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多菌灵残留的生物降解

扬州工业职业技术学院

2009—2010学年

第二学期

毕业设计（论文）

（课程设计）

课题名称：

多菌灵残留的生物降解研究

设计时间：

2010.12.10—2011.12.25

系部：

化学工程系

班级：

0803生物化工

姓名：

刘佳

指导教师：

田连生

目录

摘要…………………………………………………………………………………3

Abstract……………………………………………………………………………4

1绪论………………………………………………………………………………51.1农药污染的危害…………………………………………………………………5

1.2我国土壤农药污染现状………………………………………………………6

1.2.1常用化学农药的种类和特点………………………………………………6

1.2.2我国土壤农药污染现状………………………………………………………6

1.3农药污染带来的各方面影响……………………………………………………7

1.3.1农药污染对土壤生物的影响…………………………………………………7

1.3.2农药污染对农作物的影响……………………………………………………8

1.3.3农药污染对农产品的影响……………………………………………………8

1.4多菌灵的理化性质………………………………………………………………9

1.5存在问题及研究意义……………………………………………………………9

1.6多菌灵降解方式………………………………………………………………10

1.7多菌灵降解的意义……………………………………………………………10

2实验部分………………………………………………………………………12

2.1试验材料………………………………………………………………………12

2.2实验仪器………………………………………………………………………12

2.3多菌灵降解菌的分离与纯化………………………………………………12

2.4种子液制备…………………………………………………………………12

2.516SrDNA序列分析…………………………………………………………13

2.6多菌灵降解率的检测…………………………………………………………13

2.7多菌灵浓度的影响…………………………………………………………14

2.8氮源对菌株降解多菌灵的影响……………………………………………14

2.9pH值对菌株降解多菌灵的影响……………………………………………14

2.10培养温度对菌株降解多菌灵的影响………………………………………14

3结果与讨论…………………………………………………………………15

3.1菌株的筛选与鉴定……………………………………………………………15

3.2多菌灵浓度对降解率的影响…………………………………………………15

3.3氮源多菌灵降解的影响………………………………………………………15

3.4pH值多菌灵降解的影响………………………………………………………16

3.5培养温度对多菌灵降解的影响………………………………………………16

3.6讨论……………………………………………………………………………17

4结论………………………………………………………………………………18

参考文献…………………………………………………………………………19

致谢…………………………………………………………………………………20

多菌灵残留的生物降解研究

刘佳

0803生物化工

摘要：

本文采用富集培养法，在长期施用多菌灵的土壤中分离纯化得到一株对多菌灵降解效能高的菌株RF33-2。

经生理生化和序列同源性分析，鉴定为短小芽孢杆菌。

菌株RF33-2降解多菌灵的最适pH值6.0～10.0，最适温度35.0～40.0℃。

该菌株在多菌灵浓度为1O、3O、50、100、300mg/L的无机盐培养基中，30℃振荡培养24h后，其对多菌灵的降解率分别为42.44％、48.97％、77.19％、78.66％和9O.O7％。

外加有机氮源如酵母浸出粉、胰蛋白胨、酵母膏可促进该菌株对多菌灵的降解效果，而无机氮源尿素的加入会抑制对多菌灵的降解作用。

关键词:

多菌灵；残留；生物降解；降解率

BiodegradationofCarbendazimresidues

Liujia

0803Bio-Chemical

Abstract：

Carbendazimisabenzo-pyrazolepesticidesbecausethecropresiduesonthelongerterm,soonitsresidueanalysishasbeenmoreandmoreattention.Inthispaper,thelong-termapplicationofcarbendazimpurifiedfromthesoilofonepairsofcarbendazimdegradationofperformanceofahighstrainRF33-2.Thephysiologicalandbiochemicalandsequencehomologyanalysis,thebacterialdegradationofcarbendazimoptimumpHvalueof6.0～10.0,andtheoptimumtemperatureof35.0～40.0℃.Bacteriuminthecarbendazimconcentrationof10,30,50,100,300mg/Loftheinorganicsaltmedium,30%after24hshakingculture,itsdegradationrateofcarbendazimwere42.44%,48.97%,77.19%,78.66%,and90.07%.Addasmallamountoforganicnitrogensourcessuchasyeastextract,tryptone,yeastextractcanpromotethedegradationofcarbendazimstrains,addasmallamountofinorganicnitrogensourcesureainhibitstrainsofcarbendazimdegradation.

