一次柱硅胶适用于分离低-中等极性化合物，而非极性化合物在硅胶板上吸附较弱，分离较差不同物质与固定相之间的吸附力不同；不同物质在溶剂流动相中的溶解度不同,33,正相硅胶的不足,正相硅胶的酸性pH可能会使酸性或碱性物质的分离困难要求对流动相进行修饰碱性物质用TEA酸性物质用AcOH从TLC到柱色谱重现性不好修饰引起额外的不便分离前必须先更换和冲填溶剂分离后必须去除TEA和AcOH用适当的溶剂进行额外的抽提和洗涤将混合物浓缩至油状，放在真空中过夜修饰剂可能与化合物反应,34,RediSepC-18反相柱,用于纯化中等至高极性物质:

碳水化合物,酸性化合物,肽类,杂环化合物,离子化合物典型溶剂系统:

Water/Acetonitrile,Water/Methanol需要更长的平衡时间流速比正相柱低如果未变干而且保存在80%有机溶剂+20%水溶液中，可重复使用物质的分离是依靠不同的物质在固定相和流动相之间以不同的分配系数（K）连续不断地形成分配平衡而实现的，不随流动相的移动而移动。

35,卤素取代化合物的分离,4gRediSep正相柱洗脱溶剂:

Hexane/EtOAc,36,卤素取代化合物的分离,4.3gRediSepC-18反相柱洗脱溶剂:

Water/Methanol,其他介质,特殊介质,38,RediSep碱性氧化铝,碱性固定相无需流动相修饰剂用于纯化有碱性特性的化合物,39,RediSep中性氧化铝,用于纯化对酸敏感的化合物,40,RediSepAminecolumn,氨基基团连接在硅上，取代酸基团碱性固定相不需使用TEA减少了由于酸/碱反应引起的副反应对于含有碱性组分的化合物有更好的分离效果既可用于正相，又可用于反相条件无需从组分中去除溶剂，减少了过程时间,41,碱性化合物的分离,4gNormalPhaseRediSepColumnSolvents:

Hexane/EtOAc,42,碱性化合物的分离,4.7gAmineRediSepColumnSolvents:

Hexane/EtOAc,43,氨基取代介质,溶剂-Hexanes,EthylAcetate,MethyleneChloride,Chloroform,Methanol,Ethanol,Isopropanol,Water,Acetonitrile装样量-1%10%如果目标化合物具有碱性功能基团如果不使用时保存在异丙醇中，可重复使用,44,碱性化合物的分离,4gNormalPhaseRediSepColumnSolvents:

Hexane/EtOAc,45,碱性化合物的分离,8gBasicAluminaRediSepColumnSolvents:

Hexane/EtOAc,46,RediSep强阳离子交换色谱柱,SCX=StrongCationExchange保留碱性化合物,47,碱性化合物的分离,4gNormalPhaseRediSepColumnSolvents:

Dichloromethane/methanol,48,碱性化合物的分离,5gSCXRediSepColumnSolvents:

Dichloromethane/methanol,49,RediSepSCX柱:

2个可能的用途,除杂工具:

纯化含有碱性杂质的中性化合物被吸附的碱性化合物可以用含5%NH3的MeOH进行洗脱纯化具有碱性性质的化合物,50,RediSepSAX柱,SAX=强阴离子交换可结合酸性性质的化合物,51,酸性化合物分离,4gNormalPhaseRediSepColumnSolvents:

Hexane/EtOAc,52,酸性化合物分离,5.7gSAXRediSepColumnSolvents:

Hexane/EtOAc,53,RediSepSAXcolumn:

2个用途,除杂工具:

