中国药科大学本科毕业论文.docx

中国药科大学本科毕业论文.docx

《中国药科大学本科毕业论文.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《中国药科大学本科毕业论文.docx（29页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

中国药科大学本科生毕业论文（设计）

金线莲总黄酮测定方法的研究

目录

摘要…………………………………………………………………………………………3

前言………………………………………………………………………………………………5

第一章材料……………………………………………………………………………………7

1.1药物和试剂………………………………………………………………………………7

1.2主要仪器…………………………………………………………………………………7

1.3供试品……………………………………………………………………………………7

第二章HPLC分析黄酮苷成分…………………………………………………………8

2.1色谱条件…………………………………………………………………………………8

2.2检测波长的选择………………………………………………………………………8

2.3对照品的制备…………………………………………………………………………9

2.4供试品的制备…………………………………………………………………………9

2.5线性关系考察…………………………………………………………………………9

第三章紫外法测定总黄酮含量…………………………………………………………11

3.1对照品的确定………………………………………………………………………11

3.2测定波长的选择………………………………………………………………………11

3.3不同提取方法的考察………………………………………………………………12

3.4对照品的制备…………………………………………………………………………17

3.5供试品的制备…………………………………………………………………………17

3.6标准曲线的制备………………………………………………………………………17

第四章方法考察……………………………………………………………………………18

4.1稳定性试验……………………………………………………………………………18

4.2精密度试验…………………………………………………………………………20

4.3重复性试验…………………………………………………………………………22

4.4加样回收率…………………………………………………………………………23

第五章结果…………………………………………………………………………………25

5.1样品测…………………………………………………………………………………25

5.2正交试验结果和分析……………………………………………………………25

第六章讨论…………………………………………………………………………………28

参考文献…………………………………………………………………………………29

致谢………………………………………………………………………………………30

金线莲总黄酮测定方法的研究

摘要：

目的：

探讨金线莲总黄酮实验室提取工艺的最佳方法，从而为金线莲的开发研究以及实验室提取金线莲总黄酮提供相关实验数据和实验思路。

方法：

首先，通过HPLC法对金线莲黄酮苷成分进行分析定量，再通过对金线莲单因素提取方法（索氏提取、回流法、超声提取、冷浸法、温浸法），乙醇和甲醇提取溶剂的差异，提取溶剂含量和体积的差异，不等的提取时间以及不同的提取温度的考察，从中选取重要影响因素（提取温度、提取时间、溶剂含量和料液比）和最优点，制定正交试验表。

按照正交试验表所制定的实验条件，在375nm波长下进行UV法直接测定黄酮含量，获得数据，对数据进行处理，制作方差分析表和极差分析表。

结果：

提取温度、提取时间、溶剂含量和料液比对金线莲总黄酮含量影响显著，其中影响因素大小为溶剂含量>提取时间>料液比>提取温度。

结论：

该法能准确地对金线莲黄酮类含量进行分析，准确快速。

关键词：

金线莲；总黄酮；提取方法；

StudythedeterminationmethodoftotalFlavonoidsfromAnoectochilusroxburghii

Abstract：

Objective:

ToresearchthesuitableforextractionmethodinAnoectochilusroxburghii（Wall）Lindl.inordertothedevelopmentofAnoectochilusroxburghii（Wall）Lindl.researchandtatolflavonoidsextractionofAnoectochilusroxburghii（Wall）Lindl.inthelaboratoryandprovidetherelatedexperimentdataandideas.

