总杞菊地黄丸定性鉴别和含量测定研究.doc
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杞菊地黄丸中各药材的定性鉴别及含量测定
一、处方
枸杞子40g菊花40g熟地黄160g酒萸肉80g牡丹皮60g山药80g茯苓60g泽泻60g
二、制法
以上八位味，取酒萸肉、牡丹皮、山药粉碎成细粉;泽泻、茯苓加水煎煮两次，第一次3小时，第二次2小时，滤过，滤液合并浓缩至相对密度为1.30—1.35（60—80℃）的稠膏；熟地黄切片，加水煎煮三次，第一次3小时，第二次2小时，第三次1小时，滤过，滤液合并浓缩至相对浓度为1.30—1.35（60—80℃）的稠膏；枸杞子以45%乙醇作溶剂，剩余的酒萸肉和牡丹皮及菊花已70%乙醇作溶剂，浸渍24小时后分别进行渗漉，收集渗漉液，合并上述渗漉液，回收乙醇浓缩至相对浓度为1.30—1.35（60—80℃）的稠膏；与上述细粉与稠膏混匀，制成浓缩丸，干燥，打光，即得。
三、性状
本品为棕色至棕黑色的浓缩丸，微甜而酸。
四、各药材的定性鉴别及含量测定
1、枸杞子
定性鉴别研究
实验仪器：
冷凝管3个，圆底烧瓶3个，离心管6个，硅胶G薄层板，分液漏斗1个
实验试剂：
乙酸乙酯，甲醇，甜菜碱对照品，甲苯
薄层板：
硅胶G薄层板
展开剂：
甲苯-乙酸乙酯-甲酸（15:
2:
1）的上层溶液
供试品溶液的制备方法：
取本品15g，研碎，加水100ml，加热回流30分钟3次，放冷，离心，取上清液，用乙酸乙酯50ml振摇提取3次，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，作为供试品溶液。
对照药材溶液的制备：
取枸杞子对照药材0.5g，加水50ml，加热回流30分钟3次，放冷，离心，取上清液，用乙酸乙酯30ml振摇提取3次乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，作为对照药材溶液。
对照品溶液制备：
取甜菜碱对照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液。
阴性对照溶液的制备：
取阴性样品（缺枸杞子药材的样品），按照供试品溶液制备的条件制备样品，得阴性对照溶液。
操作方法：
照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述两种溶液各10微升，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（15:
2:
1）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。
供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
2、山药
定性鉴别研究
实验仪器：
冷凝管1个，圆底烧瓶1个，分液漏斗1个，蒸发皿1个，硅胶G薄层板2个，离心管2个
实验试剂：
95%乙醇，乙酸乙酯，二氯甲烷，甲醇，浓氨试液，氯仿，10%磷钼酸乙醇溶液，香兰素硫酸溶液
薄层板：
硅胶G薄层板
展开剂：
乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液（9：
1：
0.5）；氯仿:
甲醇:
水（64:
50:
10）
显色剂：
10%磷钼酸乙醇溶液；香兰素硫酸溶液
供试品溶液的制备：
取本品8粒研碎，加二氯甲烷30ml，加热回流2小时，滤过，滤液蒸干，残渣加二氯甲烷1ml使溶解，作为对照药材溶液。
对照药材溶液的制备：
取山药对照药材5g，加二氯甲烷30ml，加热回流2小时，滤过，滤液蒸干，残渣加二氯甲烷1ml使溶解，作为对照药材溶液。
操作方法（薄层色谱法）
吸取上述2种溶液各4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液（9：
1：
0.5）或氯仿:
甲醇:
水（64:
50:
10）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以显色剂：
10%磷钼酸乙醇溶液或香兰素硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
3、茯苓
定性鉴别研究
实验仪器：
冷凝管1个，圆底烧瓶1个，分液漏斗1个，硅胶G薄层板2个
实验试剂：
甲醇，乙醇，乙酸乙酯，乙醚，10%硫酸乙醇溶液，2%香草醛酸溶液-乙醇（4:
1），三氯甲烷，茯苓多糖对照品。
薄层板：
硅胶G板
展开剂：
三氯甲烷-甲醇（3:
1）或正丁醇-冰乙酸-水（4:
1:
5上层）或甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20:
5:
0.5）
显色剂：
10%硫酸乙醇溶液或2%香草醛酸溶液-乙醇（4:
1）混合溶液
供试品溶液的制备：
取本品杞菊地黄丸（浓缩丸）15g，研碎，加水100mL，加热回流30分钟，放冷，离心，取上清夜，用乙酸乙酯50mL振摇提取3次，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，作为供试品溶液。
