重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体原液生产车间工艺设计.docx

重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体原液生产车间工艺设计.docx

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重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体原液生产车间工艺设计

重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体原液生产车间工艺设计

摘要

随着单抗药物的日益发展，现如今单抗药物的生产能力远不能满足市场的需求，具有鼠源性的单克隆抗体不适合用于人体，因其用于人体会引起HAMA反应，即人抗鼠抗体反应；且通过杂交瘤技术制备而成的单克隆抗体，是鼠源性的。

解决此难题的方法在于可将鼠源抗体的可变区，与人抗体的恒定区进行拼接，两者拼接而形成嵌合抗体；另外，鼠抗体内可变区的互补决定区，即CDR区与人的抗体内的互补决定区，可以进行互换，两者互换可构成人源化抗体，这也是解决HAMA反应的一种方法。

至今为止，国内外已经上市的抗EGFR单克隆抗体，共有3种，将其与其他的化疗药进行比较，具备许多特点，首先其靶点非常明确，其次其毒副作用也较低，且疗效更为明显。

本次设计的主要内容是设计生产西妥昔单抗的车间，主要分为上游动物细胞发酵培养和下游产物纯化两个部分，本设计选用的宿主细胞，是表达重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体的CHO细胞，对其进行悬浮培养，以分批流加补料方式培养，下游采用亲和层析、离子交换层析等对产物进行纯化。

按照所有的工艺流程对所用物料进行物料衡算。

原液车间内容包括：

种子复苏、种子扩大培养、发酵罐发酵、蛋白纯化几个步骤。

关键词：

动物细胞培养；纯化；物料衡算；车间设计

ProcessdesignofworkshopforproductionofrecombinanthumanmousechimericmonoclonalantibodyagainstEGFR

Abstract

Today,withthedevelopmentofsingledrugresistantcapacityofthesingledrugresistantfarcannotsatisfythedemandofthemarket,andbecausebyhybridomatechnologypreparationofmonoclonalantibodyisthesourceoftherat,applytothehumanbodyinevitablycauseantimouseantibody（HAMA）response,sowillbethesourceoftheratantibodiesvariableareawithconstantregionjoiningtogethertoformachimericantibodyorwillbedecidedthemouseantibodyvariableareacomplementaryarea（CDR）andantibodyofcomplementarydecisionofthedistrictswaphumanizedantibody,basicallysettledtheproblemofantibodydrugsofdifferentsourcesex.

Atpresent,therearethreekindsofanti-egfrmonoclonalantibodiesonthemarketathomeandabroad.Comparedwithotherchemotherapeuticdrugs,theyhavecleartargets,significantefficacyandlowtoxicandsideeffects,andhaveachievedgoodclinicalefficacy.Theproductwasapprovedfordomesticmarketin2009.Thisdesignmainlyaimsattheworkshopproductionofcetuximabtocarryonthedesign,themainproductisdividedintoanimalcellsfermentationcultureanddownstreampurificationtwoparts,chooseexpressrecombinantEGFRresistanthumanmousechimericmonoclonalantibodyofCHOcellsasahostcell,suspensioncultureandcultivateinpartialflowandfeedingway,downstreamusingaffinitychromatography,ionexchangechromatographyforpurificationofproduct.Theworkshopconsistsofseveralsteps:

seedrecovery,seedexpansionculture,fermentationinfermenttankandproteinpurification.Accordingtotheproductionprocessandtheprincipleofzoning,seeds,fermentation,harvestandpurificationaredividedintoseveralmainproductionareas.

Keywords:

Animalcellculture;Purification,;Materialbalance;Workshopdesign

1前言

到今天为止，市面上常见的以EGFR为靶点的治疗性药物，已经上市的主要有十二种，这其中有四种是单克隆抗体，另外八种则是小分子抑制剂。

其中四种单抗的适应症主要是以非小细胞肺癌、头颈癌、结直肠癌为主的；另外八种小分子抑制剂则是以乳腺癌、非小细胞肺癌作为主要的适应症[1]。

通过查找全球临床试验的数据库，得到的结果是与此次设计主题相关的临床研究截至今日共有三千七百五十七个，其中有二十六个在早期的临床阶段，有七百二十六在临床一期，有一千四百八十二个在临床二期，有五百四十一个在临床三期，其余二百七十一个在临床四期。

