定边盐碱土壤嗜盐菌的分离及鉴定.docx

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定边盐碱土壤嗜盐菌的分离及鉴定

定边盐碱土壤嗜盐菌的分离及鉴定

　　摘要[目的]从陕西定边盐湖高渗极端环境中筛选分离获得嗜盐微生物，并对筛选获得的微生物进行种属鉴定。

[方法]通过高盐选择性培养基平板分离法，从陕西定边盐湖土壤样品中，分离筛选获得极端嗜盐菌株，该菌最适生长温度35℃，最适pH值8.0。

通过传统的表型特征（包括形态学观察、生长因子试验、生理生化特征）和系统发育学16SrDNA序列分析鉴定嗜盐菌株的分类学地位。

[结果]获得一株最适生长盐浓度在10%～20%的细菌菌株A426，初步鉴定其为盐单胞菌科（Halomonadaceae）盐单胞菌属（Halomonas）菌株。

[结论]成功获得定边盐湖地区中度嗜盐菌株A426。

　　关键词嗜盐菌；极端微生物；盐单胞菌；鉴定

　　中图分类号S154.3文献标识码A文章编号1007-5739（2015）20-0157-03

　　SeparationandIdentificationofHalophilicBacteriainSalinealkalineSoilfromDingbian

　　SUNXiao-YuCHENRuiLIYueLUPeng-pengMENXinHANLi-pingHUANGJi-hongSHENWei-rong*

　　（MicrobialResourceCenter，MicrobiologyInstituteofShaanxi，Xi′anShaanxi710043）

　　Abstract[Objective]HalophilicbacteriastrainwasisolatedfromDingbiansaltlakesampleinShaanxi，andspeciesindentificationwasstudied.[Methods]ByhighsaltselectedculturemethodandgradientdilutionisolationmethodisolateahalophilicbacteriastrainfromtheDingbiansaltlakesample.Theoptimumgrowthtemperatureofitwas35℃，theoptimumpHvaluewas8.0.Accordingtotheclassicphenotypiccharacteristicswhichincludemorphologicalobservation，growthfactorandthephysiologicalandbio-chemicalcharacteristics，moderatehalophilestrainA426wastobeidentified.Todeterminethetaxonomypositionofthenewlyisolatedmoderatehalophilebacteriuminevolutionhistory，16SrRNAsequencehomologousalignmentwereperformedbetweenitandrelatedspecies.[Results]ThestrainA426whichcouldgrowoptimallyinculturemediathatcontain10%～20%NaCl.ThemoderatehalophilestrainA426wasidentifiedtobelongtoHalomonassp.[Conclusion]SuccessfullyisolateamoderatehalophilestrainA426fromDingbiansaltlake.

　　Keywordshalophilicbacteria；extrememicroorganism；Halomonassp.；identify

　　嗜盐菌是能在高浓度盐环境下生长的微生物[1]，对其分类鉴定主要通过表型特征、生理生化分类及分子生物学分类等方法进行[2]。

该文从陕北定边盐湖区[3]农业土壤中分离获得一株嗜盐单胞菌，并通过16SrDNA序列的测定，对其种属发育进行了鉴定。

　　1材料与方法

　　1.1试验材料

　　供试试剂：

NaCl、MgSO4?

7H2O、Tris?

HCl、乳糖、蔗糖、糊精等均为国产分析纯；酵母膏、蛋白胨、琼脂粉、麦芽糖、酪蛋白胨、牛肉膏、可溶性淀粉等均为北京奥博星产品；细菌全基因组DNA提取试剂盒，2×PCRMasterMix（Tigan产品）。

供试培养基：

①Gibbons培养基。

酪蛋白胨0.75%，KCl0.2%，酵母膏1%，MgSO4?

7H2O2%，柠檬酸钠0.3%，pH值7.2～7.4。

1×105Pa，30min灭菌，固体培养基添加2%琼脂，用于高盐样品分离的培养基NaCl浓度分别为20%、15%、10%、0。

②碳源利用培养基。

NaH2PO4?

H2O0.05%，（NH4）2SO40.2%，K2HPO40.05%，CaCl2?

2H2O0.01%，MgSO4?

