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丁二酰化壳寡糖稀土配合物的合成表征及与DNA的作用

王霞李小芳

（天水师范学院生命科学与化学学院08级化学一班，甘肃天水741000）

摘要：

以丁二酸酐和壳寡糖为原料在在室温下合成了水溶性的丁二酰化壳寡糖和稀土离子La3+、Nd3+、Eu3+的配合物。

利用红外光谱、紫外吸收光谱和差热重热重分析对配合物进行了表征，并且以中兴红（NR）作探针研究了壳寡糖稀土配合物与鲱鱼精DNA的相互作用,获得了结合比。

实验结果显示：

结合比为nCS－La:

nDNA=?

nBCS－Eu:

nDNA=?

nBCS－Nd:

nDNA=?

随着DNA的加入，配合物在275nm处的紫外吸收峰不断增强，同时在528nm左右的荧光发射随着DNA浓度的增大均逐渐减小，说明配合物和DNA之间的作用方式为静电作用方式，NR与DNA之间的作用方式是嵌插作用方式，两者均影响其调控与表达，进而抑制肿瘤细胞的生长。

关键词：

丁二酸酐；壳寡糖；稀土配合物；鲱鱼精DNA；作用方式

Synthesis,characterizationandInteractionwithHerringSpermDNAofSuccinicacylationChitosanOligosaccharide-rareearthcomplexs

WangXiaLixiaoFang

（SchoolofLifeSciencesandChemistry,TianshuiNormalUniversity,Theclass08grade1,Tianshui741000,Gansu,China）

asaprobe.thecombiningratioofthebinarycomplexswereobtained.TheresultsindicatethatthecombiningratioofthebinarycomplexisnCS－La:

nDNA=?

nBCS－Eu:

nDNA=?

nBCS－Nd:

nDNA=?

AlongwithDNAtojoin,theultravioletabsorptionpeaksofcomplexsareconstantlystrengthenin275nm,whilethefluorescence-emissionAlongwiththeincreaseofconcentrationofDNAaregraduallydecreasein528nm.StudyindicatethechiefactionmodelbetweencomplexandDNAiselectrostaticeffectway,andtheactionmodelbetweenNRandDNAisanintercalationbinding.Theseinteractionmodeaffectsthedistributionandexpressionofgeneandresiststhegroethofcancercells.

KeywordsAcylationsuccinicanhydride；Chitooligosal-charide；rareearthcomplexs；HerringSpermDNA；actionmode

壳寡糖（Chitooligosal-charide·缩写为CS）又名低聚氨基葡萄糖，是壳聚糖降解得到的聚合度味2—20的部分产物，即由2—20个氨基葡萄糖通过β－1，

4—糖苷键连接而成的低聚糖。

具有抑菌、抗肿瘤、调血脂、调节免疫及活化肠道双歧杆菌等多种生理功能。

在室温下，溶于水、易溶于醋酸、黏度小、无毒害、易被吸收利用。

其活性基团是分子内的羟基自由基和氨基自由基，以氨基自由基最为显著。

由于羟基上有两个氢原子，在高温条件下与酰酐反应有可能会发生酰胺化和酰亚胺化两种结果，而在室温下由于反应条件温和，酰胺酸不能再次脱水转化成酰亚胺酸，主要为氧和氮上的酰胺取代的衍生物【1】。

任群翔等【2】的研究表明壳寡糖稀土配合物对羟基自由基有明显的清除作用，配合物与壳寡糖本身相比较对羟基自由基具有更高的抑制活性。

本文在室温条件下通过参考文献【3】不同投料比对产物的影响，控制投料比在0.75~2.00（酸酐与壳寡糖氨基物质的量比）之间使丁二酸酐与壳寡糖中的氨基配位合成了丁二酰化壳寡糖（BCS），研究了丁二酰化壳寡糖与稀土元素镧、铕和钕配合物的合成。

以及与鲱鱼精DNA的相互作用，利用中性红（NR）为探针，运用紫外吸收光谱测定其吸收峰和吸光度，用荧光光谱研究荧光性质，了解其作用原理及其用途，使其广泛应用与生物工程，医学等方面。

实验部分

材料及仪器

材料

鲱鱼精DNA（A.R.）为Sigma公司产品；壳寡糖（ML10000）济南海得贝海洋生物工程有限公司；LaCl3、NdCl3（甘肃稀土新材料股份有限公司）；EuCl3·6H2O（自制）；冰乙酸、无水乙醇、稀盐酸、丁二酸酐、氯化钠（均为化学纯）吡啶（分析纯）；壳寡糖、丁二酰化壳寡糖—镧、丁二酰化壳寡糖—钕、丁二酰化壳寡糖—铕：