对照品溶液的制备：
取茯苓多糖加甲醇溶液1ml制成对照品溶液。
阴性对照品溶液的制备：
取阴性样品（缺茯苓药材的样品），按照供试品溶液制备的条件制备样品，得阴性对照溶液。
对照药材溶液的制备；
取茯苓对照药材1g，加乙醚50ml，超声处理10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，制成对照药材溶液。
操作方法：
照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述供试品溶液,对照药材溶液,阴性对照液，分别点于同一块硅胶G板上，以三氯甲烷-甲醇（3:
1）或正丁醇-冰乙酸-水（4:
1:
5上层）或甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20:
5:
0.5）或为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液或2%香草醛酸溶液-乙醇（4:
1）混合溶液，在105°C加热至斑点显色清晰，在紫外光（365nm）下检视。
4、泽泻
定性鉴别研究
实验仪器:
冷凝管3个、圆底烧瓶3个、硅胶G薄层板2个、离心管2个
实验试剂:
乙酸乙酯、乙醇、乙醚、丙酮，环己烷，石油醚，5%硅钨酸乙醇溶液，
薄层板:
硅胶G薄层板
展开剂:
环己烷-乙酸乙酯（1:
1）或石油醚-乙酸乙酯（3:
1）或三氯甲烷-丙酮（3:
1）
显色剂:
5%硅钨酸乙醇溶液
供试品溶液的制备:
方法1取本品杞菊地黄丸（浓缩丸）15g,加水100ml,加热回流30分钟3次，放冷，离心，取上清液，用乙酸乙酯50ml振摇提取，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。
方法2取本品杞菊地黄丸（浓缩丸）6g，研碎，加乙醚40ml,加热回流1小时3次，滤过，滤液挥去乙醚，残渣加丙酮1ml使溶解，作为供试品溶液。
方法3取本品杞菊地黄丸（浓缩丸）3g,研细，加乙醇40ml,加热回流30分钟3次，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。
对照药材溶液制备:
方法1取泽泻对照药材0.5g,加水50ml,加热回流30分钟3次，放冷，离心，取上清液，用乙酸乙酯30ml振摇提取3次，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。
方法2取泽泻对照药材1g,加乙醚40ml,加热回流1小时，滤过，滤液挥去乙醚，残渣加丙酮1ml使溶解，作为对照药材溶液。
方法3取泽泻对照药材1g,加60%乙醇40ml,加热回流30分钟，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。
阴性对照溶液的制备：
按处方比例称取除泽泻外的其他药材同法制成阴性对照品溶液。
操作方法:
照薄层色谱法（通则0502）试验，分别吸取上述供试品溶液,对照药材溶液,对照品溶液和阴性对照液各5μL、3μL、3μL、5μL点于同一块硅胶G板上，以环己烷-乙酸乙酯（1:
1）或石油醚-乙酸乙酯（3:
1）或三氯甲烷-丙酮（3:
1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷5%硅钨酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
5、熟地黄
定性鉴别研究
实验仪器：
容量瓶，玻璃漏斗1个，分液漏斗1个，硅胶G薄层板2个
实验试剂:
水饱和正丁醇，甲醇，毛蕊花糖苷对照品,0.1%2,2-二苯基-1-苦胼基无水乙醇溶液
薄层板：
硅胶G薄层板
展开剂：
乙酸乙酯-甲醇-甲酸（16:
0.5:
2）
显色剂：
0.1%2,2-二苯基-1-苦胼基无水乙醇溶液
供试品溶液的制备：
取本品（以下“本品”均指：
杞菊地黄丸，2010版药典中规定每8丸相当于饮片3g）8粒，研碎，加80%甲醇50ml，超声处理30分钟，滤过,滤液蒸干，残渣加水5ml使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取4次，每次10ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。
对照药材溶液的制备：
取熟地黄药材粉末lg,同法制成对照药材溶液。
对照品溶液制备：
取毛蕊花糖苷对照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液。
阴性对照溶液的制备：
取阴性样品（缺熟地黄药材的样品），按照供试品溶液制备的条件制备样品，得阴性对照溶液。
操作方法：
照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取供试品溶液5^1,对照品溶液2pl，分别点于同一硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯-甲醇-甲酸（16:
0.5:
2）为展开剂，展开，取出，晾干，用0.1%的2,2-二苯基-1-苦胼基无水乙醇溶液浸渍,晾干。
