羧甲基壳聚糖论文羧甲基壳聚糖对肿瘤细胞及组织生长影响的研究.docx

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羧甲基壳聚糖论文羧甲基壳聚糖对肿瘤细胞及组织生长影响的研究

羧甲基壳聚糖论文：

羧甲基壳聚糖对肿瘤细胞及组织生长影响的研究

【中文摘要】:

羧甲基壳聚糖（carboxymethylchitosan,CM-CTS）是目前壳聚糖改性研究和应用研究最多的一种壳聚糖衍生物,是经羧甲基化接枝改性而成,具有优良的水溶性、成膜性、保湿性等,在日化、食品、医药、生物医用材料等领域中具有较多的研究和应用。

CM-CTS作为生物医用材料在烧伤敷料、术后防粘连、止血、促进创伤修复、药物载体、酶抑制剂等方面已有应用,但对CM-CTS作为生物医用材料应用在临床的肿瘤手术切除创面的安全性评价方面研究报道很少。

故在细胞水平及组织水平上开展CM-CTS对肿瘤生长的影响具有重要的理论意义和实际意义。

本课题以四种不同分子量、不同羧化度及不同脱乙酰度的CM-CTS为研究对象,开展了CM-CTS理化性质测定、体外细胞毒性评价、体内应用安全性评价及对机体免疫调节的影响,为CM-CTS作为生物医用材料在临床应用的安全性提供理论依据。

方法:

实验分四个部分:

1、对四种CM-CTS材料进行纯化及理化性质分析,采用HPLC法测定其分子量,酸碱电位滴定法测定其羧化度及脱乙酰度,并对水分及灰分等性能进行了研究。

2、在细胞水平,采用显微观察结合MTT法测定四种CM-CTS对人正常肝细胞L02、人肝癌细胞Bel-7402、人胃癌细胞SGC-7901及人宫颈癌细胞Hela体外生长的影响。

3、初步探讨CM-CTS对正常肝细胞及肝癌细胞生长影响差别可能机制。

ELISA方法检测CM-CTS对L02细胞及Bel-7402细胞作用24h时转化生长因子-α（TGF-α）,对Bel-7402细胞分泌血管内皮生长因子（VEGF）水平影响。

4、考察CM-CTS体内应用安全性。

构建小鼠肉瘤S180及移植性肝癌Heps模型,腹腔注射分子量为340kDa的CM-CTS给药,计算抑瘤率,并测定S180肉瘤小鼠免疫器官指数、血清白细胞介素-2（IL-2）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平。

结果:

1、CM-CTS纯化至细胞使用级别并对其主要理化参数进行了测定。

2、细胞水平结果显示四种CM-CTS在50~800μg/ml浓度范围内对L02细胞增殖具有显著促进作用,其相对增值率为114%~126%;而CM-CTS在50~5000μg/ml浓度范围内,作用2d,4d时,对Bel-740、SGC-7901及Hela细胞的增殖均具有一定的抑制作用,抑制率在5%~20%。

因此,四种CM-CTS作为生物医用材料在细胞水平上是安全的。

3、CM-CTS在50~5000μg/ml浓度范围内能显著提高L02细胞TGF-α分泌水平,而对Bel-7402细胞TGF-α及VEGF分泌水平具有显著抑制作用。

这与CM-CTS对两种肝细胞生长影响结果趋势相近。

4、实验显示大分子CM-CTS非但不能促进实体瘤模型小鼠的肿瘤增长,反而具一定程度的抑瘤作用。

低、中、高剂量CM-CTS对Heps小鼠抑瘤率分别为:

12.9%、18.2%及22.1%,对S180肉瘤生长的抑制率分别为:

29.4%、31.6%及39.9%。

此外,CM-CTS在一定浓度范围内能提高S180荷瘤小鼠免疫器官指数及外周血请中的IL-2及TNF-α的水平,对机体免疫力有保护和调节作用。

结论:

分子量不同、羧化度不同及脱乙酰度不同的四种CM-CTS对L02细胞体外增殖均具促进作用,对Bel-7402、SGC-7901及Hela细胞增殖无促进作用并有一定的抑制作用,对相关细胞因子分泌水平影响结果与细胞水平结果相近,对小鼠移植性肝癌Heps及S180肉瘤具一定抑制作用,并能提高机体免疫力。

因此,CM-CTS其作为生物医用材料在机体中应用是安全的。

【英文摘要】Purpose:

