药学本科毕业论文中国药科大学.docx
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药学本科毕业论文中国药科大学
药学本科毕业论文（中国药科大学）
本科毕业论文
论文标题TQ0701对大鼠脑缺血再灌注
损伤的维护作用
英文标题ProtectiveeffectsofTQ0701on
cerebralischemicreperfusioninjuryinrats
专业中药学
院部中药院
学号0543428
姓名刘振兵
指点教员王秋娟
课题
完成场所中国药科大学药学院生理教研室
论文任务时间：
2020年03月至2020年06月
TQ0701对大鼠脑缺血再灌注损伤的维护作用
TQ0701对大鼠脑缺血再灌注损伤的维护作用
学号0543428姓名刘振兵
摘要：
目的:
讨论新型的化合物TQ0701对大鼠脑缺血再灌注损伤维护作用的有效性，从而为该化合物的机制研讨以及临床运用开发提供相关实验数据和实验思绪。
方法:
将60只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性对照组〔依达拉奉3mg/kg〕、TQ0701低剂量组（1.5mg/kg）、中剂量组（3mg/kg）、高剂量组（6mg/kg）各10只。
假手术组仅停止手术而不形成缺血形状，其他各组均采用Longa线栓法制备大鼠MCAO模型，在缺血2h后停止再灌注。
给药组和阳性对照组区分在缺血前30min以及再灌注0、2h尾静脉注射TQ0701和依达拉奉，假手术组和模型组那么给予等量的0.9%氯化钠溶液。
再灌注24h后观察大鼠神经功用评分、脑组织梗塞百分率和病理组织学的改动。
结果:
模型组大鼠的神经功用评分和脑组织梗塞百分率同假手术组、阳性对照组以及TQ0701三个剂量组相比有清楚差异，阳性对照组与TQ0701三个剂量组相比未见清楚差异。
同时电镜观察结果也发现TQ0701三个剂量组及阳性对照组与模型组相比神经细胞病理改动较轻。
结论：
化合物TQ0701对急性脑梗死有清楚的维护作用。
关键词：
TQ0701；脑缺血再灌注；依达拉奉；
ProtectiveeffectsofTQ0701oncerebralischemicreperfusioninjuryinrats
Abstract:
Aim:
ToinvestigatetheeffectsofTQ0701bydynamicchangesofinfarctvolumesandneurologicaldeficitscoresonlocalcerebralischemic-reperfusioninjuryinrats.Method:
MaleSDratswererandomlydividedintosham-operatedcontrolgroup（n=10）,normalsalinecontrolgroups（n=10）,edaravone-treatedgroup（3mg/kg）（n=10）andTXL-treatedgroups（6mg/kg,3mg/kgand1.5mg/kg）（n=10each）.Animalsinthelatterfourgroupsweresubjectedtotransientfocalischemiabythemiddlecerebralarteryocclusion（MCAO）for120minutes.TheratswerepretreatedwithnormalsalineorTXL30minbeforeischemicand0min,2hoursafterreperfusion.After24hoursofreperfusion,infarctvolumesweredeterminedby2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride（TTC）andneurologicalscoreswereinvestigated.Results:
InfarctvolumesinTQ0701-treatedgroupsweresignificantlydecreasedcomparedwiththoseincontrolgroupsat24afterMCAO,andtheneurologicaldeficitscoresinTQ0701-treatedgroupsweresynchronouslyimproved.Conclusion:
TheseresultsshowthattreatmentwithTQ0701canattenuatebraininjuryandTQ0701maybeapotentialneuroprotectiveagentincerebralischemia-reperfusion.