用蒸馏水配制成5mg/mL的母液备用；

仪器

电子天平FA2004N（上海精密科学仪器有限公司、天平仪器厂制造）；磁力搅拌器79—1；SHB—IV双A循环水式多用真空泵（郑州长城工贸有限公司）；DHG

—9076A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）。

丁二酰化壳寡糖的制备

配置1%（体积比）乙酸溶液，称取3.0g壳寡糖、2.5g丁二酸酐，将称取的壳寡糖溶于75mL1%的乙酸溶液中，加入60mL的无水乙醇，搅拌下加入21mL的吡啶。

将称取的丁二酸酐溶于一定量的无水乙醇中，在搅拌下加入反应器。

室温下在磁力搅拌器上反应5~6个小时，反应之后沉降12h，抽滤，用无水乙醇多次洗涤，产物在65℃的烘箱中烘干，得到丁二酰化壳寡糖。

制备丁二酰化壳寡糖稀土配合物

称取0.50g丁二酰化壳寡糖，0.6993gEuCl3·6H2O，分别溶于适量的蒸馏水中，室温下搅拌将氯化铕溶液逐滴递加到丁二酰化壳寡糖溶液中，加完后搅拌3h，调节PH在6~7之间，调节后汲继续搅拌反应3h。

将反应物加入丙酮溶液中沉淀，隔夜沉降12h之后抽滤，将产物烘干，得到丁二酰化壳寡糖—铕（BCS-Eu）。

同理制备丁二酰化壳寡糖—镧（BCS-La）、丁二酰化壳寡糖—钕（BCS-Nd）。

称取的LaCl3质量为0.3958g、NdCl3质量为0.4785g.（实验所用稀土化合物与丁二酰化壳寡糖的摩尔比是1:

1）。

表征

红外光谱：

采用美国PE公司SpectrumOne3.0型傅里叶变换红外光谱测定；紫外吸收光谱：

采用日本岛津公司UV—2450型紫外可见光谱仪测定；荧光光谱：

采用日本牛津公司PC5301型荧光光谱扫描发射光谱；设定激发和发射狭缝宽度分别为3.0nm和3.0nm,激发波长是280nm.

丁二酰化壳寡糖稀土配与DNA的作用

1.5.1紫外吸收光谱

在100mLPH＝7.4的tris-HCl缓冲溶液中加入0.02g鲱鱼精DNA配制DNA溶液。

在10mL的比色皿中加入0.5mL5mg/mL的丁二酰化壳寡糖稀土配合物，用蒸馏水稀释3mL，保持其浓度不变，改变DNA的浓度测其紫外吸收光谱和吸光度，每次加入0.03mL的DNA，每一种稀土配合物溶液中均加十次。

配制浓度为9×10－6mol/L的中性红（NR）溶液，在每一种稀土配合物第十次加入DNA的基础上保持稀土元素和DNA的浓度不变，以NR做探针并改变其浓度进行滴定，测其紫外吸收光谱和吸光度，每次加入NR0.01mL，每一种稀土配合物溶液中均加十次。

在10mL的比色皿中加入3mL的NR溶液，保持其浓度不变，改变浓度DNA的浓度滴定，测紫外吸收光谱，每次加入DNA0.01mL，加十次。

在10mL的比色皿中加入0.5mL的DNA溶液，用蒸馏水稀释为2.5mL，保持其浓度不变，改变丁二酰化壳寡糖稀土配合物溶液的浓度对DNA进行滴定，测其紫外吸收光谱和吸光度，每次加入稀土配合物溶液0.02mL，加入五次。

荧光光谱

在10mL的比色皿中加入1.5mL的DNA溶液，1.5mL的蒸馏水，0.05mLNR溶液，保持其浓度不变，改变丁二酰化壳寡糖稀土配合物溶液的浓度进行滴定，测其荧光光谱，每次加入稀土配合物溶液0.05mL，加入九次。

结果与讨论

丁二酰化壳寡糖稀土配合物的红外光谱

CS、BCS以及BCS配合物的红外光谱如图1、图2所示。

CS以及BCS的红外光谱如图1所示。

CS与丁二酸酐配合后，位于3411.74cm-1处的峰移至3364.80cm-1处且加宽，此峰是BCS分子结构中醇的－OH，羧基中的－OH以及酰胺中的－NH振动峰的合并谱带，在0774.27cm-1出现了酰胺环上C=O的伸缩振动峰，1600cm-1处N－H的面内弯曲振动强吸收峰移至1618.96cm-1处，1069.91cm-1处的仲羟基伸缩振动吸收峰移至1073.93cm-1处，在495.66cm-1波数处出现丁二酸酐的特征吸收峰，1251.87cm-1和899.30cm-1处CS的特征吸收峰没有消失，其中899.30cm-1处是CS分子结构中环的特征吸收峰。