Methods:

First,analyzingtatolflavonoidsingredientsquantitativeofAnoectochilusroxburghii（Wall）Lindl.byHPLC,throughsinglefactorextractionmethodsofAnoectochilusroxburghii（Wall）Lindl.（soxhletextraction,refluxextraction,ultrasonicextraction,coldsoakextraction,warmimmersionextraction）,thedifferenceofethanolandmethanolextractionsolvents,thecontentoftheextractionsolventandthedifferencesinvolume,theexplorationofextractiontimeandextractiontemperature,choosingtheimportantinfluencefactors（extractiontemperature,extractiontimeandsolventcontentandtheratioofmaterialandliquidthe）andthemostadvantage,andformulatingorthogonaltesttable.Accordingtoorthogonaltesttableoftheexperimentalconditions,determinatingdirectthecontentsoftatolflavonoidsunderthe375nmUV-Visspectrophotometry,andgettingthedataanddisposingofthedata,analysisingofvariancetableandextremingdifferenceanalysistable.

Results:

Extractiontemperature,extractiontime,solventcontent,andtheratioofmaterialandliquidtheonthetotalflavonoidsofAnoectochilusroxburghii（Wall）Lindl.effectsignificantly,thefactorsaffectingthesizeforthesolventcontent>extractiontime>theratioofmaterialandliquidthe>extractiontemperature.

Conclusion:

Themethodcanaccuratelyanalyzethecontentoftatolflavonoidsinlotus,fast.

Keywords:

Anoectochilusroxburghii（Wall）Lindl.;Totalflavonoids;Extractionmethod;

前言

金线莲（Wall.）Lindl.Anoectochilusroxburghii为兰科开唇兰属珍稀濒危药用植物，又名金线兰、花叶开唇兰等，民间素有“药王”、“金草”之美誉[1]，在我国福建、广西、广东、云南和台湾等省份都有分布，具有清热凉血、祛风利湿、降血压等功效。

全国最大的金线莲产区是福建省，其产区规模正在逐渐扩大，已成为福建特色中草药之一。

金线莲具有很好的药用价值，民间多用于治疗糖尿病、高血脂、乙型肝炎等疾病，由于繁殖率低、生长环境独特、鸟类嗜食等原因，野生金线莲资源日渐枯竭，随着其功效应用的扩大，需求量不断增大，人工培育的金线莲已日渐形成规模[2]。

金线莲中主要成分有黄酮类化合物、甾体类化合物、三萜类化合物、生物碱、糖类、氨基酸、微量元素等，其中黄酮类化合物有槲皮素、异鼠李素、山奈酚，甾体类化合物有豆甾醇、开唇兰甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇等，三萜类化合物有木栓酮、琥珀酸、阿魏酸、胡萝卜苷、香豆酸、熊果酸、棕榈酸、齐墩果酸等。

自然界存在于金线莲中的总黄酮成分，大部分与葡萄糖或鼠李糖结合成糖苷，少量的为鞣质或游离态存在，所以简单的加乙醇并不能将黄酮类化合物提取出来，故在加提取溶剂的同时，加少量的盐酸，促进黄酮类化合物水解出峰。

黄酮化合物一般具有基本骨架结构C6-C3-C6。

目前，对黄酮类化合物的研究国内外已比较深入，其定量方法常用HPLC法和UV法，在生产和科研中，对黄酮单体定量常用HPLC法；HPLC法测黄酮含量，根据文献资料甲醇-水-磷酸（52:

48:

0.04）但峰间距小，不易画基线，对比例进行了调整，随着甲醇比例的减小，峰间距加大分离度加大[3]。

而对于总黄酮的测定，因为UV法具有准确、重复性好、易掌握等优势，所以该法用于测定总黄酮含量最为普遍。

UV法常用法有直接测定法和显色测定法。

直接测定法是不使用显色剂，根据黄酮自身结构，直接在其特征吸收峰出测定，该方法对于单成分样品测定准确、简便、快速;但对于中草药来说，杂质干扰大，出现误差可能性大，常采用的是碱性条件显色测定法，一般认为直接测定弱于显色测定的结果，且皂苷、多糖对试验均无干扰，但对于此次的紫外测定金线莲则由于植物自身原因，而选择了直接测定法测定总黄酮含量。