纯化含有酸性杂质的中性化合物被吸附的碱性化合物可以用含5%AcOH的MeOH进行洗脱纯化具有酸性性质的化合物,54,RediSep氰基取代柱,当使用正相溶剂条件时，氰基取代硅胶的功能与正相硅胶相似在反相条件下，与C-18功能相似当用常规固定相分离困难时，可作为替代选择,55,RediSep氰基取代柱,溶剂-Hexanes,EthylAcetate,MethyleneChloride,Chloroform,Methanol,Ethanol,Isopropanol,Water,Acetonitrile上样量-1%10%（大部分有机化合物）如果在纯化结束后，使用分离过程中极性最高的溶剂处理，可重复使用,56,样品,Sample,样品特性,StationaryPhase,（conditions）,LoworMedium,Polarity,Basic,Properties,High,Polarity,Acidic,Properties,Acid,Sensitive,Charged,Withmetal,reagent,NormalPhaseSilica（NP）,AmineSilica（NP/RP）,BasicAlumina（NP）,NormalPhaseSilica（NP）,ReversedPhaseSilica（RP）,AcidicAlumina（NP）,Neutralalumina（NP）,Florisil（NP）,Cyano（NP）,NormalPhaseSilica（NP）,DiolSilica（NP）,CyanoSilica（NP）,NeutralAlumina（NP）,ReversedPhaseSilica（RP）,CyanoSilica（RP）,ReversedPhaseSilica（RP）,Cyanosilica（RP）,MetalScavengerSilica（NP）,SCX（NP）,Neutralalumina（NP）,Cyanosilica（NP）,SAX（NP）,Cyano（NP）,ReversedPhaseSilica（RP）,色谱柱选择指南,57,RediSepTLC平板,58,设计分离纯化方案前的准备工作,分离纯化方案的设计是分离纯化工作的前提，也是决定分离工作成败的关键。

方案设计前的准备工作：

查阅相关的文献资料，合理借鉴前人的工作经验。

了解待处理对象（植物材料、动物材料及反应液等）的物质组成，熟悉各种物质的理化性质。

尽可能了解目标物（被分离物质）的化学结构及其理化学性质，确立目标物可靠的检测目标物方法。

了解和熟练掌握各种分离技术，明确各方法的应用范围和优缺点掌握有机物纯度的鉴定方法。

59,应用1:

天然产物的纯化黄芩（ScutellariaBaicalensis）,也叫中国美黄芩（ChineseScullcap）或BaikalScullcap治疗皮肤发炎、过敏、高胆固醇和高脂脂肪的传统中药含有类黄酮物质:

黄芩苷（Baicalin）,60,应用1:

天然产物的纯化黄芩（ScutellariaBaicalensis）,Step1:

总体分析信息的收集Step2:

大批量分离Step3:

在精确条件下分离未分开的峰,61,应用1:

天然产物的纯化黄芩（ScutellariaBaicalensis）,Step1:

总体分析信息的收集GC分析:

含6中成分UV分光光度计:

lmax=277nm,62,应用1:

天然产物的纯化黄芩（ScutellariaBaicalensis）,Step1:

总体分析信息的收集C-18反相TLC薄层层析（H2O/MeCN1:

1）:

63,应用1:

天然产物的纯化黄芩（ScutellariaBaicalensis）,Step1:

总体分析信息的收集初步天然产物色谱:

23mgpre-coatedonC-18reversedphaseSilicapowder4.3gC-18reversedphaseRediSepcolumnH2O/MeCN12ml/min277nm,64,应用1:

天然产物的纯化黄芩（ScutellariaBaicalensis）,Step2:

大批量分离,841mgpre-coatedonC-18reversedphaseSilicapowder130gC-18reversedphaseRediSepcolumnH2O/MeCN50ml/min277nm,65,应用1:

天然产物的纯化黄芩（ScutellariaBaicalensis）,Step3:

在优化条件下分离混合的峰:

#1峰组,78mgpre-coatedonC-18reversedphaseSilicapowder13gC-18reversedphaseRediSepcolumnH2O/MeCN15ml/min277nm,66,应用1:

天然产物的纯化黄芩（ScutellariaBaicalensis）,Step3:

在优化条件下分离混合的峰:

#2峰组,83mgpre-coatedonC-18reversedphaseSilicapowder13gC-18reversedphaseRediSepcolumnH2O/MeCN15ml/min277nm,67,ISCO,快速液相制备色谱仪快速纯化处理毫克级到百克级化学中间体的色谱系统，有效提取目标物。

