康乃馨微量元素的测定及黄酮提取的研究.docx
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康乃馨微量元素的测定及黄酮提取的研究
康乃馨微量元素的测定及黄酮提取的研究
StudyonDeterminatingofTraceElementsandExtractingofFlavonoidsfromcarnationWormwoodLeaves
院系
化学与材料学院
专业
应用化学
学生班级
2009级
姓名
姚丹文
学号
200906404122
指导教师单位
化学与材料学院
指导教师姓名
黄志伟
指导教师职称
副教授
康乃馨微量元素的测定及黄酮提取的研究
1前言
1.1康乃馨简介
康乃馨作为花卉名称，是英文Carnation一词的音译词，它是一种大量种植的石竹科、石竹属多年生植物，是玫瑰的一种。
茎叶与中国石竹相较粗壮，被有白粉。
通常开重瓣花，花色多样且鲜艳，气味芳香。
属于多年生宿根草本。
茎丛生，质坚硬，灰绿色，节膨大，高度约50㎝。
叶厚线形，对生花大，具芳香，单生、2－3朵簇生或成聚伞花序；萼下有菱状卵形小苞片四枚，先端短尖，长约萼筒四分之一；萼筒绿色，五裂；花瓣不规则，边缘有齿，单瓣或重瓣，有红色、粉色、黄色、白色等色。
康乃馨是最受欢迎的切花之一，代表了健康和美好。
1.2康乃馨药用和食用价值
康乃馨属于石竹科石竹属多年人丁，其具有美容养颜，安神止渴，清目，消炎除烦，生津润喉，健胃消积。
对治疗头痛牙痛有明显疗效。
含体所需的各种微量元素，能加速血液循环，促进新陈代谢，具有清心除燥，排毒养颜，调节内分泌，同时具有固肾益精，治虚劳，咳嗽、消渴之功效。
清肝凉血，美白皮肤，祛斑除皱。
能改善血液循环、增强肌体的新陈代谢，具有清心除燥、排毒养颜、延缓衰老、调节女性内分泌系统、补肾担神、健胃开胃、调节血脂减肥等功效[1]。
《本草纲目》记载：
康乃馨花茶性微凉、味甘、入肺、肾经，有平肝、润肺养颜之功效。
近代医学证明，长期饮用花茶有祛斑、润燥、明目、排毒、养颜、丰胸、调节内分泌等功效。
1.3微量元素与人体健康的关系
人体内微量元素是指含量极少，占体重不足0.01﹪的元素。
微量元素含量虽然少，但是对维持人体的正常生理功能有重要的作用。
微量元素虽然在人体内的含量不多，但与人的生存和健康息息相关，对人的生命起至关重要的作用[2]。
它们的摄入过量、不足、不平衡或缺乏都会不同程度地引起人体生理的异常或发生疾病。
微量元素最突出的作用是与生命活力密切相关，仅仅像火柴头那样大小或更少的量就能发挥巨大的生理作用。
值得注意的是这些微量元素通常情况下必须直接或间接由土壤供给，但大部分人往往不能通过饮食获得足够的微量元素。
根据科学研究，到目前为止，已被确认与人体健康和生命有关的必需微量元素有18种，即有铁、铜、锌、钴、锰、铬、硒、碘、镍、氟、钼、钒、锡、硅、锶、硼、铷、砷等[3]。
这每种微量元素都有其特殊的生理功能。
尽管他在人体中含量极小，但它们对维持人体中的一些决定性的新陈代谢却是十分必要的。
一旦缺少了这些必需的微量元素，人体就会出现疾病，甚至危及生命。
在生命体内的微量元素主要具有以下特点[4]:
①相对性 一种相同的元素在某一学科中可作为主量元素,而在另一学科中却作为微量元素,例如,氢在生命化学中是主量元素,而在材料科学中常作为微量元素另行研究。
②低浓度 在任何生命体中元素均是微量的,并且必须服从Henri稀溶液定律和Nerst分配定律。
③普存性 普存性即指自然界中不存在绝对纯的物质。
④重要性 元素在所有的研究体系中虽然丰度很低,但却具有极其重要的特定效应。
⑤相关性 相关性即不仅要考虑它们单个的行为,更重要的探讨其相互关系。
1.4微量元素在机体中的作用
微量元素的主要作用[5]：
⑴构成各种金属酶的必需成分或活化的某些金属酶和它的辅因子；
⑵参与激素的合成或增强激素的作用,使各种激素与维生素有不同的特异功能；
⑶协助输送普通元素；
⑷调节体液的渗透压和酸碱平衡。
这些作用对人体功能的影响主要有：
①影响胚胎的生长发育；②促进人体的生长发育；③影响内分泌的功能；④维护中枢神经系统的完整性；⑤参与机体的免疫系统。
1.5黄酮对人体健康的作用
1．黄酮类化合物具有扩张血管，防止低密度脂蛋白（LDL）氧化作用，抑制主动脉内皮细胞腺苷脱氨酶，具有调节心肌收缩和改善心肌舒张功能，提高机体耐氧能力，对抗各种因子造成的心律失常，可用于治疗心律失常、心绞痛、心肌梗塞等症状[6]。