对金线莲进行现代应用研究自1990年后才开始，主要集中在组织培养、人工种植、化学成分和药理作用的研究。

《中国药典》中尚未对金线莲进行收载，故做此实验不仅完善金线莲的实验室提取工艺，而且对金线莲在药典中的收载做出些参考。

第一章材料

1.1药物和试剂

槲皮素（批号100081-200907,含量96.5%）购自中国食品药品检定研究院；

山奈酚（批号110860-201109,含量99.0%）购自中国食品药品检定研究院；

异鼠李素对照品（批号110861-200808,含量95.9%）购自中国食品药品检定研究院；

甲醇、乙醇、磷酸均为分析纯；

水为超纯水；

1.2主要仪器

Agilent1100液相色谱仪（安捷伦公司）；

HH-6恒温水浴锅（国华电器有限公司）；

JY10002电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；

UV-2450紫外分光光度计（日本岛津公司）；

超纯水器（MiliQDirect8）。

1.3供试品

金线莲粉末（南平市人民医院提供）

第二章HPLC分析黄酮苷的成分

2.1色谱条件

色谱柱为GraceVisionHTC18（250mm×4.6mm,5µm）,流动相为甲醇-0.04%盐酸（45：

55），流速为1mL/min，检测波长为374nm，结果见图1。

图1对照品（A）、供试品（B）高效液相色谱图；

1.槲皮素（Quercetin）；2.山柰酚（Kaempferol）；3.异鼠李素（Isorhamnetin）

B

A

2.2检测波长的选择

取槲皮素、山柰酚、异鼠李素对照品在205nm~600nm波长范围内进行扫描，结果显示槲皮素在256nm和375nm波长下有最大吸收波长，山柰酚在266nm和371nm波长下有最大吸收波长，异鼠李素在256nm和374nm下有最大吸收波长，见图2，由图2可知，三种物质在256nm-266nm,371nm-375nm波长范围内有最大吸收，371nm-375nm波长的吸收峰明显高于256nm-266nm波长，同时峰形好，且最大吸收波长相对较一致，故选择374nm作为测定波长。

图2对照品紫外扫描图谱

1槲皮素；2山柰酚；3异鼠李素；

2.3对照品品溶液的制备

精密称取槲皮素3.35mg,山柰酚4.41mg,异鼠李素7.33mg分别置25mL量瓶中，用60%乙醇溶解并定容，分别得对照品储备液Ⅰ（槲皮素129.3µg/mL）、Ⅱ（山柰酚169.2µg/mL）、Ⅲ（异鼠李素289.9µg/mL），分别精密吸取上述3种溶液各1mL，置于10mL量瓶中，加60%乙醇至刻度，即得混合对照品溶液（槲皮素12.93µg/mL、山柰酚16.92µg/mL、异鼠李素28.99µg/mL）。

2.4供试品溶液的制备

取样品约0.5g，精密称定，置100mL锥形瓶中，精密加入甲醇25mL、盐酸1.5mL，于水浴中回流1.5小时，放冷，过滤，取续滤液，即得。

2.5线性关系考察

取混合对照品溶液，分别进样1µL、2µL、5µL、10µL、20µL，以质量为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，结果见图3。

槲皮素、山柰酚、异鼠李素的线性范围分别为：

12.95~258.6ng;16.92~338.4ng；28.99~579.8ng。

图3混合对照品标准曲线

第三章紫外法测定总黄酮含量

3.1对照品的确定

对续滤液的NaNO2-Al（NO3）3-NAOH的显色处理后颜色比未显色续滤液浅，且发现金线莲相关文献内未有有芦丁的记载，故对槲皮素、山柰酚、异鼠李素进行紫外200nm-800nm的波长扫描，60%乙醇作为空白，三者波形相似，在256nm左右和375nm左右波长有最大吸收峰，处于易获得和低成本的考虑，选用槲皮素作为对照品。