单抗药物作为当代全球生物技术产业的热点，许多国家、企业都致力于开发单抗药物。

本设计的设计意义在于解决当前社会单抗药物价格居高不下的难题与缓解病患对单抗药物供不应求的严峻情况。

本次车间设计的生产产品为西妥昔单抗，其主要用于结肠癌的治疗。

车间主要分为发酵和纯化两个部分，将单克隆抗体进行工业生产化的关键因素也在于这两部分。

本次设计主要分为上游动物细胞培养和下游蛋白纯化两个主体内容，动物细胞培养阶段需要注重的要点是对于细胞生长的条件要严格把控与检测，细胞处于生长的最适条件便可最大程度地收获到细胞液，即能收获更多的目的蛋白[2]。

上游细胞培养阶段结束后，收获液需要进行蛋白纯化才能得到高纯度的目的蛋白，简而言之，产品的纯度就取决于纯化阶段工作的效率[3]。

各个层析步骤的填料选择、纯化设备的选择等等都对纯化率起到关键作用，这些都是在后续工作中需要着重注意的点。

在完成上游细胞培养和下游纯化后得到目的蛋白，收获产品之后，需要对整个生产过程中所涉及到的物料的用量、耗热量、蒸汽量等等进行衡算，对整个车间的布置、经济消耗进行规划。

2工艺流程

2.1上游细胞培养

在单克隆抗体的生产工艺中，动物细胞的大规模培养已成为最重要的关键技术之一,哺乳动物细胞表达系统中可发生生物大分子特定的翻译后修饰，且大多数重组蛋白可以分泌到胞外，这一特点对产物的提取，减少许多工作量，因此动物发酵培养成为单克隆抗体生产上游工艺的首选。

上游工作主要分为几个步骤，首先对细胞进行复苏，待细胞复苏后将其置于摇瓶内扩增，摇瓶扩增结束后一次进行5L、30L的细胞反应器进行增殖培养，再将其移至200L反应器内进行流加培养，细胞增殖至一定浓度后转移至2000L反应器中进行流加培养，培养一定时间后得到收获液[5]。

具体流程如下：

细胞株：

本设计选用表达抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体的重组CHO细胞。

（1）细胞培养基

基础培养基的配方：

配方主要内容为CDFortiCHOAGT（ThermoFisher公

司），12.5g/L；Ex-Cell302（Sigma-Aldrich公司），10.8g/L。

配制方法：

取配制体积80％的注射用水于配液容器中，计算配制培养基所需

要用到的原料用量，将Ex-cell302干粉以及CDFortiCHOAGT干粉称取计算所得到的用量，加入到配液容器中，搅拌30分钟。

用5mol/L的氢氧化钠调节其pH，直至PH为6.9-7.0，再将溶液继续搅拌，搅拌10分钟左右。

搅拌结束后将培养基定容至所配制的体积，再进行过滤，将培养基分装。

过滤后先进行无菌验证，验证结束后再检查滤膜是否完整[6]。

将其置于4℃的冰箱里储存。

补料培养基的配方如表一

配制方法：

取配制体积80％的注射用水于配液容器中，计算配制培养基所需

要用到的原料用量，将CellBoost5干粉以及CDEfficientFeedCAGT干粉称取计算所得到的用量，加入到配液容器中，搅拌30分钟；然后调节pH直到PH被调至PH=9.2左右，再依次加入配方中剩下的成分，如谷氨酸等，待其溶解后，继续搅拌20分钟。

搅拌结束后，用6mol/L盐酸调节其PH，直至pH达到6.9-7.0，再将溶液继续搅拌，搅拌10分钟左右[3]。

搅拌结束后将培养基定容至所配制的体积，再进行过滤，将培养基分装。

过滤后先进行无菌验证，验证结束后再检查滤膜是否完整。

将其置于4℃的冰箱里储存。

（2）种子复苏：

将本设计选用的宿主细胞进行37℃水浴，为使之迅速融合需不断

进行搅动。

搅动一段时间后，得到融化的细胞液，将细胞液转移到离心管中，取15ml离心管装细胞液，并在此基础上加入10ml的基础培养液，然后将其进行离心后弃上清，弃去上清后，再加入70ml基础培养液对其进行重悬，重悬后转入125ml摇瓶，并放入37℃、5％CO2的摇床中培养，摇床转速100rpm。