Keywords：

Carbendazim；residue；bio-degradation；degradationrat

1绪论

1.1农药污染的危害[1]

在人类农业生产中，农药很早就被用于农作物病虫害的防治，在农业经济的发展中起着十分重要的作用。

由于农药具有成本低、见效快、省时省力等优点，在世界各国的农业生产中被广泛生产使用，仅1985年，世界的农药产量就达200多万t。

然而大量化学农药，特别是高毒、高残留、难降解农药的使用，是造成环境污染的主要“杀手”。

据美国康奈尔大学研究发现：

全世界每年使用农药400余万t，而实际发挥效能的仅有1%，其余99%都散逸于土壤、空气及水体之中，造成环境污染。

农药污染范围广，面积大，时间长，不仅污染农作物和土壤，而且还进一步污染到地面水体和地下水以及海洋环境，它们在杀死靶标生物的同时，也或多或少地杀死非靶标生物，对周围环境乃至整个生态环境造成严重的破坏，直接威胁着人类的生存环境和身体健康。

农药进入环境主要有三种途径：

一是农药直接喷洒在土壤中用于防治地下害虫、去除杂草；二是为防治病虫草害而喷洒于作物叶面，其中至少会有90%的农药落入土壤当中；三是在喷雾和喷粉使用农药时，部分农药弥漫于大气中，并随着气流和风迁移，散布到环境的各个角落。

图1植物吸收农药的途径

农药对人、畜健康和地球生态安全的影响也是当今备受关注的热门话题。

20世纪60年代，有机氯农药污染给自然环境带来的严重后果最先被人们认识；70年代初，六六六和DDT被逐出杀虫剂家族；80年代初，有机磷农药的剧毒品种被清除出常规农用化学品名单；90年代以来，包括杀虫剂、除草剂、杀菌剂和植物激素等数十种农药在内的环境激素类化学农药和持久（难降解）有机毒物的危害性及其监控问题成为人们关注的焦点，它们对动物的毒性主要有：

1）影响人和动物生殖繁衍，造成动物雌性化、腺体病变和后代生命力退化；2）引起动物脏腑器官功能和免疫功能下降；3）“三致”作用（致癌、致畸、致突变）。

这不仅直接危害到人类健康，而且可造成许多野生动物的种群消亡，引发地区生态危机和生物多样性。

而环境激素类化学农药目前在我国产销应用量巨大，特别是多菌灵是目前农业上防治植物病害的主要杀菌剂。

因此，其在环境中残留的降解，已成为我国急待解决的问题。

1.2我国土壤农药污染现状

土壤是人类环境的基本要素之一，是人类赖以生存和进行生产活动的物质基础，它与人类健康有着密切的联系。

在巨大人口压力和耕地减少的情况下，农林土壤大量施用化肥、农药以及其他一些化学物质，而且其施用量将可能在很长时间内维持较高的水平，这些化学物质在土壤中不断积累，使生态系统受到严重的干扰和破坏，引起土壤环境恶化、土壤肥力下降和土壤生产力下降等负面效应，极大的影响了农林耕地的可持续利用，也使污染土壤的面积进一步增加，这种增加在发展中国家表现的更为明显，因此，农药污染土壤修复技术的研究，将成为农业环境治理的热点领域。

1.2.1常用化学农药的种类和特点

化学农药按其功能不同，主要分为杀虫剂、除草剂和杀菌剂三大类；而依据化学结构不同，可分为有机氯类、有机磷类、拟除虫菊酯类、氨基甲酸酯类和无机农药等多种类型。

这些化学农药的共同特点是：

⑴有毒性，且靶向性差；

⑵残留性，一般分为高残留、中残留和低残留等；

⑶迁移性和累积性，可通过空气、土壤或地下水发生迁移，甚至在生物体内累积。

1.2.2我国土壤农药污染现状

我国是农业大国，每年平均发生病虫害约27～28亿亩次，农药，尤其是化学农药的使用，依然是保证粮食作物增产、稳产的重要和有效手段。

目前，全国农业使用化学农药为80～100万t左右，有机磷农药占40%，高毒农药占37.4%，这些农药无论以何种方式施用，均会在土壤残留，而且在我国农药的有效利用率低，据测定仅为20%～30%（发达国家的有效利用率为60%～70%）。

若按单位面积施药量计算，我国农药用量是美国的2倍多。

根据23个省（自治区/直辖市）的统计，2000年共发生农业环境污染事故891起，污染农田4万hm2，直接经济损失达2.2亿元[6]。

据联合国的一份统计资料表明，我国的农副产品因为化学农药的残留问题，每年有74亿美元的出口商品受到不利影响。

在相当长的一个时期内，人们对农药的使用主要是着眼于对有害生物的防治和提高经济效益，然而，对于施用后进入人类和动植物生存的生态环境中可能产生的不良影响未给与足够的重视。