2．黄酮类化合物主要通过影响细胞的分泌过程，有丝分裂及细胞间的相互作用而起抗炎及提高免疫功能。
多数黄酮类化合物能抑制大鼠肥大细胞和嗜碱性细胞对多种刺激引起的组胺及慢反应物质的释放，抑制PGE2、白三稀的合成和释放，抑制透明质酸酶的活性，抑制大鼠中性粒细胞溶酶体的释放及其脱颗粒。
研究表明，天然黄酮对小鼠急性胃溃痒有明显的消退作用
1.6研究目的
本文采用火焰原子吸收光度法，对康乃馨钙、铁、铜、钾、锌、钠元素含量的分析测定，方法可操作性强、测定快速、简单、结果准确，对研究康乃馨中的微量元素含量提供了有效,准确的数据。
同时采用有机溶剂浸泡并结合超声波辅助萃取，并以比色法为检测手段测定康乃馨中总黄酮含量。
为康乃馨的药用研究及开发提供科学依据。
2实验部分
2.1主要仪器
微型植物粉碎机天津市泰斯特仪器有限公司
电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司
BS210S电子分析天平
微波炉广东美的集团公司
SHB-III循环水式多用真空泵
TU-1800紫外可见分光光度计北京谱析通风仪器有限责任公司
移液管
TAS-990F原子吸收分光光度计北京普析通用有限公司
KQ3200DB数控超声波清洗器
钙、铁、铜、钾、锌、钠的空心阴极灯河南省衡水市宁强光源厂
石棉网、容量瓶（50mL、100mL）烧杯,干燥器,微量移液管（1mL、5mL、10mL）
2.2主要试剂
芦丁AR成都曼思特生物科技有限公司
无水乙醇AR
亚硝酸钠AR
硝酸铝AR
氢氧化钠AR
乙酸锌AR
氨水AR
氯化铵AR
乙二四乙酸二钠（EDTA·2Na）AR
铬黑TAR
硝酸AR
过氧化氢AR
高氯酸AR
盐酸AR
钙、铁、铜、钾、锌、钠均为1mg·mL-1为标准储备液（天津市光复精细化工研究所）
康乃馨（购于玉林盛世百汇）
2.3试样准备
2.3.1样品的预处理
将康乃馨用二次蒸馏水洗涤三次，晾干。
放入洁净的容器中，放在电热恒温鼓风干燥箱中于80℃左右烘干至恒重，用微型植物粉碎机粉碎，再用电热恒温鼓风干燥箱恒重置于干燥的容器中备用。
2.4微量元素的测定
2.4.1样品消解
①湿法消解：
准确称取康乃馨试样1.0000g于100mL烧杯中，加入一定量的消化液，用保鲜膜封口，预防酸的挥发，放在通风橱中消化48小时，把保鲜膜去掉，在电子万用炉上慢慢加热至大量白烟冒尽，此时溶液应为澄清，稍冷却，用二次蒸馏水冲洗烧杯内壁，再继续加热，赶走余酸，赶酸成功后，再加入2.5mL1%的HNO3和少量的蒸馏水转移至100mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，得到待测液。
②微波法消解：
准确称取康乃馨试样1.0000g于100mL聚四氟乙烯消化罐中，加入10mLHNO3+4mLHClO4消化系统的消化液摇匀，放置30分钟，然后放到微波炉中用小火加热1-2分钟，停止加热，打开消化罐放气1-2分钟，再用小火加热1-2分钟，再停止加热，打开消化罐放气1-2分钟。
如此循环直到消化罐中的消化液没有沉淀，取出冷却至室温后打开罐，消解完全的样品溶液应为透明澄清，淡黄色或将近无色。
最后将消化液转移至150mL的容量瓶中，用二次蒸馏水稀释至刻度，按同样的方法配置空白溶液。
2.4.2标准工作溶液
准确移取适量的各个元素的标准储备液，加入1﹪的硝酸3mL。
用二次蒸馏水定容50mL，各个元素的浓度系列如下：
钙标准溶液：
用移液管向6个50mL容量瓶中分别移入Ca（1000.00µg/mL）标准液0.00mL,0.50mL,1.00mL,1.50mL,2.00mL,加入3mL1%的硝酸，再用蒸馏水定容，即溶度为：
0.00,1.00,2.00,3.00,4.00,µg/mL标准溶液
钾标准溶液：
0.00mL,0.50mL,1.50mL,2.50mL,5.00mL加入加入3mL1%的硝酸，再用蒸馏水定容，即溶度为：
0.00mL,10.00mL,30.00mL,50.00mL,100.00mLµg/mL标准溶液
铁标准溶液：
0.00mL,0.0250mL,0.050mL,0.100mL,0.150mL加入加入3mL1%的硝酸，再用蒸馏水定容，即溶度为：
0.00mL,0.50mL,1.00mL,2.00mL,3.00mlµg/mL标准溶液
铜标准溶液：