（3）摇瓶扩增：

细胞在125ml摇瓶中生长2-3天后，细胞密度不断增长，密度达

到4×106细胞/ml。

加入基础培养基将其稀释，使得摇瓶内细胞密度达到0.6×106细胞/ml，并以此细胞密度接种到1L摇瓶[3]。

再将其放入37℃、5％CO2培养条件的摇床中进行培养，摇床转速为100rpm。

在摇床中培养3天后，细胞的密度达到了4×106细胞/ml，再以0.6×106细胞/ml的密度将细胞接入到5L生物反应器中培养。

（4）反应器扩增：

5L反应器培养阶段，温度36-37℃，pH6.8-7.2，转速150rpm，

30％的溶氧饱和度条件下培养3天后，当细胞密度达到了4×106细胞/ml，将种子液转入30L反应器中培养[7]。

30L反应器温度36℃，pH7.0，转速120rpm，30％的溶氧饱和度条件下培养，接种密度为0.6×106细胞/ml，每天取样计数，葡萄糖浓度控制在3g/L。

细胞培养至密度达到4×106细胞/ml，活率要求＞95％，将其作为接种至200L反应器中生产的种子来源。

（5）200L反应器培养：

将CHO种子细胞培养液从30L反应器转入200L规格的一

次性搅拌式的生物反应器中，首先对从5L反应器中转入至200L反应器内的种子液进行密度稀释，加入新鲜的基础培养基调节其密度，将细胞密度从4×106细胞/ml，调整为0.6×106细胞/ml。

200L反应器内初始的转速为60rpm，培养条件为37℃的培养温度，葡萄糖的浓度一直将其维持在1-3g/L。

对种子液培养4天，4天后将培养条件更改为33℃培养温度，并同时开始流加补料培养基，加入补料培养基的目的是促进细胞生产目的蛋白[8]，补料培养基每天的流加量是固定的，流加量为实际培养物体积的4％，葡萄糖的浓度要将其一直维持在3-6g/L的水平以保证细胞稳定生长。

细胞由生长期进入生产期，维持7天，培养细胞密度达到4×106细胞/ml。

当细胞进入衰退期，活率达到80％左右时，停止流加补料培养基[4]。

（6）2000L反应器培养：

将200L反应器中收获的种子细胞培养液转入2000L一次

性搅拌式生物反应器中，首先补加新鲜的基础培养基将细胞密度调整至0.6×106细胞/ml[4]。

培养温度37℃，初始转速100rpm，葡萄糖含量维持在1-3g/L。

培养6天后，反应器内的细胞密度增大，达到4×106细胞/ml时，改变培养条件，培养温度更改为33℃，并同时开始流加补料培养基，加入补料培养基的目的是促进细胞生产目的蛋白，补料培养基每天的流加量是固定的，流加量为实际培养物体积的4％，葡萄糖含量将维持在3-6g/L。

细胞开始处于生长期，在培养阶段慢慢进入生产期，生产期会维持9天，在此期间其产物浓度将逐渐提高。

生产期结束后细胞进入衰退期，活率达到80％左右时，停止流加补料培养基，结束培养。

2.2下游蛋白纯化

本设计产品纯化主要通过细胞液澄清、亲和层析、低PH孵育、阴离子层析、阳离

子层析等方法搭配使用对产品蛋白进行纯化，得到更高纯度的蛋白样品。

2.2.1细胞液澄清

首先将细胞培养结束后收获的培养液进行两级深层过滤处理，其次再将处理过后的收获液进行除菌过滤，除菌过滤结束后再将其上样至亲和层析柱内。

材料与设备：

蠕动泵：

LongerPump，BT300-2J；压力传感器：

PENDOTECHPressureMAT；

样品：

平衡缓冲液、细胞收获液：

150mMNaClpH7.4,50mMTris-HAc；

深层过滤器：

MilliporePodA1HC,540cm2（二级）；MilliporePodD0HC,2×540cm2（一级）；

除菌滤器：

Sartopore2300，Sartorius

具体的操作步骤：

首先准备适量的注射用水（WFI），利用WFI对深层过滤器A1HC和D0HC分别进行冲洗100L/m2，600LMH。

然后将两个D0HC并联[10]，再和A1HC串联，用平衡缓冲液对深层过滤器进行平衡，将深层过滤器（至少2倍D0HC系统死体积），平衡至测定A1HC所流出的平衡液的pH值，要求与平衡缓冲液的一致[8]。