Carboxymethylchitosan（CM-CTS）isawatersolublechitosanderivativebyintroducing–COOHgroupstochitosanmoleculeandendowsitsomeoutstandingbiologicalproperties.CM-CTShasbeenaresearchfocusinthefieldofpharmaceuticalandbiomedicalindustryforitsuniquephysicochemicalandbiologicalpropertiessuchasbiocompatibility,biodegradability,degradationcontrollabilityandantimicrobialactivity.TherehavealsobeensomereportsonthetherapeuticutilitiesoftheCM-CTSinthefieldsofantimicrobes,hemostatic,woundhealing,reducingtheformationofpostsurgicaladhesions,drugcarrying,enzymeinhibitorandsoon.Asversatilebiomedicalmaterial,CM-CTSalwaysconjugatesorentrapsorself-assembleswithagentandextensivelyappliesintumortherapyresearch.However,safetyevaluationofCM-CTShasbeenfocusedonthecompoundsandinvitromodel,littlereportedworkofCM-CTSpersesafetybothinvitroandvivohasbeendiscussed,especiallyintumortherapy.Moreover,theactualmetabolicpathwayanddegradationproductsofCM-CTSinthebodyhavebeenasyetunknown.Therefore,additionalbiologicalsafetyresearchofCM-CTSinapplicationisnecessary.Inthisstudy,thebiologicalsafetyofCM-CTSwithdifferentmolecularweights（MW）,differentsubstituteddegrees（DS）anddifferentdegreeofdeacetylation（DD）onclinicalapplicationisinvestigatedbothinvitroandinvivo.CM-CTSispurified,characterizedanditscytotoxicityisinvestigatedbyusingnormalcellandthreetumorcellsinvitro,andtheinfluenceofCM-CTSonthegrowthofsarcoma180andHepstumorandimmuneresponseoftumor-bearingmicearealsoinvestigated,providingexperimentalbasisforCM-CTSutilizationintumorapplicationasbiomedicalmaterial.Methods:

1.FourCM-CTSsampleswithdifferentMW,differentDSanddifferentDDarepurifiedandtheirmainlyphysicochemicalpropertiesaremeasured.TheMWofCM-CTSaremeasuredwithgelpermeationchromatographyusingHPLC;DSandDDofCM-CTSaredeterminedbypotentiometric;ThemoistureandashpropertiesofCM-CTSarealsodetermined.2.HumannormallivercellL02,humanhepatomacellBel-7402,humangastriccancercellSGC-7901andhumancervicalcarcinomacellHelaareusedtoevaluatethecytotoxicityeffectsofCM-CTSbyMTTassayinvitroandthemorphologyofcellisobservedbyinvertedmicroscope.3.Thelevelsofhumantransforminggrowthfactor-α（TGF-α）andhumanvascularendothelialgrowthfactor（VEGF）secretedbyL02andBel-7402cellsaremeasuredbyELISA.4.Invivo,thetransplanttumormodelsofHepsandsarcoma180areestablishedinmiceand340kDaCM-CTSisadministeredthroughintraperitonealinjectiontoinvestigatetumorinhibitoryeffect.Thetumorsareweighedtocalculatethetumorinhibitionrate.Immuneorgansincludingspleenandthymusofthemicearealsoremovedandweighedtoobtaintheindexofthespleenandthymus.SerumIL-2andTNF-αlevelofsarcoma-180-bearingmicearealsoinvestigated.Results:

1.FourCM-CTSsampleswithdifferentMW,differentDSanddifferentDDarepurifiedandtheirmainchemicalandphysicalparametersaremeasured.2.FourCM-CTSsampleswithdifferentdifferentMW,differentDSanddifferentDDcouldpromotetheproliferationofL02cellswithintheconcentrationof50~800μg/ml,butnotpromoteeveninhibittheproliferationofBel-7402,SGC-7901andHelacellsincertainconcentrationrangesandincubationtime.TheRGRvalueare114%~126%ofL02cellsbut80%~95%forthatofthreetumorcelllines:

Bel-7402,SGC-7901andHelacells.3.FourCM-CTSsampleswithdifferentMW,differentDSanddifferentDDalsocouldimprovetheTGF-αsecretionofL02cells,whereasdecreasethatofBel-7402cells.ThelevelofVEGFsecretedbyBel-7402cellsisalsoinhibitedbyCM-CTStosomeextent.4.CM-CTSexhibitsanticancereffectinadose-dependentmanner.Thetumorinhibitionratesoflow,mediumandhighdosesofCM-CTSare12.9%,18.2%and22.1%tothegrowthofHepstumorand29.4%,31.6%and39.9%tothegrowthofsarcoma180tumors,respectively.CM-CTSalsocouldenhancebodyimmunefunctioninthecertaindoseviaelevationofserumIL-2andTNF-αlevelandthespleenindexandthymusindexintreatedmice.Conclusion:

CM-CTSwithdifferentMW,differentDSanddifferentDDaresafetocellandexhibittwofoldbioactivitiesinthecultureofhumannormallivercellL02andthreetumorcells:

Bel-7402,SGC-7901andHela.Resultsatcytokinelevelsarecompatiblewiththeobservationsatlivercelllevels.Invivo,CM-CTSarenontoxictobodyandcouldenhancebodyimmunefunctionandexhibitedanticancereffecttosomeextentandtheseresultsstronglysuggestthatCM-CTSissafeintumorapplicationasbiomedicalmaterial.