化学农药大量使用，一方面杀死了许多无辜的生物，破坏了生态系统的平衡；另一方面，又通过食物链的富集和放大作用，给人类和高等动物造成严重的危害。

有机磷和有机氯农药是造成土壤农药污染的主要种类。

目前世界上的有机磷农药商品达上百种，在我国使用的有机磷农药约30余种，使用量为20万t，其中80%以上是剧毒农药，如甲胺磷、甲基对硫磷、对硫磷、久效磷、敌敌畏等，其中甲胺磷的使用量一年就高达6.5万t。

目前我国有机磷农药占据农药主导地位的局面难以在短期内改变，仍将长期使用。

有机氯农药是造成土壤农药污染的另一大类，我国有机氯农药的主要污染地区集中在华北和华东地区，在土壤、农产品、河流沉积物中都检测到了该类农药的残留。

2000年太湖流域农田土壤中15种多氯联苯同系物检出率为100%，六六六、DDT超标率为28%和24%，上海市郊区农田中的DDT含量严重超标，南京市菜地土壤中六六六和DDT的检出率为100%。

虽然随着时间的推移，这些禁用有机氯农药的残留在逐渐降低，但目前仍在使用的有机氯农药如二氯杀螨醇、五氯酚和五氯酚钠等，同样造成土壤、植物和水源的污染。

其他土壤有机污染物还包括氨基甲酸酯类、有机氮类杀虫剂和磺酰脲类除草剂，这些种类的农药毒性较低，但因使用范围扩大，其对土壤造成的污染亦不容忽视。

1.3农药污染带来的各方面影响

1.3.1农药污染对土壤生物的影响[2]

化学农药与土壤微生物间的相互作用十分复杂，影响因素也很多。

如农药分子的结构、大小、疏水性高低等，会直接影响到其穿透微生物细胞膜能力的大小及微生物对该农药降解能力的高低。

农药的残效性和降解特性，如半衰期与降解产物等，也是农药与土壤微生物相互作用的重要方面，它们会直接影响农药对微生物毒性和土壤微生物种群数量变化。

另外，农药施药质量分数、施药次数及土壤的理化性质，土壤肥力、植被情况、植物营养状况等都是重要的相互影响因素，特别是土壤有机质含量的高低，它能直接影响农药在土壤中的吸附与扩散。

化学农药对微生物的影响主要有以下几个方面：

第一，影响微生物种群数量。

农药可以通过各种途径改变土壤微生物区系的组成和数量。

最显著的影响是化学农药对敏感微生物的直接毒害作用，特别是在实验室高质量分数（10～100倍）情况下，施药后，可以看到土壤微生物生态紊乱的情况发生，虽然正常的田间施用量一般不会表现出打破微生物生态平衡而足以使土壤肥力明显下降的现象，但农药总会对微生物生态平衡产生一定的波动作用。

第二，抑制特殊微生物的生长。

例如，在经杀菌剂处理的土壤中，绿色木霉是一种优势菌，而绿色木霉的大量繁殖则会抑制其它真菌如腐毒属、丝核菌属及疫霉属等的生长。

第三，抑制微生物的转化作用。

有些农药能抑制对土壤物质起转化作用的微生物的生长，从而抑制了某些物质的转化。

如质量分数大于50mg/kg敌稗、溴苯腈和碘苯腈等可以抑制细菌的硝化作用。

有些除草剂（如草藻灭、对草秧等）质量分数超过500mg/kg时，能显著降低微生物的氨化速率。

第四，影响微生物的生态平衡。

土壤系统生态平衡的任何变化都会反映到微生物种群组成和数量变化上。

当微生物对构成其菌体的主要营养物质—可供利用的碳源的需求总量超过土壤可提供的数量时，农药作为一种可供利用的碳源，就可能对微生物的种群进行重新构建，于是引发土壤微生物生态系统的变化。

另外，当新的碳源存在时，微生物往往能发生突变选择，以促进能够利用新引入的农药分子作为碳源和能源的特殊微生物的发展，这样，微生物的突变选择因素，就可能引起微生物对农药解毒机制的发生。

农药对微生物种群数量的影响与农药种类、施药质量分数、施药次数及农药代谢产物等因素有关。

连续施用不同农药的土壤，微生物的优势菌群不同。

1.3.2农药污染对农作物的影响

农药施入农田后,一部分洒落在农作物表面而残留下来,或者是渗入植物体内移动,并随作物一起被人或动物摄取；另一部分农药直接落在土壤中,落在土壤中的农药,除挥发和径流损失外，其余可被农作物根系直接吸收，在作物的体内残留，这条途径是农药进入植物体的主要途径。