0.00mL,0.010mL,0.020mL,0.030mL,0.040mL加入加入3mL1%的硝酸，再用蒸馏水定容，即溶度为：
0.00mL,0.20mL,0.40mL,0.60mL,0.80mLµg/mL标准溶液
锌标准溶液：
0.00mL,0.005mL,0.010mL,0.015mL,0.020mL加入加入3mL1%的硝酸，再用蒸馏水定容，即溶度为：
0.00mL,0.10mL,0.20mL,0.30mL,0.40mLµg/mL标准溶液
钠标准溶液：
0.00mL,0.25mL,0.50mL,0.75mL,1.00mL加入加入3mL1%的硝酸，再用蒸馏水定容，即溶度为：
0.00mL,0.50mL,1.00mL1.50mL,2.00mLµg/mL标准溶液
2..4.3仪器工作步骤及操作条件
开电源-开电脑-开乙炔气-双击AAPC-选择测定元素-火焰,选择-配置（S分光计配置）-点灯-光平衡-查看（测量参数（单位ug/mL，标准，测量）测量-测量结果-选择（选择报告条件）-查看（实时图）—点火—测量（空白，标准溶液，样品）-保存-打印-关机-关电源
表2.1各元素的仪器测试条件
Table2.1Instrumenttestconditionofeachelemen
元素
波长
/nm
光谱通带
/nm
灯电流
/mA
燃烧高度
/mm
乙炔—空气
流量/
（L/min）
背景
（氘灯）
Na
589.0
0.5
6.0
7.0
1.1
NON-BGC
Zn
213.9
0.5
6.0
7.0
1.2
NON-BGC
Ca
422.7
0.5
6.0
7.0
1.2
NON-BGC
Mg
285.2
0.5
5.0
7.0
1.1
NON-BGC
Cu
324.8
0.5
7.5
6.0
1.1
BGC-D2
Fe
248.3
0.2
5.0
9.0
0.9
BGC-D2
表2.2各元素的回归方程及相关系数
Table2.2Variouselementsregressionequationandcorrelationcoefficient
元素回归方程相关系数
CaA=0.0269C-0.00030.9986
KA=0.0014C-0.00010.9998
FeA=0.0609C+0.00220.9998
CuA=0.0965C-0.00040.9999
ZnA=0.4093C+0.00240.9996
NaA=0.1701C+0.03660.9969
按仪器的最佳工作条件，以空白溶液作参比溶液，分别将钙、钾、铁、铜、锌,钠等标准系列溶液导入原子吸收光谱仪，测定标准系列溶液的吸光度A，绘制标准曲线如图所示：
表2.3Ca标准系列溶液的吸光度（A）
Table2.3TheabsorbanceofCastandardseriessolution
浓度01.02.04.06.0
吸光度-0.00030.02660.05350.10730.1611
Ca
图2.1Ca的工作曲线（TheworkingcurveofCa）
表2.4K标准系列溶液的吸光度（A）
Table2.4TheabsorbanceofKstandardseriessolution
浓度0103050100
吸光度-0.00010.01390.04190.06990.1399
K
图2.2K的工作曲线（TheworkingcurveofK）
表2.5Fe标准系列溶液的吸光度（A）
Table2.5TheabsorbanceofFestandardseriessolution
浓度00.51.02.03.0
吸光度0.00220.032650.06310.1230.1849
Fe
图2.3Fe的工作曲线（TheworkingcurveofFe）
表2.6Cu标准系列溶液的吸光度（A）
Table2.6TheabsorbanceofCustandardseriessolution
浓度00.20.40.60.8
吸光度-0.00040.001530.03820.05750.0768
Cu
图2.4Cu的工作曲线（TheworkingcurveofCu）
表2.7Zn标准系列溶液的吸光度（A）
Table2.7TheabsorbanceofZnstandardseriessolution
浓度00.10.20.30.4
吸光度0.00240.043330.085260.125190.16612
Zn
图2.5Zn的工作曲线（TheworkingcurveofZn）
