维生素B6片分析方法验证.docx
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维生素B6片分析方法验证
概述
1.维生素B6片有关物质测定：
照高效液相色谱法（通则0512）测定
1.1色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填
充剂；以0.04%戊烷磺酸钠溶液（用冰醋酸调节pH值至3.0）-甲醇（85：
15）为流动相；检测波长为291nm理论板数按维生素R峰计算不低于4000。
1.2测定法取本品细粉适量，加流动相适量，振摇使维生素
R溶解，用流动相制成每1ml中约含维生素R1mg的溶液，滤过，取续滤液作为供试品溶液，精密量取1ml,置100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
取对照溶液10卩l注入液相色谱
仪,精密量取供试品溶液与对照溶液各10卩l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。
1.3供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积（1.0%）。
2.维生素B6片含量测定：
照高效液相色谱法（通则0512）测定。
3.1色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填
充剂；以0.04%戊烷磺酸钠溶液（用冰醋酸调节pH值至3.0）-甲醇（85：
15）为流动相；检测波长为291nm理论板数按维生素R峰计算不低于4000。
3.2测定法取本品30片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于维生素Be0.1g）,置100ml量瓶中，加流动相适量，超声使维生素B6溶解，放冷，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置50ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，精密量取10卩l注入液相色谱仪，记录色谱图；另取维生素Be对照品，同法测定。
按外标法以峰面积计算，即得。
3.3本品含维生素B6计算，应为标示量的93.0%〜107.0%。
4.工艺处方组成
规格：
10mg
物料名称
基准处方1000片
维生素B6
10.0g「
淀粉
22.7g
糊精
27.0g
硬脂酸镁
0.3g
乙醇（95%
8.5g
纯化水
12.5g丁
合计
60g
5、仪器基本情况:
设备名称
高效液相色谱仪
设备编号
XXXXX
型号
XXXXX
出厂编号
XXX
出厂日期
XXXXX
安装位置
XXXXXX
生产厂家
XXXXX
供货厂家
XXXXXX
6.相关术语：
6.1准确度：
系指采用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度。
一般用回收率（%表示。
回收率限度应在98%-102沱间。
6.2精密度：
系指在规定的条件下同一份均匀的供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。
精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。
6.3线性:
系指在设计的范围内，测定响应值与试样中被测物质浓度呈比例关系的程度
6.4范围：
系指分析方法能达到一定精密度、准确度和线性要求时的高低限浓度或量的区间。
6.5检测限:
系指试样中被测物能被检测出的最低量。
6.6耐用性：
系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。
2.验证目的
通过验证以确认所采用的方法适合于维生素B6片的测定。
根
据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根
据验证结果判断是否符合验证标准。
若符合，按验证的方法和条件
进行维生素B6片检查；若不符合，要进行原因调查分析，或是重新进行试验。
3.验证依据
中国药典2015年版二部
中国药典2015年版四部9101《药品质量标准分析方法验证指导
原则》
4.参考文件
1、验证管理规程
2、验证总计划
3、SIL-20A高效液相色谱仪操作维护保养规程
4中国药典2015年版
5、变更控制规程
6、偏差控制规程