其中，一类农药在植物体内能够被分解，所以残留低、残留期短；另一类农药则通过代谢形成与其相似的产物，并与植物体内的有机物相结合，残留在植物体内。

1.3.3农药污染对农产品的影响

使用农药可造成农产品中硝酸盐、亚硝酸盐、亚硝胺、重金属和其他有毒物质在农产品中大量积累，造成农药在动植物食品中的富集和残留，直接威胁着人体健康。

农药的使用使农产品质量与安全性降低，在我国由于农药污染的不断加剧，以致出现农产品中农药超标而使农产品的国际竞争力大大下将。

以苹果为例，我国苹果产量居世界第1位，而目前我国苹果出口量仅占生产总量的1%左右，出口受阻的主要原因是农药残留超标。

中国橙优质率为3%左右，而美国、巴西等柑桔大国橙类的优质品率达90%以上，原因是中国橙的农药残留量等超标。

1989年我国出口到日本的绿茶因农药残留超标而被退回。

我国加入世贸组织后，一些国家对我国出口的茶叶允许的农药残留指标只有原来的1%。

因此，农药残留已成为制约农产品质量的重要因素之一。

1.4多菌灵的理化性质[3]

多菌灵[Carbendazim],化学名称N-（2-苯并咪唑基）氨基甲酸甲酯。

纯品为白色结晶，原粉为浅棕色粉末，化学性质比较稳定，但在酸性或碱性条件下易水解。

几乎不溶于水，可溶于稀无机酸或有机酸，形成相应的盐。

多菌灵对人畜、鱼类和蜜蜂低毒，对作物安全。

该药剂为内吸性广谱杀菌剂，经种子、根、叶片吸收后，在植物体内传导，兼具保护和治疗作用，残效期长，叶面喷雾持效期可达10d。

常用剂型有25%和50%可湿性粉剂、40%悬浮剂，是防治农作物多发病害的农药。

属于真菌类杀菌剂。

1.5存在问题及研究意义

多菌灵由于具有苯环结构，其化学性质稳定，在环境中半衰期较长（3～6个月），残留物质易富集等特性，对生态环境及人畜健康造成危害。

特别是对蔬菜、草莓等采摘后即食作物，危害更大。

同时因其能引起哺乳动物肝病、导致染色体畸变而影响后代繁衍等因素，具有“三致”作用。

2002年被我国列为环境激素类化学农药。

因此对多菌灵残留量的检测和在环境中的降解研究愈来愈受到人们的关注。

多菌灵很难被水解，热解和光解等物理方法分解，在生态系统中，微生物对农药的分解起着重要作用。

生物降解是去除环境中多菌灵残留的主要途径。

目前，国内外对多菌灵生物降解的研究仅有少量报道，但已经报道的多菌灵降解菌对多菌灵的降解率不高且只能降解低浓度的多菌灵。

本文旨在分离筛选多菌灵高效降解菌，并对其降解特性进行研究，为其在生物修复中的应用提供科学依据。

1.6多菌灵降解方式[4]

微生物的降解作用分为酶促降解作用和非酶促降解作用。

酶促降解作用表现为：

（1）微生物以分子中某部分作为能源和碳源，部分微生物能以某种农药为唯一碳源或氮源。

有些能被微生物立即利用，有的则不能立即利用，需先经产生特殊酶解后再使农药降解。

（2）微生物通过共代谢作用使其降解。

许多研究表明，由于某些化学农药的结构复杂，单一的微生物不能使其降解，需靠二种或二种以上的微生物共同代谢降解。

（3）去毒代谢作用。

微生物不是从农药中获取营养或能源，而是发展了为保护自身生存的解毒作用。

非酶促降解作用：

微生物活动使pH方式变化而引起农药降解，或产生某些辅助因子或化学物质参与农药的转化，如脱卤作用、脱烃作用、胺及酯的水解、还原作用、环裂解等。

1.7多菌灵降解的意义[5]