供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的颜色斑点。
6、牡丹皮
定性鉴别研究
实验仪器：
冷凝管3个，圆底烧瓶3个，硅胶G薄层板2个，玻璃漏斗1个
实验试剂：
乙醚，丙酮，环己烷，三氯甲烷，丹皮酚对照品,盐酸酸性5%三氯化铁乙醇溶液
薄层板：
硅胶G薄层板两个
展开剂：
环己烷-乙酸乙酯（3:
1）；环己烷-三氯甲烷-无水乙醇（7:
3:
1）
显色剂：
盐酸酸性5%三氯化铁乙醇溶液
供试品溶液的制备：
取本品6g，研碎，加乙醚40ml，加热回流1小时，滤过，滤液挥去乙醚，残渣加丙酮lml使溶解，作为供试品溶液。
对照药材溶液制备：
取牡丹皮对照药材lg，同法制成对照药材溶液。
对照品溶液制备：
取丹皮酚对照品，加丙酮制成每lml含lmg的溶液，作为对照品溶液。
阴性对照溶液的制备：
按处方比例称取除牡丹皮外的其他药材同法制成阴性对照品溶液。
阴性对照溶液制备其它各药材用量
药材名称
枸杞子
菊花
熟地黄
酒萸肉
山药
茯苓
泽泻
用量（g）
0.4138
0.4138
1.6552
0.8276
0.8276
0.6207
0.6207
操作方法：
照薄层色谱法通则（0502）试验，吸取供试品溶液，对照品溶液，阴性对照溶液各10ul分别点于同一硅胶G薄层板上,使成条状,以环己烷-乙酸乙酯（3:
1）或者环己烷-三氯甲烷-无水乙醇（7:
3:
1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性5%三氯化铁乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。
供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的条斑。
同时用阴性对照品与对照药材对比以排除浓缩丸中其他药材的干扰。
定量鉴别研究
本品方中牡丹皮为较主要的一味中药，故选其为测定对象。
根据文献的有关报道，牡丹皮中有效成分为丹皮酚及芍药苷等，中国药典2015年版该方中以丹皮酚为其含量测定项目，故本品以丹皮酚为含量测定指标，采用HPLC色谱法，并参考有关文献进行系统的方法学研究。
实验仪器：
高效液相色谱仪，具塞锥形瓶2个，25ml移液管1个，1ml移液管1个，分析天平（万分之一），冷凝管2个，圆底烧瓶2个。
实验试剂：
70%甲醇，甲醇-水（7:
3），丹皮酚对照品。
供试品溶液的制备：
取本品1.5g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25ml，密塞，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
对照品溶液制备：
取丹皮酚对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成每lml中含丹皮酚45ug的溶液,即得。
阴性对照溶液的制备：
按处方比例称取除牡丹皮外的其他药材,按杞菊地黄丸的制备工艺及供试品的制备方法制备阴性溶液。
阴性对照溶液其它各药材用量
药材名称
枸杞子
菊花
熟地黄
酒萸肉
山药
茯苓
泽泻
用量（g）
0.1035
0.1035
0.4138
0.2069
0.2069
0.1552
0.1552
色谱条件选择
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充柱；以甲醇-水（70:
30）为流动性；检测波长为274nm。
理论塔板数（n）的计算
n=16（tR/w）2
理论塔板数按丹皮酚峰计算不得少于3500。
拖尾因子
据公式T=W0.05h/2d1计算，
T范围在0.95-1.05之间。
分离度
据公式R=2（tR2-tR1）/（w1+w2）计算分离度（R≥1.5）。
阴性对照试验
将供试品溶液（按正文中条件制备），阴性对照溶液，丹皮酚对照品溶液各20ul，分别注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定。
（应该得到三个色谱图）结果阴性应无干扰。
线性试验
分别精密吸取对照品溶液4、8、12、16、20μl,按上述色谱条件,测定峰面积。
以色谱峰峰面积（y）为纵坐标,对照品进样量（x）为横坐标,绘制标准曲线并进行线性回归,得回归方程，相关系数r应不低于0.999。
精密度试验
重复性:
分别取同一批供试品,按供试品测定项下方法,重复制备样品6次,进行测定，计算含量平均值，结果用RSD值表示，一般要求RSD％＜3％。
中间精密度:
在同一个实验室，不同时间由不同分析人员,用不同设备测定结果之间的精密度，结果用RSD值表示，一般要求RSD％＜3％。
准确性（回收率）
取已知含量的样品，共6份，精密称定，分别精密加入一定量丹皮酚对照品，按照前述供试品溶液制备方法制备供试品溶液，定容。
按上述色谱条件进行测定，计算回收率，一般要求回收率应在95-105%之间,RSD％＜3％。
稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液,分别在制备后0、1、2、3、4、6、8、12h进样,测定色谱峰峰面积,计算峰面积积分平均值，结果用RSD值表示，一般要求RSD％＜3％。