5.验证职责
6.验证步骤
1.维生素B6片含量分析方法验证
1.1系统适应性试验
1固定相：
十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（G8）；
2检测器：
紫外检测器，检测波长291nm
3流动相：
0.04%戊烷磺酸钠溶液（用冰醋酸调节PH值至3.0）:
甲醇=85:
15。
4流速：
1.0mL/min。
5柱温：
35C
6进样量：
10卩L。
照高效液相色谱法（通则0512）测定。
1.1.1系统适用性试验溶液：
：
取维生素B对照品约25mg置25ml容量瓶中加流动相使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取续滤液5ml,置50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为系统适应性实验溶液。
1.1.2取系统适用性试验溶液10^L注入液相色谱仪。
1.1.3判定标准：
理论塔板数按维生素B6峰计算不低于4000。
1.2维生素B6片含量分析方法线性验证
1.2.1溶液配制
1.2.2流动相配制
0.04%戊烷磺酸钠溶液（用冰醋酸调节PH值至3.0）:
甲醇=85:
15。
1.2.3处方量辅料配制
精密称定淀粉约227mg、糊精约270mg硬脂酸镁约3mg混合。
此混合辅料约为10片维生素B6（100mg所需的辅料共约500mg。
1.2.4样品溶液配制
精密称定维生素B6对照品约50mg置50ml容量瓶中，加入处方量混合辅料250mg加流动相适量振摇使维生素B6溶解，继续振摇数分钟，再加流动相稀释至刻度，摇匀,滤过,精密量取续滤液5ml，置50ml量瓶中制成浓度为100©/ml的溶液。
按60%、80%、100%、120%、140%的倍数稀释，精密量取3ml、4ml、5ml、6ml、7ml分别置50ml容量瓶中，加流动相配置成浓度为60©/ml、80©g/ml、100©g/ml、120©g/ml、140©g/ml的溶液。
1.2.5测定
精密量取经微孔滤膜过滤后各不同浓度稀释液10©l，注入液相
色谱仪，每个样品进样2次，记录色谱图。
按外标法以峰面积计算。
1.2.6判定标准：
维生素B6在60血/ml至140血/ml的浓度范围内，维生素B6峰面积成线性且相关系数R>99.8%。
1.3维生素B6片含量分析方法精密度验证
1.3.1流动相配制见维生素B6片含量分析方法线性验证项下。
1.3.2样品溶液配制
取本品30片（XXXX）生产）,研细，精密称取样品适量（约相当于维生素B60.1g），置100ml量瓶中，加流动相适量，超声使维
生素B6溶解，放冷，用流动相稀释至刻度，摇匀滤过，精密量取续滤液5ml置50ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
滤过制成100©g/ml的溶液,取续滤液作为样品溶液。
1.3.3测定
精密量取10©l注入液相色谱仪，记录色谱图，连续6次，得到维生素B6峰面积，计算维生素B6峰的Srel。
1.3.4判定标准：
维生素B6峰面积的Srel<2.0%。
1.4维生素B6片含量分析方法准确度验证
1.4.1流动相配制、处方量辅料配制见维生素B6片含量分析方法线
性验证项下。
1.4.2样品溶液配制
取维生素B对照品（约25mg>,精密称定，置25ml容量瓶中加流动相使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取续滤液5ml，置50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
制成浓度为100©/ml的溶液。
按80%、100%、120%的倍数稀释,精密量取续滤液4ml、5ml、6ml，分别置于50ml容量瓶中，加流动相配制成浓度为80血/ml、100©/ml、120©g/ml的测试溶液。
1.4.3测定
精密量取10©1注入液相色谱仪，记录色谱图，得到维生素B6
峰面积。
通过线性方程计算维生素B6浓度。
用测得浓度和实际浓度之比计算回收率。
144判定标准：
回收率限度应在98%-102陆间，回收率的Srel<2.0%。
1.5维生素B6片含量分析方法范围验证
1.5.1数据记录及结果计算
依据1.2线性，1.3精密度，1.4准确度，确定高效液相色谱法
符合《中国药典》2015版维生素B6峰含量的范围一般为测定浓度的范围。
1.5.2判定标准：
含量的范围一般为测定浓度的80%?