完成深层过滤器的平衡后，首先对样品进行过滤处理，进料的速度会逐渐地增加。

首先将A1HC流出端的液体弃去，弃去液体量大约为0.5-0.7倍的整个系统死体积，待完成弃液处理后，再将除菌过滤器与A1HC的流出段进行串联，并再串联后开始收集滤液。

继续进行过滤，过滤的同时需要保持进料速度小于等于200LMH，还需要将各级深层过滤的压力保持在小于等于15psi的水平。

样品过滤结束后用需要用缓冲液将深层过滤膜中残留的料液置换出来，所使用的缓冲液用量为整个系统死体积的两倍[4]。

2.2.2亲和层析

经过上述步骤后获得的上清液采用MabSelect进行纯化，MabSelec是GE公司的ProteinA亲和层析填料，纯化后收集洗脱峰并取样检测。

材料与设备：

填料：

MabSelect,购自GE公司

填料性质

产品

目标配体

粒径（μm）

每毫升结合量

PH稳定性

最高流速（cm/h）

MabSelect

重组ProteinA

85

30mg人类IgG

3-10

500

层析柱：

型号LP2151500N，内径215mm、柱高1500mm，耐压5bar购自上海宸乔生物科技有限公司；

蛋白纯化系统：

AKTAAVANT150GE；

pH计和电导计：

SevenExcellence，Multi-parameter，595606，MettlerToledo

分光光度计：

Nanodrop2000，520161，ThermoScientific

样品：

澄清处理并经除菌过滤后的细胞培养上清液

操作步骤：

首先对系统及管路进行一些必要处理——去热原处理（保持30min以上）以及消毒，利用1MNaOH进行此操作。

其次需用WFI对系统及管路进行冲洗，直至冲洗至中性，然后利用相应缓冲液，将各缓冲液管路填满。

最后再将样品过滤，并待其恢复至室温后再准备上样。

完成一系列准备工作后，层析柱将第一步接入系统，同时做好运行方法的准备[10]。

运行层析方法，并收集洗脱峰，对洗脱峰进行取样，并在取样后送检，用Nanodrop2000来测定蛋白浓度，并根据蛋白浓度计算收率[5]。

待层析方法运行结束以后，立即卸下层析柱。

用水将系统管路冲洗干净，并且用20％乙醇对其进行保存。

亲和层析方法如表二

2.2.3低PH孵育病毒灭活和中和

将上一步亲和层析的洗脱峰进行PH调节，待pH调节至3.5-3.8后，再室温条件下

孵育2-4h，孵育结束后进行病毒灭活，完成病毒灭活后再将其中和至pH5.5-5.8，所得中和产品再进行除菌过滤处理。

设备：

pH计和电导计：

SevenExcellence，Multi-parameter，595606，Mettler

Toledo、分光光度计：

Nanodrop2000，520161，ThermoScientific

样品：

亲和层析洗脱收集峰

滴定液：

1MTrisBase（调碱）；1MCitricAcid（调酸）

除菌过滤器：

BottleTopFilter，ExpressPlus，0.22微米，Millipore

方法与结果：

先从洗脱收集液里取3mL样品测定其pH，并加入1MCitricAcid调其pH至3.5-3.8，再根据加入的1MCitricAcid的量对加入的百分比进行计算[5]。