耐用性试验
不同品牌或不同批号的同类型色谱柱；流动相的组成比例的变化；柱温；流速，检测波长等。
样品的含量测定
取不同批号制剂样品，分别按供试品溶液的制备方法制备，按上述色谱条件测定计算出样品中丹皮酚的含量，RSD％＜3％。
7、酒萸肉
定性鉴别研究
实验仪器：
冷凝管4个，圆底烧瓶4个，离心管2个，分液漏斗1个，硅胶G薄层板2个
实验试剂：
甲醇，30%乙醇，乙酸乙酯，乙醚，三氯甲烷，熊果酸对照品，10%硫酸乙醇
薄层板：
硅胶G薄层板
展开剂：
三氯甲烷-甲醇（3:
1）；正丁醇-冰乙酸-水（4:
1:
5上层）；三氯甲烷-甲醇-水（13:
7:
2下层）
显色剂：
10%硫酸乙醇
供试品溶液的制备:
取本品杞菊地黄丸（浓缩丸）15g，研碎，加水100mL，加热回流30分钟，放冷，离心，取上清夜，用乙酸乙酯50mL振摇提取3次，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，作为供试品溶液。
对照品溶液的制备:
取熊果酸对照品，加乙酸乙酯制成每lml含lmg的溶液，作为对照品溶液。
对照药材溶液的制备：
取山茱萸对照药材1g，加乙醚40ml，加热回流1h，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯1ml溶解，作为对照药材溶液。
阴性对照药材溶液的制备:
按处方比例和制法制备不含山茱萸的阴性样品，制成阴性样品溶液。
称取泽泻0.75g、茯苓0.75g和熟地黄2g，30ml水加热回流提取1个小时，过滤，提取液浓缩至一定浓度；取枸杞子0.5g、牡丹皮0.75g和菊花0.5g，70%乙醇加热回流提取1个小时，过滤，浓缩成适当浓度；合并以上两种浓缩液，加山药细粉1g；加70%乙醇20mL，加热回流提取1个小时，滤过，蒸干，加适量水溶解，分别用10ml乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，作为阴性对照溶液。
操作方法：
按照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述供试品溶液,对照品溶液，对照药材溶液,阴性对照液，分别点于同一块硅胶G板上，以三氯甲烷-甲醇（3:
1）或正丁醇-冰乙酸-水（4:
1:
5上层）或三氯甲烷-甲醇-水（13:
7:
2下层）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰，在紫外光（365nm）下检视。
供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上：
，显相同颜色的突光斑点。
8、菊花
定性鉴别
实验仪器：
冷凝管2个，圆底烧瓶2个，硅胶G薄层板2个，玻璃漏斗1个，分液漏斗1个
实验试剂：
硅藻土4g、稀盐酸，其中甲醇、乙醚、乙酸乙酯、石油醚、丙酮、冰醋酸均为分析纯，绿原酸对照品
薄层板：
硅胶G薄层板
展开剂：
甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸（24﹕8﹕1）
显色剂：
10%的硫酸乙醇溶液
供试品溶液的制备
方法1：
取本品（以下“本品”均指：
杞菊地黄丸，2010版药典中规定每8丸相当于饮片3g）8粒，研碎，加硅藻土4g，研匀。
加乙醚40ml，加热回流1小时，滤过，滤液挥去乙醚，残渣加丙酮1ml使溶解，作为供试品溶液。
方法2：
取本品8粒研碎，加蒸馏水100ml使溶解，加热回流30分钟，放冷，离心，用乙酸乙酯50ml振摇提取，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。
对照品溶液的制备：
对绿原酸对照品适量，精密称定，至棕色量瓶中，加70%甲醇制成每1ml含绿原酸35μg的对照品溶液，即得（10℃以下保存）。
阴性对照溶液的制备：
取阴性样品（缺菊花药材的样品），按照供试品溶液制备的条件制备样品，得阴性对照溶液。
对照药材溶液的制备：
取菊花对照药材1g，剪碎，加石油醚（30~60℃）20ml，超声处理10分钟，弃去石油醚，药渣挥干，加稀盐酸1ml与乙酸乙酯50ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为对照药材溶液。
操作方法：
依据薄层色谱法（中国药典2010版一部附录ⅥB）试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液、阴性对照溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸（24﹕8﹕1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%的硫酸乙醇溶液，在105℃烘至斑点显色清晰，并对结果进行分析。
供试品色谱中，在于对照品色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点。
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