Keywords:
TQ0701;cerebralischemicreperfusion;edaravone
前言
目前，脑血管病严重危害人类安康，已成为三大死亡缘由之一，其中缺血性脑血管病约占56.6%～80%。
因此关于脑血管病治疗药物的研讨与开发具有很大的实践价值和前景。
随着对急性脑缺血再灌注和缺氧复氧损伤研讨的停顿，对脑梗塞的病理生理机制有了新的看法。
少量研讨曾经证明了急性缺血后恢复血液灌流，会使病变加剧而发作再灌注损伤。
目前主要从细胞内钙离子、NMDA受体、自在基、花生四烯酸代谢、缺血区酸碱平衡破坏、基因表达及蛋白质的磷酸化等方面，对脑缺血再灌注损伤的机理和防治展开了普遍而深人的研讨。
下面就几个最基础的病理生理机制停止讨论。
1.钙与缺血缺氧性脑损伤
细胞内钙作为第二信使、代谢调理因子和膜动摇剂在细胞正常机能活动中起重要作用，亦可介导多种病理状况下的细胞死亡。
生理状况下，钙在细胞内外存在很大的浓度差，这依赖于膜正常通透性及胞浆钙外排机制来维持，后一进程需消耗能量。
脑缺血缺氧时主要由于ATP供应缺乏、N-甲基-D-门冬氨酸（NMDA）受体过度兴奋介导与其偶联的钙通道开放、膜通透性增大及封阻机制阻碍而致细胞外钙内流添加、胞浆钙外排阻碍，形成细胞内Ca2+浓度增高[1]。
细胞内Ca2+超载，一方面使血管收缩、进一步减轻脑缺血缺氧；同时惹起细胞代谢、结构与功用多方面的异常改动，从而招致细胞死亡。
2.自在基连锁反响
脑缺血再灌注时，可经过黄嘌呤氧化酶、线粒体系统、白细胞系统、花生四烯酸相关酶系统、一氧化氮分解酶（NOS）系统等使自在基少量发生，同时自在基进攻系统功用受损，静态平衡被打乱。
自在基具有很高的化学活性，可快速攻击其它化合物的分子并发生更多的自在基，自在基破坏膜结构中蛋白成分、惹起膜脂质过氧化，招致膜损伤、线粒体功用阻碍、溶酶体分裂、细胞溶解和组织水肿等一系列损害作用，称之为自在基连锁反响[2-4]。
近年少量研讨证明，氧自在基介导的自在基连锁反响是招致脑缺血缺氧与再灌注复氧损伤的主要缘由。
3.兴奋性氨基酸的神经毒性作用
生理状况下，兴奋性氨基酸作为正常的神经递质，在神经元之间的信息传递中发扬重要作用。
突触前膜释放的谷氨酸〔GIU〕主要经过神经细胞膜上的高亲和性摄取系统摄取灭活，细胞外液GIU浓度维持在1umol/L左右。
病理形状下，GIU经过使神经元过度兴奋而发扬其神经毒作用。
在脑缺血缺氧时，GIU少量释放，同时其再摄取机制受阻，在突触中堆集，使NMDA受体过度兴奋，启动NMDA受体的控钙通道而使外钙少量内流，由此引发神经细胞的损伤。
目前以为，细胞内钙超载是介导兴奋性氨基酸递质神经毒性作用的关键要素。
GIU主要与局灶性或不完全性脑缺血性损伤有关[5]。
4.脑内NO的神经细胞毒性作用
NO在脑缺血损伤中的作用能够是双重性的。
它一方面可经过舒张脑血管和抑制血小板聚集，下调NMDA受体，从而改善组织灌流、对缺血边缘区脑组织施加直接维护作用，减轻缺血性损害；另一方面可经过构成自在基或其它途径，而发生神经毒性，减轻缺血损伤，促使缺血区边缘脑组织向梗死开展。
5.花生四烯酸代谢失衡
脑缺血再灌注时，经过AA代谢发生少量的TXA2、PGF2及白三烯（LT）C4、B4等物质。
同时，由于分解酶抑制或内皮细胞损伤而致与TXA2、PGF2具有对立作用的PGI2发生增加，形成TXA2/PGI2比值失衡。
TXA2、PGF2和白三烯等可致血小板聚积、脑血管痉挛和血管通透性添加，减轻脑缺血和脑水肿构成，招致缺血后迟发性低灌注损伤[6]：
LTB4和12-羟花生四烯酸对白细胞浸润和激活起着缩小作用。
并且，AA自身代谢进程中，可发生少量O2-，从不同途径招致组织损伤。
可见，AA代谢失衡在脑缺血再灌注损伤中起着十分重要的作用。
依达拉奉首先由日本三菱东京制药株式会社开发，2001年6月刚刚在日本上市。