表2.8Na标准系列溶液的吸光度（A）
Table2.8TheabsorbanceofZnstandardseriessolution
浓度00.51.02.03.0
吸光度0.03660.121650.20670.037680.5469
Na
图2.6Na的工作曲线（TheworkingcurveofNa）
2.4.5康乃馨中微量元素的含量
测定样品中微量元素的含量，结果见表2.9：
表2.9样品中各微量元素的含量
Table2.9Sampleofaminorelementdeficienciesin
测定的元素CaKFeCuZnNa
平均浓度
（ug/ml）39.631216.5850.5256290.0929610.3972972.76828
含量
（ug/g）3963.121658.552.56299.296139.7297276.828
2.4.6方法精密度实验
取康乃馨样品溶液作方法的精密度实验，样品消解处理定容后，按本方法重复测定3次，以检测测定结果的精密度，并用相对标准偏差（RSD）表示。
测定元素的相对标准偏差（RSD）为0.14%—0.70%之间，分析结果满意。
2.5黄酮的测定
2.5.1实验试剂的配制：
①5%亚硝酸钠溶液的配制：
精密称取亚硝酸钠5.00g，用一定量的蒸馏水溶解后，移入100mL的容量瓶中，定容，备用。
②10%硝酸铝溶液的配制：
精密称取硝酸铝10.00g，用一定量的蒸馏水溶解后，移入100mL的容量瓶中，定容，备用。
③1.0mol/L氢氧化钠溶液的配制：
精密称取氢氧化钠4.00g，用一定量的蒸馏水溶解后，移入100mL的容量瓶中，定容，备用。
2.5.2标准曲线的制备：
2.5.2.1对照品溶液的制备
精密称取干燥至恒重的芦丁对照品0.0050g，加30%乙醇溶解并定容至50mL的容量瓶中，即得0.1mg/mL对照品溶液。
2.5.2.2标准曲线的绘制
分别取芦丁对照液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，分别至于10mL比色管中加乙醇至5mL；加入5%亚硝酸钠0.3mL，摇匀并放置5min；加入10%硝酸铝0.3mL，摇匀并放置6min；再加入1.0mol/L的氢氧化钠4mL；最后加30%乙醇0.4mL，溶液摇匀放置15min。
配成系列芦丁乙醇标准溶液，以试剂空白为参比，在510nm波长处测定吸光度。
测定结果以吸光度为纵坐标，以芦丁浓度为横坐标，绘制标准曲线，如图2.10所示.得回归方程：
A=0.0111C-0.0004，相关系数r=0.9992。
吸光度线性范围5-30g/mL。
图2.7芦丁标准曲线
Fig2.7Standardcurveofrutin
2.5.3总黄酮的提取方法
称取0.6—0.8g样品粉末，加入60mL60%乙醇放于100ml圆底烧瓶内，置于水浴锅上,70℃条件下回流提取60min。
过滤，定容于100ml。
量取提取液0.4mL，按上述的测定标准曲线的方法依次加入30%乙醇4.8mL，加入5%亚硝酸钠0.3mL，摇匀并放置5min；加入10%硝酸铝0.3mL，摇匀并放置6min；再加入1.0mol/L的氢氧化钠4mL；最后加30%乙醇0.4mL，溶液摇匀放置15min。
在510nm波长处测定吸光度。
根据回归方程求出相应的浓度，用下述公式计算康乃馨中总黄酮的含量：
总黄酮提取率%
式中：
m为样品粉末的重量（g）；C为样品总黄酮的浓度（g/mL）。
2.5.4黄酮物质含量的测定结果
准确称取康乃馨样品1.0000g,按照2.5.3提取方法连续操作五次,测出吸光度，按照测定芦丁标准液吸光度的测定吸光度重复4次然后把4次结果加起来，求平均值，根据标准曲线求出浓度计算康乃馨中提取物总黄酮的含量结果见下
表2.11黄酮含量的测定结果
Tab2.11Resultsdeterminationoftotalflavanonecontent
编号
样品质量（g）
平均吸光度A
质量浓度C/（g/L）
总黄酮含酮量%
平均含量
%
11.00030.2910.02636.561
21.00010.2890.02616.517
31.00040.2900.02626.5416.5344
41.00060.2910.02636.559
51.00020.2880.02606.494
2.5.6正交实验