3.2测定波长的选择

精密称取适量的槲皮素对照品，60%乙醇溶解，作为对照品溶液；精密称取1.0g金线莲粉末，用60%乙醇50mL水浴回流3小时，在205~550nm波长范围内进行扫描，并导出测定波长的选择，结果见图4、5。

图4对照品零阶（A）、一阶（B）、二阶（C）导数光谱图

图5供试品零阶（A）、一阶（B）、二阶（C）导数光谱图

A

C

B

B

由图4可知，对照品在对照品在256nm和375nm处零阶图谱有最大值，一阶图谱过零点，二阶图谱分别有过零点和最小值，且振动有规律，得对照品在256nm和375nm处有最大吸收波长；由图5可知供试品在256nm和375nm处零阶导数图谱有最大吸收值，一阶导数图谱分别有过零点和最小值，二阶图谱都有最小值但256nm点无振动规律，375nm点振动有规律，且256nm波长处检测波不稳定，故选择375nm作为最佳吸收波长。

3.3不同提取方法的考察

3.3.1不同提取方法对含量的影响

精密称取金线莲粉末1.0g,加60%乙醇提取，结果见表1和图6。

表1不同提取方法对含量的影响

方法

索氏提取法

回流法

超声提取法

温浸法

冷浸渍法

取样量/g

1.0001

1.0017

1.0019

1.0020

1.0004

WL375

0.225

1.291

1.042

1.164

1.084

WL256

0.54

0.519

0.392

0.437

0.404

溶剂含量

60%

60%

60%

60%

60%

提取时间

3小时

3小时

0.5小时

6小时

24小时

料液比

100

50

50

50

50

提取温度

每秒2-3滴回流.95°C

每秒2-3滴回流,95°C

20°C

60°C

20°C

图6不同提取方法的吸光度比较

由表1和图3可知，在不同提取方法提取条件达到较好的情况下，回流法的提取效果最佳，且从提取时间实际情况考虑，可作为实验室提取金线莲黄酮类成分的首选方法。

3.3.2溶剂类型和溶剂含量对吸光度影响的考察

精密称取金线莲粉末0.2g，置锥形瓶中，加浓度不等的乙醇和甲醇95°C水浴回流2小时，放冷过滤，取续滤液3mL在25mL容量瓶中，60%乙醇稀释至刻度线，在紫外375nm和256nm测定吸收值,结果见表2、图7和表3、图8。

表2乙醇浓度对吸光度影响测试结果

乙醇浓度/%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

取样量/g

0.2043

0.2073

0.2001

0.2017

0.2039

0.2047

吸光值375nm

0.052

0.074

0.091

0.117

0.238

0.213

吸光值256nm

0.219

0.253

0.268

0.285

0.332

0.218

图7乙醇浓度对吸光度影响测试结果图

表3甲醇浓度对吸光度影响测试结果

甲醇浓度/%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

取样量/g

0.1994

0.1995

0.1988

0.2021

0.2064

0.2030

吸光度256nm

0.217

0.276

0.522

0.318

0.301

0.302

吸光度375nm

0.043

0.090

0.161

0.112

0.111

0.243

图8甲醇浓度对吸光度影响测试结果图

由表2、图4和表3、图5可知，甲醇、乙醇浓度对提取液吸光度影响较大，乙醇浓度0-60%和甲醇浓度60-100%供试品吸光值基本保持不变，80%乙醇的最大吸收值和40%甲醇最大吸收值相近，而乙醇无毒易得，相比较下，乙醇比甲醇更适合作提取溶剂。