1984年日本三菱东京制药株式会社依据酚类化合物具有强的自在基肃清作用的原理,经过屡次挑选,终于研收回一种神经元维护剂（自在基肃清剂）依达拉奉。
它是一种安替吡啉的代谢产物，其在体内以阴离子方式存在，血脑屏障通透性高，静脉给药可肃清大脑内具有高度细胞毒性的羟自在基。
因此，该药最早用于脑缺血性病变急性期治疗。
研讨说明，作为自在基肃清剂，依达拉奉可有效改善脑组织缺血再灌注损伤。
脑缺血再灌注后，过多的氧自在基招致脑组织直接损伤及细胞膜脂质过氧化，破坏细胞膜结构和完整性，惹起细胞膜通透性添加，细胞毒性水肿添加。
研讨证明，依达拉奉能增加神经元NO分解酶，添加内皮型NO合酶，抑制脑线粒体通透性转运孔开放，起到脑组织维护作用。
另外，依达拉奉还能清楚抑制缺血区脑水肿，增加缺血再灌注惹起的白三烯分解[7]。
可见，依达拉奉能对缺血再灌注损伤的脑组织起到理想的维护作用。
随着该药的脑维护作用逐渐失掉临床一定，其顺应症进一步扩展，如治疗心肌缺血、肺缺血、肾脏缺血、肝脏缺血和肠缺血等，其相关研讨已取得较大停顿。
鉴于依达拉奉良好的脑维护作用，在依达拉奉的基础上，对其停止结构改造，分解了新型化合物TQ0701。
本课题就是主要观察TQ0701关于脑缺血的维护作用，从而为该化合物的机制研讨以及临床运用开发提供相关实验数据和实验思绪。
第一章资料
1.1药物和试剂
1.1.1TQ0701原料：
提供单位：
江苏正大天晴制药
规格：
纯度为98.0％以上
配制方法：
按（1.2mgTQ0701原料）：
（1mL0.9%氯化钠溶液）的比例配制成原液。
TQ0701高剂量组，给予大鼠iv0.5mL/100g体重的原液；中剂量组需将原液用0.9%氯化钠溶液稀释一倍，给药体积同上；低剂量组将原液稀释两倍，给药体积同上
1.1.2依达拉奉（Edaravone）原料：
提供单位：
江苏正大天晴制药
规格：
纯度为98.0％以上
配制方法：
按（0.6mg依达拉奉原料）：
（1mL0.9%氯化钠溶液）的比例配制成溶液。
大鼠iv0.5mL/100g体重
1.1.3水合氯醛（TCA）:
提供单位：
国药集团化学试剂
规格：
剖析纯
配制方法：
用0.9%氯化钠溶液配制成10%的溶液，大鼠ip0.5mL/100g体重
1.1.4红四氮唑（TTC）：
提供单位：
上海灵锦精细化工
规格：
剖析纯
配制方法：
用PBS溶液配制成1%的溶液，4℃避光保管
1.1.5PBS溶液（g/L）：
配制方法：
每升蒸馏水参与NaCl8.00g，KCL0.20g，Na2HPO4·H2O0.156g，KH2PO40.20g，充沛溶解
1.1.60.9%氯化钠溶液：
提供单位：
中国大冢制药
规格：
250ml/瓶
1.1.7肝素钠注射液
提供单位：
常州千红生化制药
规格：
2mL:
12500单位
配制方法：
临用前加0.9%氯化钠溶液将肝素配制成125μ/mL溶液
1.1.8无水乙醇：
提供单位：
无锡市亚盛化工
规格：
剖析纯
配制方法：
用蒸馏水配制成75%的溶液
1.1.9甲醛溶液
提供单位：
国药集团化学试剂
规格：
剖析纯
配制方法：
用蒸馏水配制成10%的溶液，避光保管
1.1.10HE染色试剂盒：
提供单位：
南京建成生物工程研讨所
1.2主要仪器
1.2.1电热恒温水浴锅：
江苏省东台市电器厂
1.2.2剖析天平：
北京赛多利斯天平
1.3植物
SD大鼠，雄性，220～260g，清洁级，消费容许证由河南省实验植物中心提供，消费容许证号：
SCXK（豫）2005-0001；运用容许证由中国药科大学新药挑选中心提供，运用容许证号：
SYXK（苏）2004-0010。
第二章方法
2.1TQ0701iv对局灶性脑缺血大鼠的神经功用和脑组织梗塞率的影响
取SD大鼠60只，雄性，体重220～260g，按体重随机分为6组，区分为假手术组，模型组〔均给以等量0.9%氯化钠溶液〕，阳性对照组〔依达拉奉3mg/kg〕，TQ0701高、中、低三个剂量组〔6、3、1.5mg/kg〕。