现代农业改变了传统的种植模式，设施栽培和农药化肥的大量使用，导致了生态环境的严重恶化。

由于保护地栽培中设施的不易迁移性，农作物经常重茬种植，土壤中土传病原菌大量滋生繁殖，引发植物病害。

而病害的频繁发生，又促使农民用药次数增加，导致土壤中农药残留升高，形成恶性循环。

以温室大棚蔬菜为例，我们通过对棚内和棚外土壤生物检测得到：

棚内土壤中多菌灵的残留量高达9.6mg/kg干土是棚外的6.7倍，病原菌落数达到3.9×105个/g干土，是棚外土壤的3倍。

而棚内土壤中的微生物数量却大幅减少：

真菌数减少了2倍,细菌数减少了7.8倍,放线菌减少了5倍。

可见农药残留和病原菌的大量存在，破坏了土壤生态平衡。

本实验室在耐药性木霉菌株的诱变选育过程中,得到一株能在含多菌灵2000mg/L的培养基上生长且对多菌灵有降解作用的变异菌株RF33-2。

该菌株除对土壤中多菌灵具有较好降解性能外,还同时对土传性病原菌如尖镰孢菌、灰葡萄孢菌引起的枯萎病、灰霉病等植物多发病具有很好的防治效果。

木霉菌株在土壤中具有很强的定殖力和环境友好性,不会造成环境和人类健康问题。

目前已报道的多菌灵降解菌大多为细菌类,如张桂山分离得到（罗尔斯通氏菌）在无机盐培养基中,对多菌灵的降解率达到19.2％；张丽珍分离得到NY97-1菌株,为短小芽孢杆菌,对多菌灵的降解率达到78.6％。

本实验通过富集培养分离出菌株为RF33-2属革兰氏阳性菌，初步鉴定为短小芽孢杆菌。

现就该菌株对多菌灵的降解性能和降解效果研究如下。

2实验部分

2.1试验材料

多菌灵标准品，纯度为99.1％，由山东化扬科技股份有限公司提供；酵母浸出粉及胰蛋白胨、酵母膏为南京生物科技有限公司提供。

试验用芽孢杆菌菌株为RF33-2，由本实验室富集分离保存。

富集培养基：

NaC11.0g，K2HPO41.50g，KH2PO40.50g，MgSO4·7H2O0.20g，蒸馏水1000mL，多菌灵（按需加入多菌灵）。

分离纯化培养基：

NaC11.0g，K2HPO41.50g，KH2PO40.50g，MgSO4·7H2O0.20g，（NH4）2SO42.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL（按需加入多菌灵）。

降解试验用培养基：

配方同分离纯化培养基（不含琼脂）。

牛肉膏蛋白胨培养基：

NaCl5.0g，蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，蒸馏水1000mL，pH调至7.0。

2.2实验仪器

液相色谱仪（HP.1050）由惠浦公司提供，使用可变波长检测器。

色谱柱：

C18。

柱长250mm，内径4.6mm，5μm粒级。

样品净化富集柱：

C18。

2.3多菌灵降解菌的分离与纯化[6]

在100mL分别含有多菌灵200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L的富集培养基中分别加入10.0g土样，于30℃，200r/min摇床培养7d后，吸取10mL转接至相同浓度的多菌灵富集培养基中，连续富集，转接3次，分别用移液管吸取0.2mL最后一次的富集培养基，在相同浓度的多菌灵分离纯化培养基平板上涂布，30℃培养3d后。

挑取形态上有差异且菌落比较大的菌株。

将富集的得到的株菌在分离纯化培养基平板上进行划线分离，30℃培养，连续传代5次，得到纯种菌株RF33-2,保存在牛肉膏蛋白胨培养基斜面上。

2.4种子液制备[7]

从培养基斜面上挑取一环菌体接入100mL牛肉膏蛋白胨培养基中，于30℃，200r/min培养24h后取出放入冰箱，作为母液。

制备10瓶牛肉膏蛋白胨培养基，每瓶含有100mL培养基，放入灭菌锅中121℃，灭菌20min后，一瓶作对照不加菌，另外9瓶分别加3mL母液，于30℃，200r/min培养，定时按顺序从不同的瓶子中吸出5mL，每次取两个瓶子的样，以不加菌为CK，测定不同培养时间的培养基的OD600把两个瓶子中的样品的OD600求平均值，然后绘制菌株培养时间与OD600的关系曲线，从而确定菌株生长的阶段。

并取处于稳定生长期的液体菌种作为种子液，进行多菌灵降解试验。

2.516SrDNA序列分析[8－9]

染色体总DNA提取：

菌株在LB培养基上活化后，将单菌落转接于50mLLB液体培养基中，于30℃、180r/min条件过夜培养，离心收集菌体；用等体积的TE缓冲液洗涤一次后，用5.0mL的TE缓冲液悬浮，加溶菌酶使其终浓度为80mg/mL，37℃温育1h。

按Preheim的方法提取总DNA，检查纯度和浓度后，置于4℃冰箱中备用。

以染色体DNA为模板，PCR扩增16SrDNA，扩增引物为细菌通用引物。

正向引物为BSR1541/20：

5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物为BSR1541/20：

5’一AA