在更短时间内创造更多新化合物得到更纯的组分。

用线性二元梯度流动相分离有机物，收集出峰纯化物，有效改善产物的纯度。

68,ISCO,进样部分分离部分检测部分收集系统控制系统安全系统,69,ISCO,进样部分1.溶剂泵：

免维护、无阀高精确计量双泵全梯度控制更加精确流量范围：

5-100ml/min连续可调工作压力50psi2.固体上样装置、液体上样3.四通上样阀,70,ISCO,分离部分可使用4-330g的各种色谱分离柱自动识别所装色谱柱尺寸,71,ISCO,检测器部分1.检测器和设定：

紫外检测器200-360nm可调波长，双波长扫描谱图根据斜率和阈值确定峰位置.2.不锈钢流通池（0.1,0.5mm），检测范围:

0.02-2.0AUFS.,72,ISCO,收集系统收集架可以实现连续分离，多种不同规格收集架可选可换用多种收集架，可多机并联。

适用多种尺寸的试管、试剂瓶自动转移无峰废弃物到废液瓶。

绝无溢流或脱管现象。

可按体积及峰值收集,73,ISCO,控制系统PeakTrak操作软件，窗口界面有好操作，智能化处理选择最佳分离的各条件参数后提供预选参考程序清晰的色码标示收集的样品和收集峰，确保准确地收集到化合物将每个样品分离条件注释、时间和用户标识等分离数据存储在单独文件中。

完善的程序方法和数据管理及自动选择参数及结果报告，PC特定软件用于快速放大或复选分离纯化条件。

Isco发明的曲线调节形成梯度技术可迅速改变梯度，弹出窗口式操作界面方便应用，避免误操作。

先进的自动监控和强大的网络通讯和超级终端功能，允许使用者通过掌上电脑或桌面个人计算机进行系统远程监控。

可自动发送电子邮件来通知您工作已经完成。

USB接口便于数据的拷贝,74,ISCO,安全系统运行过程中完全监控、配备溶剂蒸汽传感器、过压保护器和溶剂流出管，确保仪器在正常的工作环境和条件下工作，一旦出现异常自动断电保护实验结束后，空气自动吹扫或不吹扫分离柱内残留的溶剂，避免不安全因素、环境污染和溶剂浪费。

自动确定收集器位置,75,各种样品上样技术,注射器上样固相上样柱直接与柱连接干法上样,76,注射器上样,简单方便化合物能溶解于最少的流动相中为了提高分离效果需对柱进行预平衡,77,固相上样柱,不需将样品放在柱床上有预装柱或现成介质可用混合介质可进行平衡,78,直接上样,当样品不溶解时也可用于含不溶性物质的样品可混合介质用于专门分离,79,干法上样,可迅速净化样品除去基线物质省略了柱子的平衡步骤,80,柱串联叠加,困难的纯化常常要求另外的纯化或造成未分开的组分增加柱的长度可有效提高分辩率无需对介质和溶剂系统进行大的改变,81,PeaktoPeakComparisonofSeveralStacked4gColumns,TeledyneIsco,柱串联,82,柱串联,NumberofColumns,串联的柱数与峰分辨率的线性关系,83,3X4g串联柱vs单根12g柱的直接比较,柱串联,84,柱串联,Casestudy,Hexane,85,柱串联,1根正相柱,86,柱串联,6根柱串联叠加,87,柱串联,柱串联是一个可以显著提高分辨率的有效工具是一个分离复杂样品的简单技术，无需对硬件或溶剂作很大改变每增加一个柱就可以提高分辩率可增加柱直到达到需要的分离效果,88,RediSep色谱柱,使用方便RFID自动识别柱子尺寸、上次使用的方法和溶剂等信息。

给出建议的梯度、流速、润柱时间高效重复性好快速洗脱低成本介质种类多正相反相C-18特殊介质,89,RediSep色谱柱的高生产率,更快的分离更纯的产物推荐参数Acetophenone/4-MethoxyAcetophenoneIsocraticSeparation85%Hexane/15%EthylAcetate,RediSep,Competitor,90,WideRangeofFlowRates,FlowRatemL/min,MaxPlateCountsOverWideRangeofFlowRates,RelativePlateCounts,91,高流速,92,总结,CombiFlash系统和RediSep色谱柱简化了纯化步骤、提高了终产物的纯度和总体化学家的生产率客户调查表明：

使用自动化的快速色谱设备使工作效率提高了40%,纯化手册,Fnotes:

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