以上各组给药容量均为0.5mL/100g。
参考Longa[8～10]等人的方法，采用颈内动脉线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞〔MCAO〕模型。
大鼠用10%水合氯醛〔300mg/kg〕ip麻醉后仰卧恒温手术台上。
从颈部正中切口，暴露右侧颈总动脉，向外牵引二腹肌及胸锁乳突肌，由颈总动脉分叉处向头端依次游离，结扎并剪断颈外动脉的分支：
枕骨下动脉和甲状腺上动脉，在颈外动脉远端结扎，切断颈外动脉使其主干游离备用，然后分别颈内动脉，用丝线在颈外动脉根部打一松扣，夹闭颈总动脉和颈内动脉。
将尼龙线〔长5cm，直径0.28mm〕经颈外动脉主干切口，缓慢向颈内动脉入颅方向推进，以颈总动脉分叉处为标志，推进18mm左右时感到阻力，即到达了较细的大脑中动脉内，阻断了MCA的一切血供来源，扎紧颈外动脉根部松扣。
2h后，拔出尼龙线，扎紧动脉残端。
缝合皮肤，完成MCAO招致局灶性脑缺血—再灌注模型。
假手术组大鼠麻醉后，仅暴露颈内外动脉分叉，不闭塞MCA。
TQ0701三个剂量组和阳性对照组区分在缺血前30min以及再灌注0、2h尾静脉注射TQ0701和依达拉奉，假手术组和模型组那么给予等量的0.9%氯化钠溶液。
术后24h按Bederson的方法对植物的行为缺陷停止分级评分，规范如下[11]：
0分：
无神经功用缺失症状；1分：
提大鼠尾，见瘫痪侧前肢回收屈曲不能正常伸向空中；2分：
向瘫痪侧推时感阻力较对侧清楚降低；3分：
大鼠匍匐时向瘫痪侧旋转；4分：
伴无看法阻碍。
MCAO24h后，断头处死大鼠，取出全脑〔去除小脑〕。
在视交叉及其前后各2mm处，做冠状切片5片，于1%TTC中避光37℃孵育30min，再分别惨白区〔梗塞区〕和非惨白区〔正常区〕，计算梗塞百分比如下：
梗塞百分比（%）=惨白区重量/（惨白区重量+非惨白区重量）×100%
2.2TQ0701iv对局灶性脑缺血大鼠脑组织学的影响
取SD大鼠60只，雌性，220～260g，随机分为6组，分组给药及手术方法如前。
MCAO后24h断头处死大鼠，取出全脑〔去除小脑〕，于10%甲醛溶液中固定。
标本于腊制模具中切片后作HE染色，对大脑皮层海马停止病理组织学反省。
2.3统计学处置
实验数据用
表示。
采用单要素方差剖析停止组间清楚性比拟,两组间样本均数比拟采用t检验。
第三章结果
3.1TQ0701对局灶性脑缺血大鼠的神经功用和脑组织梗塞率的影响
由表1可见：
模型组的MCAO大鼠脑卒中评分清楚添加，梗死面积也清楚增大〔P<0.01vs假手术组〕。
TQ0701给药组6、3、1.5mg/kgiv能清楚降低MCAO大鼠的脑卒中评分，并可以清楚增加局灶性脑缺血大鼠脑的梗死面积〔P<0.01，P<0.05vs模型组〕。
三个剂量是随着浓度增大作用增强。
依达拉奉3mg/kgiv也能清楚改善MCAO大鼠的脑卒中评分，增加梗死面积〔P<0.01vs模型组〕。
表1.TQ0701对局灶性脑缺血大鼠行为学评分、梗死面积的影响
〔
，n=10〕
组别
剂量
〔mg/kg〕
行为学评分
梗死面积〔％〕
假手术组
－
0.0±0.0△△
－
模型组
－
3.3±0.5
41.4±3.5
阳性对照组
3
1.7±0.8△△
19.7±2.5△△
TQ0701给药组
6
1.5±0.6△△
20.1±3.0△△
3
1.9±0.7△△
25.9±6.3△△
1.5
2.6±0.7△
36.0±5.6△
△P<0.05,△△P<0.01vs模型组
3.2TQ0701对局灶性脑缺血大鼠脑组织学的影响
（1）假手术组：
10例脑组织神经元基本正常，核居中，未见神经元清楚病变、坏死及炎细胞浸润等病理学改动。
（2）模型组：
10例脑组织大脑皮质神经元均见中－重度变性、坏死〔＋＋～＋＋＋〕，神经元结构模糊，胞体肿胀，尼氏小体增加或消逝，出现不同水平的核深染、核固缩、核溶解，神经元数目清楚增加，其中5例见筛状硬化灶构成。