120%。
1.6维生素B6片含量分析方法专属性验证
1.6.1流动相配制、溶剂I配制、处方量辅料配制见维生素B6片含
量分析方法线性验证项下。
1.6.2溶液配制
1.6.2.1供试品溶液：
取本品30片（XXXX）生产）,研细，精密称取样品适量（约相当于维生素B60.1g），置100ml量瓶中，加
流动相适量，超声使维生素B6溶解，放冷，用流动相稀释至刻度，摇匀滤过，精密量取续滤液5ml置50ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
滤过制成100©g/ml的溶液,取续滤液作为
样品溶液。
1.6.2.2对照品溶液：
取维生素B6对照品（约25mg,精密称定，置25ml容量瓶中加流动相使溶解并稀释至刻度,摇匀，精密量取续滤液5ml，置50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
制成浓度为100©g/ml的溶液。
1.6.2.3空白溶液：
0.04%戊烷磺酸钠溶液（用冰醋酸调节PH值至3.0）：
甲醇=85：
15。
1.6.2.4阴性溶液：
按照片剂配方，加入处方量混合辅料500mg，置100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀滤过，精密量取续滤液5ml置50ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
用流动相稀释至刻度，继续振摇数分钟，再加流动相稀释至刻度，摇匀,滤过,取续滤液，作为阴性溶液。
1.6.3测定
精密量取经微孔滤膜过滤后的供试品溶液、对照品溶液、空白溶液、阴性溶液各10卩l，注入液相色谱仪，每个样品进样2次，记录色谱图。
164判定标准：
维生素B6寸照品溶液与样品溶液主峰保留时间一致，空白溶液与阴性溶液在主峰保留时间处应为平直基线，无吸收峰。
1.7维生素B6片含量分析方法耐用性验证
1.7.1改变流动相比例
1.7.1.1色谱条件
1固定相：
十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（C18）；
2检测器：
紫外检测器，检测波长291nm；
3流动相：
0.04%戊烷磺酸钠溶液（用冰醋酸调节PH值至3.0）:
甲醇=80：
20。
4流速：
1.0mL/min。
5柱温：
35C
6进样量：
10卩L。
照高效液相色谱法（通则0512）测定。
1.7.1.2系统适用性试验溶液：
取维生素B对照品（约25mg,精密称定，置25ml容量瓶中加流动相使溶解并稀释至刻度,摇匀，精密量取续滤液5ml，置50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为系统适应性实验溶液。
1.7.1.3取系统适用性试验溶液10^L注入液相色谱仪。
1.7.2改变柱温
1.7.2.1色谱条件
1固定相：
十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（C18）；
2检测器：
紫外检测器，检测波长291nm；
3流动相：
0.04%戊烷磺酸钠溶液（用冰醋酸调节PH直至3.0）:
甲醇=80：
20。
4流速：
1.0mL/min。
5柱温：
40C
6进样量：
10卩L。
照高效液相色谱法（通则0512）测定。
1.722系统适用性试验溶液：
取维生素B对照品（约25mg,精密称定，置25ml容量瓶中加流动相使溶解并稀释至刻度,摇匀，精密量取续滤液5ml，置50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为系统适应性实验溶液。
1.723取系统适用性试验溶液10^L注入液相色谱仪。
1.7.3判定标准：
在改变流动相柱温比例后，通过系统适用性试验,理论塔板数按维生素B6峰计算不低于4000。
2.维生素B6片有关物质分析方法验证
2.1系统适用性实验
2.1.1色谱条件
1固定相：
十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（C18）；
2检测器：
紫外检测器，检测波长291nm；
3流动相：
0.04%戊烷磺酸钠溶液（用冰醋酸调节PH值至3.0）:
甲醇=85：
15。
4流速：
1.0mL/min。
5柱温：
35C
6进样量：
10卩L。
2.1.2测定方法按高效液相色谱法（通则0512）测定。
2.1.3溶液配制
系统适用性试验溶液：
取维生素B对照品（约25mg，精密称
定，置25ml容量瓶中加流动相使溶解并稀释至刻度,摇匀，精密量取续滤液5ml，置50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为系统适应性实验溶液。