分析结果表明：

丁二酸酐与CS中－NH2上的N原子和仲羟基上的O原子均发生了反应，但没有改变CS的分子结构的主要骨架。

图1CS和BCS的红外光谱图

Fig.1FT-IRspectraofCSandBCS

图2BCS、BCS-Eu、BCS-La和BCS-Nd的红外光谱图

Fig.2FT-IRspectraofBCS、BCS-Eu、BCS-LaandBCS-Nd

BCS以及其配合物的红外光谱如图2所示。

BCS－Eu、BCS－La、BCS－Nd的主要成分均为BCS,所以4种谱图基本相似。

1364cm-1左右的吸收峰是－CH3的对称变形振动峰，775.70cm-1左右的吸收峰是－CH2的平面摇摆振动峰，但在某些波数处吸收峰又表现出明显的不同，BCS在3364.80cm-1处的宽且强的吸收峰在BCS－Eu、BCS－La、BCS－Nd中该吸收峰向高波数移动且逐渐变弱变窄，1618.96cm-1处的吸收峰向低波数移动，BCS在1776.64cm-1处的吸收峰在其配合物的谱图中消失，1073.93cm-1处的吸收峰向低波数移动并且在BCS－Eu、BCS－La、BCS－Nd中逐渐变弱。

分析结果表明：

BCS中的－NH3与仲羟基都与稀土离子Eu3+、La3+和Nd3+发生配位，其中Eu3+的配位最好。

丁二酰化壳寡糖稀土配合物的紫外吸收光谱

如图3为CS、BCS及其稀土配合物的紫外吸收光谱。

如图在223nm处较强的吸收峰是CS的特征峰，可能是由于CN3CONH－基团中的n→σ﹡跃迁引起的，谱线2与谱线1相比在255.236nm处有一强的K吸收带，这是因为引进的发散基团丁二酸酐含有的孤对电子发生了n→π﹡跃迁以及与CS形成共轭引起的，说明丁二酸酐与CS分子发生反应生成物中CS分子的结构未改变，BCS在275.5nm有一个弱的吸收峰，BCS－Eu、BCS－La各在272.236nm处有一个弱的吸收峰,BCS－Nd在273.30nm处有一个弱的吸收峰，相对于CS的吸收峰发生了明显的紫移，这是由于配合物中分子内电子跃迁所需能量较未配位的BCS高，说明BCS分子与Eu3+、La3+和Nd3+发生了配位作用。

图3CS、BCS、BCS-Eu、BCS-La和BCS-Nd的紫外光谱

CS,2-BCS,3-BCS-Nd,4-BCS–Eu,5-BCS-La

Fig.3UV-VisspectraofCS、BCS、BCS-Eu、BCS-LaandBCS-Nd

丁二酰化壳寡糖稀土配合物的热差热重分析

2.4丁二酰化壳寡糖稀土配合物与DNA作用的紫外分析

如图3是固定BCS－La、BCS－Eu、BCS－Nd的浓度，改变DNA浓度的紫外吸收光谱图。

紫外光谱显示加入DNA后，La、Eu、Nd这三种配合物在275nm左右处的吸光度（A）随着DNA与配合物浓度比（r=cDNA/cM）的增大而不断增强，并且蓝移了12nm，产生增色效应，增色，减色效应和等色效应是DNA特有的预期双螺旋结构密切相关的光谱性质【4。

5。

6】。

配合物吸收峰的增强可能是由于磷酸基团上所带的负电荷与稀土阳离子发生静电结合，使配合物在DNA表面发生长距离自组装【7】，从而产生蓝移现象。

图4DNA对BCS－La、BCS－Eu和BCS－Nd的紫外光谱的影响

Fig.4EffectofDNAontheUV-VisspectraofBCS-La、BCS-EuandBCS-Nd（PH=7.4）（CBCS－La、BCS－EuandBCS－Nd=0.83mg/mL）

（30μLperscan）,1～10：

0～300μL

固定BCS－La、BCS－Eu、BCS－Nd浓度，改变DNA浓度，在275nm处测定其吸光度，结果如图5所示。

即实验测得BCS－La与DNA的结合比【4.5.6】nCS－La:

nDNA=?

nBCS－Eu:

nDNA=?

nBCS－Nd:

nDNA=?