（3）阳性对照组：
10例脑组织中有8例未见清楚神经元变性、坏死及炎细胞浸润等病理学改动。
2例脑组织神经元轻度变性、坏死〔＋〕，神经元结构模糊，胞体肿胀，尼氏小体增加或消逝，有不同水平的核深染、核固缩、核溶解。
该组神经元数目较模型组多。
（4）TQ07016mg/kgiv组：
10例脑组织中有7例脑组织未见神经元变性、坏死及炎细胞浸润等病理学改动。
3例脑组织神经元见轻－中度变性、坏死〔＋～＋＋〕，神经元结构模糊，胞体肿胀，尼氏小体增加或消逝，出现不同水平的核深染、核固缩、核溶解。
该组神经元数目较模型组多。
（5）TQ07013mg/kgiv组：
10例脑组织中有6例脑组织未见神经元变性、坏死及炎细胞浸润等病理学改动。
4例脑组织神经元见轻－中度变性、坏死〔＋～＋＋〕，神经元结构模糊，胞体肿胀，尼氏小体增加或消逝，出现不同水平的核深染、核固缩、核溶解。
该组神经元数目较模型组多。
（6）TQ07011.5mg/kgiv组：
10例脑组织中有4例脑组织未见神经元变性、坏死及炎细胞浸润等病理学改动。
6例脑组织神经元见轻－中度变性、坏死〔＋～＋＋〕，神经元结构模糊，胞体肿胀，尼氏小体增加或消逝，出现不同水平的核深染、核固缩、核溶解，其中2例见筛状硬化灶构成。
与模型组相比，TQ0701对大鼠脑缺血所致神经元变性、坏死有一定的治疗作用。
TQ0701三个剂量组中，大脑皮质锥体细胞和脑实质神经细胞的核固缩、核溶解水平比模型组清楚减轻，硬化灶增加，其中高、中剂量效果比拟清楚，而低剂量组的效果相对不清楚。
依达拉奉3mg/kgiv也对脑缺血形成的脑组织损伤有清楚维护作用。
第四章讨论
机体组织器官正常代谢、功用的维持，有赖于良好的血液循环，各种缘由形成的局部组织器官缺血可使组织细胞发作缺血性损伤。
缺血性脑血管病又称脑梗死，指脑的主要供血动脉发作狭窄或闭塞，惹起相应部位脑组织的缺血或坏死，其发病率、死亡率、复发率、致残率均十分高，且并发症多[12]。
近年来，人们对脑缺血的病理生理提出了多种学说，为解释脑缺血机制奠定了基础。
缺血后，在一定条件下恢复血液再灌注后，局部细胞功用代谢阻碍及结构破坏不只未减轻反而愈加严重，这种现象称为缺血再灌注损伤。
目前，缺血再灌注损伤的发作机制尚未充沛说明，少量实验研讨证明，其主要与自在基损伤、高能磷酸化合物缺乏、细胞内钙超载等有关。
自在基损伤是其主要损伤途径之一。
脑缺血再灌注后出现一系列的病理生理改动包括能量耗竭、细胞内酸中毒、细胞内钙超载、自在基损害、兴奋性氨基酸毒性所致的NMDA受体的激活、一氧化氮〔NO〕的作用等，而这些损伤机制并不是独立发扬作用的，在很大水平上是相互堆叠和亲密联络的[13，14]。
脑缺血的治疗目的是尽早恢复血流，改善半暗区的血液供应，抑制缺血再灌所致的损害。
Koizumi首先于1986年引见了一种不开颅的方法，即血管外线栓闭塞法〔线栓法）MCA阻塞（MCAO）模型，随之1989年Longa等将该方法加以改良。
由于该方法具有不开颅，手术时间短，植物存活时间长，缺血部位恒定，且可以准确控制缺血及再灌时间，所以线栓法MCAO模型是目前最普遍运用于实验研讨的一种模型。
我们采用颈内动脉线栓法〔MCAO〕制备大脑中动脉阻塞－再灌注模型，损伤小，动摇性高，方法比拟牢靠。
脑缺血再灌注损伤时最清楚的组织学变化是脑水肿及脑细胞的坏死。
脑水肿的发生是膜脂质过氧化使膜的结构破坏和钠泵功用阻碍的结果。
大鼠局部脑缺血再灌注实验证明，TQ0701可以降低缺血再灌注损伤大鼠的神经功用评分和增加梗塞范围。
同时组织病理学报告证明TQ0701对大鼠脑缺血所致神经元变性、坏死有一定的治疗作用。
因此，TQ0701对大鼠脑缺血-再灌注损伤有良好的维护作用，有一定的研讨开发前景。
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