根据算得的百分比，将1MCitricAcid按算得的比例加入到洗脱收集液中，对洗脱液进行调节，且边加入1MCitricAcid时一边不停搅拌[8]。

待两者混匀之后，再取3mL的样品置于室温下，并及时2-4h,2-4h后进行pH的测定以及确认。

根据3mL样品调节pH达到5.5-5.8时，所需要加入的Tris百分比进行推算所需要加入的1MCitricAcid的比例，并将1MTrisBase按比例加入。

混匀后，再取3mL的样品进行pH的测定以及确认，中和后的样品再进行除菌过滤。

2.2.4阴离子交换层析

低pH病毒灭活并中和后的样品调其pH至6.9后，将其作为阴离子交换层析的上样，并收集阴离子层析流穿峰取样进行检测。

材料与设备

填料：

SuperQ650M（TOSOH）

层析柱：

型号HS-MS-100，内径100mm,柱高2000mm，耐压＜3bar，CV62.8L，购自

华盛色谱科技有限公司

填料性质：

粒径40-90μm，离子交换容量0.20-0.30meq/mL，吸附容量105mg/ml

pH计和电导计：

SevenExcellence，Multi-parameter，595606，MettlerToledo

分光光度计：

Nanodrop2000，520161，ThermoScientific

样品：

经病毒灭活与中和后的样品在上样前调pH至6.9

除菌过滤器：

BottleTopFilter，ExpressPlus，0.22微米，Millipore

操作步骤如下：

首先用1MNaOH对系统、管路进行去热原处理（保持30min以上）

及消毒。

需用WFI冲洗系统及管路至中性，同时用相应缓冲液充满各缓冲液管路。

再将样品过滤并待其恢复至室温后准备上样。

将层析柱接入系统，并且准备好运行方法[10]。

运行层析方法，收集洗脱峰，取样送检，用Nanodrop测定蛋白浓度并计算收率[5]。

层析方法运行结束后，将层析柱卸下。

系统管路用水冲洗净，并用20％乙醇进行保存。

层析方法如表三。

2.2.5阳离子交换层析

将上述阴离子层析流穿收集峰进行PH值调节，调节其pH至5.0后，将其作为阳离子交换层析的上样。

并收集阳离子层析的洗脱峰，且对洗脱峰进行取样检测。

材料与设备

层析柱：

型号HS-MS-100，内径100mm，柱高2000mm，耐压＜5bar，CV62.8L，购自华盛色谱科技有限公司

填料：

PorosXS（购自赛默飞公司）

填料性质：

粒径50μm，动态载量100mg/ml，PH范围1-14，耐压100bar

pH计和电导计：

SevenExcellence，Multi-parameter，595606，MettlerToledo分光光度计：

Nanodrop2000，520161，ThermoScientific

样品：

阴离子层析流穿峰调pH至5.0

除菌过滤器：

BottleTopFilter，ExpressPlus，0.22微米，Millipore

操作步骤：

首先对系统及管路进行一些必要处理——去热原处理（保持30min以上）以及消毒，利用1MNaOH进行此操作。

其次需用WFI对系统及管路进行冲洗，直至冲洗至中性，然后利用相应缓冲液，将各缓冲液管路填满。

再对样品进行过滤处理，待样品恢复室温后准备上样。

将层析柱接入系统，并且准备好运行方法[10]。

运行层析方法，收集洗脱峰，取样送检，用Nanodrop测定蛋白浓度并计算收率[5]。

层析方法运行结束后，将层析柱卸下。

系统管路用水冲洗净，并用20％乙醇进行保存。

层析方法如表四。

3计算

3.1产量计算

每一生产周期为14天，一年生产340天，即年生产22批。

制剂规格100mg/50ml/

支;每批纯化过后的终产品蛋白含量为2000mg/L，发酵液1600L，每一生产周期可收获蛋白量为1600L×2000mg/L=3200000mg

每批次产品量：

3200000mg÷100mg/支=32000支

每年产品量：

32000×22=704000支

3.2物料衡算

3.2.1培养基用量计算

每一生产周期所用培养基量如下：

复苏：

基础培养基80ml，10ml与融化的细胞液混合后离心，70ml用于重悬；

种子扩增：

复苏后的细胞在125ml摇瓶内培养，细胞密度达到4×106细胞/ml，将其稀释至0.6×106细胞/ml密度接种到1L摇瓶中，1L摇瓶中细胞液总量为：

70×4×106/0.6×106=467ml，即基础培养基的用量为：

467-70=397ml，取400ml；

5L反应器的扩增：

在1L摇瓶中将细胞培养至细胞密度达到4×106细胞/ml，再将其稀释至0.6×106细胞/ml密度接种到5L反应器，5L反应器中细胞液总量为467×4×106/0.6×106=3114ml；即基础培养基用量为：

3114-467=2647ml，取2700ml；

30L反应器的扩增：

在5L反应器中将细胞培养至细胞密度达到4×106细胞/ml，再将其稀释至0.6×106细胞/ml密度接种到30L反应器，30L反应器中细胞液总量为3114×4×106/0.6×106=20760ml；即基础培养基用量为：

20760-3114=17646ml，取17700ml；

200L反应器的培养：

在30L反应器中将细胞培养至细胞密度达到4×106细胞/ml，再将其稀释至0.6×106细胞/ml密度接种到200L反应器，200L反应器中细胞液总量为20760×4×106/0.6×106=138400ml；即基础培养基用量为：

138400-20760=117640ml，取117700ml；培养4