根据Beer定律，BCS稀土配合物-DNA溶液中的吸光度可表达为A=εbc。

式中ε代表BCS稀土配合物-DNA的摩尔吸光度，c代表BCS稀土配合物-DNA的浓度，即结合形成此复合物的DNA的浓度，b代表比色皿的厚度。

计算求得BCS－La的表观摩尔吸光系数ε=？

L/（mol.cm）、BCS－Eu的表观摩尔吸光系数ε=？

L/（mol.cm）、BCS－Nd的表观摩尔吸光系数ε=？

L/（mol.cm）。

如图6是固定BCS稀土配合物-DNA浓度，改变NR浓度的紫外吸收光谱图。

NR是一种常见的生物染料和光谱探针，它以嵌入作用方式与DNA结合，是一种较好的绿色光谱探针。

BCS稀土配合物-DNA在262nm处有特征吸收峰，加入NR后，溶液的吸收光谱发生了较大的变化，发现262nm处是增色效应，并且红移了7nm，同时BCS－La-DNA在320.4nm处出现了等色点、BCS－Eu-DNA在325.8nm处出现了等色点、BCS－Nd-DNA在321.0nm处出现了等色点。

紫外光谱图的变化表明BCS稀土配合物，DNA与NR三者存在新的共平衡体系，由于NR与DNA发生嵌插作用，所以NR对BCS稀土配合物与DNA的作用有竞争抑制作用。

图6BCS－La-DNA-NR，BCS－Eu-DNA-NR和BCS－Nd-DNA-NR的紫外光谱

Fig.6UV-VisspectraofBCS－La-DNA-NR，BCS－Eu-DNA-NRandBCS－Nd-DNA-NR（PH=7.4）

如图7是保持NR浓度不变，改变DNA浓度的谱图，NR在528.5nm处有特征吸收峰，NR中加入DNA是，吸收峰逐渐升高并且发生了红移，这是NR平面吩嗪环嵌插于DNA堆积的碱基对中所致。

根据何锡文和曹瑛【8】的研究，NR基本可作为小分子与DNA作用反方式的探针。

图7NR-DNA的紫外可见光谱

Fig.7UV-VisspectraofNR-DNAPH=7.4

（CNR=1.8×10-5g/L）;（10μLperscan）,1～10：

0～100μL

如图8是保持DNA的浓度不变，改变BCS-稀土配合物浓度的光谱图。

DNA的特征吸收峰在259.2nm处，随着BCS-稀土配合物的加入，BCS－Eu在浓度小于4.7×10-7g/L时吸收峰升高，大于4.7×10-7g/L时吸收峰又逐渐降低，这是由于在小浓度时部分BCS－Eu与DNA发生静电作用，浓度增大到一定程度时BCS－Eu在DNA溶液中达到了饱和，因此表现出BCS－Eu的吸收峰，吸收峰反而降低。

而再逐渐加入BCS－Nd和BCS－La时，随其浓度的增大DNA的特征吸收峰逐渐降低，是因为BCS－Nd和BCS－La在DNA中极易达到饱和，表现出的是DNA和BCS－Nd，BCS－La各自吸收峰的合并谱带，整体为吸收峰降低。

图8BCS－La、BCS－Eu和BCS－Nd对DNA的紫外光谱的影响

Fig.8EffectofBCS-La、BCS-EuandBCS-NdontheUV-VisspectraofDNA（PH=7.4）（CDNA=20mg/mL）

NR为探针研究丁BCS-稀土配合物与DNA作用荧光分析

如图9所示，在DNA-NR中加入0.05mL的BCS-稀土配合物时，荧光强度减小，加入0.1mL以上的BCS-稀土配合物时，荧光强度不断增加，减小是因为BCS-稀土配合物在浓度很小时主要表现为NR和DNA的嵌插作用，NR嵌插与DNA的碱基对作用完全，随着BCS-稀土配合物浓度增大，BCS-稀土配合物和NR与DNA作用存在竞争行为，也说明BCS-稀土配合物与DNA有部分嵌插成分【4.5.6】

（b）

（c）

图9BCS-稀土配合物对NR-DNA的荧光光谱影响

Fig.9EffectofBCS-Nd（a）,BCS-Eu（b）andBCS-La（c）onNR-DNAfluorescencespectra（PH=7.4）CNR=1.8×10-5g/L;CDNA=20mg/mL;

（50μLperscan）,1～9：

0～450μL

结论

壳寡糖与丁二酰之间发生反应生成了丁二酰化壳寡糖。

丁二酰化壳寡糖与稀土离子La3+、Nd3+、Eu3+之间发生了配位反应。

水溶性的丁二酰壳寡糖和壳寡糖稀土离子对DNA均有静电作用。

参考文献

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