在单因素实验的基础上，以总黄酮提取率为指标，W（乙醇）A、提取时间B、料液比C和溶剂D四个因素，选择L9（34）正交表安排实验，因素水平表见表2.12。
表2.12 正交实验因素水平表
Tab2.12Factorsandlevelsoforthogonaltest
水平
A/%
B/min
C/（g/ml）
D
1
40
30
1:
10
甲醇
2
60
60
1:
20
乙醚
3
80
90
1:
30
乙醇
2.5.7正交实验结果
按表12安排进行正交实验，正交实验结果及极差分析见表2.13。
表2.13 正交实验
Tab2.13Resultoforthogonaltest
实验号
A
B
C
D
K%
1
1
1
1
1
1.20
2
1
2
2
2
0.80
3
1
3
3
3
1.58
4
2
1
1
1
2.87
5
2
2
2
2
2.00
6
2
3
3
3
0.97
7
3
1
1
1
1.28
8
3
2
2
2
1.65
9
3
3
3
3
1.41
K1
1.193
1.783
1.273
1.537
K2
1.947
1.483
1.693
1.017
K3
1.447
1.320
1.620
2.033
R
0.754
0.467
0.420
1.320
从上表可以看出，影响康乃馨中总黄酮提取率的因素D＞A＞B＞C。
优化的提取工艺条件为：
A2B1C2D3，即提取溶剂为乙醇，溶剂质量分数60％，提取时间为60min，料液比为1:
20（g/mL），提取率为2.87％。
2.5.8精密度、重现性和稳定性试验
精密度：
准确吸取一定量的样品溶液于25mL容量瓶中，按上述操作方法测定其吸光度，连续测定6次，测得其RSD值为0.35%，表明仪器精密度良好。
重现性：
准确吸取6份同批样品溶液，按上述操作方法测定其吸光度，测得其RSD值为1.3%，表明该方法重现性良好。
稳定性：
准确吸取一定量的样品溶液按上述操作方法测定其吸光度，每隔30min测定一次，连续测定6次，测得其RSD值为1.6%，即样品溶液在3h内基本稳定。
2.5.9回收率实验
用标准加入法测定紫外检测的回收率，精确吸取样品溶液1.0mL，分别加入1.0mL、1.5rnL、2.0mL、2.5mL、3．0mL芦丁标准液定容至50mL后测定吸光度，将吸光度代入芦丁标准曲线方程计算出测定值，测定值比理论值（样品中芦丁量+标液中芦丁量）即得回收率[7]。
平均回收率为100.3％，回收率的相对标准偏差为0.90％，结果较令人满意。
表2.14iao-----------------------------------------------------------------------------------------___________________________________总黄酮测定的回收率实验
Tab2.14Therecoveriesoftotalflavanonecontent
样品溶液+芦丁标准液
样品溶液中芦丁量（mg）
加入的标准液中芦丁量（mg）
吸光度
测定值
回收率（％）
RSD（％）
1.0mL+1.0mL
0.5627
O.221O
0.610
0.7854
100.2
0.90
1.0mL+1.4mL
0.3315
0.675
0.8896
99.5
1.0mL+2.0mL
0.4420
0.754
1.0163
101.2
1.0mL+2.5mL
0.5525
0.825
1.1301
101.3
1.0mL+3.0mL
0.6630
0.880
1.2183
99.4
3.康乃馨微量元素的测定的分析
用湿法普通加热消化康乃馨样品，消解溶样时间和混酸溶剂的用量和样品的用量少，从而减少环境的污染：
火焰原子吸收光谱法测定康乃馨样品中微量元素的含量，方法快速简便，从而节省测定时间和减少麻烦。
测定元素的相对标准偏差（RSD）为0.34%—1.68%之间，由此可见，测定精密度高、准确度好，数据可靠。
结果表明，康乃馨中含有较丰富的能保证人体生理机能正常发挥作用的必需微量元素钙、铁、铜、钾、锌、钠等，
（1）Ca是骨骼和牙齿的重要组成部分,它还参与神经传导,肌肉收缩,调节体内代谢等生理活动,被称为生命元素[8]钙使得骨骼和牙齿具有坚硬的结构支架,幼儿及青少年缺钙会使得佝偻病和发育不良,老年人缺钙会发生骨质疏松,容易骨折,物极必反,对于钙的摄
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