【关键词】羧甲基壳聚糖肿瘤生物材料细胞因子

【英文关键词】CarboxymethylchitosanTumorBiomaterialCytokine

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【目录】羧甲基壳聚糖对肿瘤细胞及组织生长影响的研究摘要5-7Abstract7-9第一章文献综述15-321壳聚糖概述15-181.1壳聚糖结构性质15-161.2壳聚糖的物理改性161.3壳聚糖的化学改性16-181.3.1酰化改性161.3.2烷基化改性16-171.3.3醚化改性171.3.4酯化改性171.3.5希夫碱反应171.3.6季铵化171.3.7氧化改性17-181.3.8交联改性181.3.9接枝共聚改性182羧甲基壳聚糖概述18-232.1羧甲基壳聚糖结构18-192.2羧甲基壳聚糖性质19-202.3羧甲基壳聚糖的应用现状与前景展望20-232.3.1在医药方面的应用20-222.3.2在生活日用品方面的应用222.3.3在农业上的应用22-232.3.4在环保方面的应用233肿瘤疾病概述23-263.1肿瘤发生机理23-243.2肿瘤疾病的研究进展24-253.3肿瘤细胞与正常细胞主要差别25-264细胞因子26-314.1细胞因子分类26-294.1.1白细胞介素（IL）264.1.2集落刺激因子（CSF）26-274.1.3干扰素（IFN）274.1.4肿瘤坏死因子（TNF）274.1.5转化生长因子家族（TGF）274.1.6趋化因子家族（chemokinefamily）27-284.1.7其它生长因子28-294.2细胞因子在肿瘤研究中的意义29-314.2.1VEGF在肿瘤研究中的意义29-304.2.2TGF-α在肿瘤研究中的意义304.2.3IL-2在肿瘤研究中的意义304.2.4TNF-α在肿瘤研究中的意义30-315立题依据31-32第二章四种CM-CTS材料纯化及理化性质测定32-381材料、试剂与仪器32-331.1材料与试剂321.2主要仪器32-332实验方法33-362.1材料的制备与纯化33-342.2材料性质的测定34-362.2.1CM-CTS水分测定342.2.2CM-CTS灰分测定342.2.3CM-CTS分子量的测定34-352.2.4CM-CTS脱乙酰度的测定352.2.5CM-CTS羧基取代度的测定35-363结果与讨论36-38第三章四种CM-CTS对正常细胞及肿瘤细胞生长的影响38-581材料、试剂与仪器38-401.1材料与试剂38-391.2溶液配制391.3主要仪器39-402实验方法40-412.1四种细胞培养活性鉴定402.2CM-CTS对四种细胞生长影响402.3数据分析40-413结果与讨论41-573.1四种CM-CTS对正常肝细胞L02细胞生长的影响41-453.1.1四种CM-CTS对正常肝细胞L02细胞形态的影响41-443.1.2四种CM-CTS对正常肝细胞L02细胞活性的影响44-453.2四种CM-CTS对肝癌细胞Bel-7402细胞生长的影响45-493.2.1四种CM-CTS对肝癌细胞Bel-7402细胞形态的影响45-483.2.2四种CM-CTS对肝癌细胞Bel-7402细胞活性的影响48-493.3四种CM-CTS对胃癌细胞SGC-7901细胞活性的影响49-533.3.1四种CM-CTS对胃癌细胞SGC-7901细胞形态的影响49-523.3.2四种CM-CTS对胃癌细胞SGC-7901细胞活性的影响52-533.4四种CM-CTS对宫颈癌细胞Hela细胞生长的影响53-573.4.1四种CM-CTS对宫颈癌细胞Hela细胞形态的影响53-563.4.2四种CM-CTS对宫颈癌细胞Hela细胞活性的影响56-574本章小结57-58第四章CM-CTS对正常肝细胞及肝癌细胞生长影响差别机制研究58-651实验材料、试剂与仪器591.1材料与试剂591.2主要仪器592实验方法59-602.1FITC标记CM-CTS对L02细胞及Bel-7402细胞作用位置的初步研究59-602.2四种CM-CTS对L02细胞及Bel-7402细胞分泌TGF-α及VEGF的影响602.3数据分析603实验结果60-643.1FITC标记CM-CTS对L02细胞及Bel-7402细胞作用位置的初步研究60-623.2四种CM-CTS对L02细胞及Bel-7402细胞分泌TGF-α的影响62-633.3四种CM-CTS对L02细胞及Bel-7402细胞分泌VEGF的影响63-644本章小结64-65第五章CM-Ⅲ对小鼠肿瘤生长的影响及免疫调节作用65-721材料、试剂与仪器661.1实验材料661.2实验动物及瘤株661.3实验仪器662实验方法66-682.1接种66-672.1.1S180荷瘤小鼠肿瘤模型构建66-672.1.2Heps荷瘤小鼠肿瘤模型构建672.2分组及给药672.3指标测定672.4数据分析67-683实验结果68-713.1CM-Ⅲ对小鼠Heps及S180肿瘤生长影响68-703.2CM-Ⅲ对S180小鼠机体免疫调节的影响70-713.2.1CM-Ⅲ对S180小鼠免疫器官指数的影响703.2.2CM-Ⅲ对S180小鼠外周血清中相关细胞因子的影响70-714本章小结71-72总结72-741主要结论722主要创新点72-733存在的不足与进一步研究计划73-74参考文献74-79致谢79-80个人简历80在读期间论文发表情况80