3.3.3料液比对含量影响的考察

精密称取金线莲粉末0.2g，用80%乙醇25mL水浴95°C回流2小时，放冷过滤，取续滤液3mL置25mL容量瓶中，80%乙醇定容至刻度线。

375nm和256nm紫外分光光度法测定,结果见表4和图9。

表4料液比对含量影响的测试结果

溶剂体积/mL

10

20

30

40

50

60

取样量/g

0.2036

0.2021

0.2005

0.2035

0.2017

0.2067

吸光度375nm

0.651

0.47

0.374

0.308

0.238

0.207

吸光度256nm

1.278

0.733

0.5

0.402

0.308

0.267

图9料液比对含量影响的测试结果图

由表4和图6可知，随着料液比的增大，吸光度也在增大。

料液比在50-200之间，吸光度在逐渐上升，而其在200-300之间，吸光度保持基本不变。

3.3.4提取温度对含量的影响

精密称取金线莲粉末0.25g，用80%乙醇25mL加热回流2小时，放冷过滤，取续滤液3mL置25mL容量瓶中，80%乙醇定容至刻度线。

375nm和256nm紫外分光光度法测定，结果见表4和图10。

表4提取温度对含量影响的测试结果

提取温度/°C

70°C

80°C

90°C

100°C

取样量/g

0.2465

0.2560

0.2545

0.2511

吸光度375nm

0.569

0.466

0.505

0.555

吸光度256nm

0.709

0.716

0.703

0.749

图10提取温度对含量影响的测试结果图

由表4和图7可知，温度从70-80°C呈现下降的趋势，而温度从80-100°C呈现的是上升的趋势，因此温度在70°C为四个值中的最佳提取温度。

3.3.5提取时间对含量的影响

精密称取金线莲粉末0.25g，加80%乙醇25mL在100°C水浴回流不等时间，在375nm和256nm紫外下检测吸光值，结果见表5和图11。

表5提取时间对含量影响测试结果

时间/h

0.5

1

1.5

2

3

4

取样量/g

0.2559

0.2561

0.2508

0.2476

0.2561

0.2495

吸光度375nm

0.566

0.581

0.384

0.510

0.56

0.629

吸光度256nm

0.746

0.735

0.631

0.712

0.773

0.773

图11提取时间对含量影响测试结果图

由表5和图8可知，随着时间的变化0.5-1.5小时吸光值在下降，1.5-4小时吸光值在逐渐上升，在1.5小时处，为提取值最低点，提取时间和吸光度并未成比例关系。

从表看来，提取时间越久越好，但从实验室的效益和可行性来看，1小时为最佳提取时间。

3.4对照品的制备

精密称取槲皮素对照品11.98mg置25mL量瓶中，用60%乙醇溶解并定容，得对照品储备液（槲皮素479.2µg/mL），精密吸取上述溶液1mL，置于25mL量瓶中，加60%乙醇至刻度，即得对照品溶液（槲皮素19.17µg/mL）。

3.5供试品的制备

精密称取金线莲粉末约0.2g，置锥形瓶中，精密加入80%乙醇60mL于100°C水浴回流1小时，冷却，过滤，精密量取续滤液3mL置25mL量瓶中，80%乙醇稀释至刻度线，

另用80%乙醇做空白溶液,375nm波长测定总黄酮含量。

3.6标准曲线的制备

减量称量法称取1.2mg槲皮素置25ml容量瓶中，60%乙醇溶解并定容，分别吸取0mL,1mL,2mL,3mL,4mL,5mL,6mL置于25ml容量瓶中，用同溶剂定溶，定溶液做为空白溶液。

在375nm做标曲，结果见图12。

图12槲皮素标准曲线

第四章方法考察

4.1稳定性试验

取混合对照品溶液和样品溶液分别在0、2、4、8、16、24小时后HPLC测定含量，结果见表6,7，表明对照品和样品在24h内稳定。

表6混合对照溶液稳定性试验结果

组分

时间/h

峰面积/mAu

平均值/mAu

RSD/%

槲皮素

0

545.76

538.74

1.54

2

541.75

4

542.23

6

540.14

8

542.31

16

538.41

24

520.61

山柰酚

0

613.98

604.83

1.24

2

611.35

4

612.45

6

601.32

8

600.11