2.1.4取系统适用性试验溶液10^L注入液相色谱仪。
2.1.5系统适应性试验
取系统适用性实验溶液20ul注入液相色谱仪，记录色谱图。
2.1.6判定标准：
理论塔板数按维生素B6峰计算不低于4000。
2.2维生素B6片有关物质分析方法专属性验证
2.2.1溶液配制
A.处方量辅料：
精密称定淀粉约22.7mg、糊精约27mg硬脂酸镁约
0.3mg。
混合。
B.供试品溶液：
精密称取本品细粉适量（约相当于维生素B10mg,置10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释制成每1ml中约含维生素B61mg的溶液，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
C.空白溶液：
取已配制的全部处方量辅料，置10ml量瓶中，加流动相充分振摇匀，加流动相稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液，作为储备液。
2.2.2测定按高效液相色谱法（通则0512）测定。
色谱条件同2.1.1。
精密量取供试品溶液和储备液各10卩l，注入液相色谱仪，记录色谱图。
223判定标准：
维生素B6片在291nm处有吸收峰出现，维生素B6片的处方量辅料无吸收峰出现，维生素B6片的处方量辅料不干扰有关物质的检查。
2.3维生素B6片有关物质分析方法检测限验证
2.3.1溶液配制
供试品溶液：
取专属性验证项下供试品溶液适量，加流动相分别
配置成100©/ml、10©/ml、1©/ml、0.1g/ml、0.01血/ml浓度的溶液。
2.3.2测定
按高效液相色谱法（通则0512）测定。
色谱条件同3.1.1。
精密量取样品溶液10©l，注入液相色谱仪，记录色谱图。
2.3.3判定标准：
当S/N〜3时为检测限。
2.4维生素B6片有关物质分析方法耐用性验证（改变流动相比例）
2.4.1溶液配制：
系统适用性试验溶液：
取维生素Be对照品（约25mg,精密称定，置25ml容量瓶中加流动相使溶解并稀释至刻度,摇匀，精密量取续滤液5ml，置50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为系统适应性实验溶液。
2.4.2色谱条件
1固定相：
十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（C18）；
2检测器：
紫外检测器，检测波长291nm；
3流动相：
0.04%戊烷磺酸钠溶液（用冰醋酸调节PH值至3.0）：
甲醇=80：
20。
4流速：
1.0mL/min。
5柱温：
35C
6进样量：
10©L。
2.4.3测定
按高效液相色谱法（通则0512）测定。
取系统适用性实验溶液10ul注入液相色谱仪，记录色谱图。
244判定标准：
理论塔板数按维生素B6峰计算不低于4000
2.5维生素B6片有关物质分析方法耐用性验证（改变PH值）
2.5.1溶液配制：
系统适用性试验溶液：
取维生素E3b对照品（约25mg，精密称定，置25ml容量瓶中加流动相使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取续滤液5ml，置50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为系统适应性实验溶液。
2.5.2色谱条件
1固定相：
十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（C18）；
2检测器：
紫外检测器，检测波长291nm
3流动相：
0.04%戊烷磺酸钠溶液（用冰醋酸调节PH值至3.5）：
甲醇=85：
15。
4流速：
1.0mL/min。
5柱温：
35C
6进样量：
10卩L。
2.5.3测定
按高效液相色谱法（通则0512）测定。
取系统适用性实验溶液10ul注入液相色谱仪，记录色谱图。
2.5.4判定标准：
理论塔板数按维生素B6峰计算不低于4000。
七、变更/偏差控制：
1、如验证过程中出现变更，则按《变更控制程序》进行。
2、如验证过程中出现偏差，则按《偏差控制程序》进行。
3、任何可接受的变更/调查/偏差和采取的措施，均应记载在下表中。
4、变更/调查/偏差纪录
序号
变更/偏差编
号
问题简述
是否附报
告
处理日期
填写人/日期：
复核人/日期：
QA检查人/日期：
所附的变更/调查/偏差修正报告和支持文件，应作为此文件的附录部分。
八•附件:
序号
附件名称
填写人/日期：
复核人/日期：
QA检查人/日期：
九•变更记载及原因
修订
号
执行日期
变更原因、依据及详细变更内容
01
XXXXX
XXXX验证。
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