7H2O0.02%。

1×105Pa，30min灭菌，分别将过滤除菌的葡萄糖、左旋葡萄糖、糊精、甘露醇、淀粉、乳糖、蔗糖、麦芽糖按照0.1%的最终浓度加入。

③LB培养基。

酪蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl1%，1×105Pa，30min灭菌。

　　1.2试验方法

　　1.2.1采样。

采集地表5～15cm样品，装入无菌袋密封，4℃保存。

采样地位于东经107°31′，北纬37°41′，海拔1307m。

　　1.2.2嗜盐菌的分离。

称取土壤样品5g加入45mL10%无菌盐水中，玻璃珠振荡分散均匀。

制备NaCl浓度10%、15%、20%的Gibbons平板，将不同浓度样品涂布平板，待菌落基本成形后，挑取单菌落划线纯化，对分离纯化菌株进行编号，10%NaClGibbons斜面，4℃保存。

　　1.2.3特性嗜盐菌种的筛选。

在不同盐浓度的Gibbons培养平板上对分离纯化的菌株进行培养，对其生长状况每天进行观察，对菌株进行盐度耐受的特性研究。

　　1.2.4嗜盐细菌的形态鉴定及染色鉴定。

按照《一般细菌常用鉴定手册》方法观察菌落的培养特征，并进行革兰氏染色及芽孢染色鉴定。

　　1.2.5嗜盐细菌生理生化检测。

取嗜盐菌在10%NaClGibbons平板上划线接种，选取28、30、35、37、40℃作为培养温度，观察在不同培养温度条件下，嗜盐菌A426的最适生长温度。

在10%NaClGibbons液体培养基接种，培养过夜后，取100μL分别接种于pH值为4、5、6、7、8、9、10的10mL10%NaClGibbons液体培养基中，35℃培养180r/min恒温振荡6h，测定3支平行试管内菌悬液的光吸收（OD600），设置各pH值空白对照，检测嗜盐菌A426的最适生长pH值。

选择D-葡萄糖、乳糖、淀粉、葡萄糖、甘露醇、蔗糖、麦芽糖、糊精8种糖试剂，通过试验判定其是否为可利用碳源。

按照《一般细菌常用鉴定手册》对嗜盐菌的氧化酶、VP试验、吲哚产生、酯酶、H2S产生、脲酶、MR试验、过氧化氢酶、淀粉酶、硫酸盐还原进行检测。

　　1.2.6嗜盐细菌的16SrDNA序列分类鉴定。

选择保守区M13序列，引物序列如下：

27F：

5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′；1492R：

5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

利用Blast软件对测序结果与GenBank数据库进行比对，同时构建分类系统发育树。

　　2结果与分析

　　2.1嗜盐菌的分离筛选

　　根据不同盐度分离土壤中嗜盐菌的数量为1.65×103cfu/g，根据菌落形态特征挑选不同类型菌株33株，其中NaCl浓度为10%的培养基19株、15%的11株、20%的3株。

通过对20%盐度的3株菌种在不同浓度NaCl的Gibbons培养基进行嗜盐特性筛选，发现在含20%、15%、10%NaCl的Gibbons培养基上A426生长均良好，不含NaCl的Gibbons培养基上生长受到抑制，说明该菌需要NaCl作为其生长必须组分，根据Kushner对嗜盐菌下的定义，因此初步鉴定为中度嗜盐菌（图1）。

　　2.2嗜盐细菌A426的镜检观察及染色鉴定

　　试验观察，受检菌株A426菌落特征为灰白色，中间凹陷成草帽状，不透明，表面光润，圆形，菌落直径3～5mm（图2）。

　　革兰氏染色（图3）显示，A426菌株大小约0.5μm×3～4μm，微弯杆状，内有深染物质，革兰氏阴性菌。

　　2.3嗜盐细菌生理生化检测

　　通过对嗜盐菌A426的最适生长温度和最适生长pH值的试验，发现A426在28～37℃的温度范围内可以生长，但最适温度为35℃，在6～9的pH值范围内可以正常生长，但最适pH值为8。

　　碳源利用试验结果（表1）显示，嗜盐菌A426能利用全部8种碳源，故初步判定A426为异养细菌。

　　对A426进行氧化酶、吲哚产生、VP试验、H2S产生、过氧化氢酶、脲酶、淀粉酶、酯酶、MR试验、硫酸盐还原进行检测。

结果表明：

A426不能发酵产生H2S，酯酶、硫酸盐还原和MR试验阴性，氧化酶、VP试验、过氧化氢酶、脲酶、淀粉酶试验均为阳性，可发酵产生吲哚（表2）。

　　2.4嗜盐细菌的16SrDNA序列分类鉴定

　　菌株A426基因组经PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示成功获得与预期大小一致的约为1500bp的基因片段（图4）。

　　数据比对结果显示，A426与盐单胞菌属（Halomonassp.）菌株TG39DQ994160的16SrDNA相关序列相似度达99%，获取与A426序列同源性相关菌株基因及该属菌的模式菌株16SrDNA序列，用系统发育树软件clustalx及MEGA5.0选取N-J法构建系统发育树（图5）。

初步鉴定A426为盐单胞菌属（Halomonassp.）菌株。

　　3结论与讨论

　　通过高盐选择性培养基平板分离法，从陕西定边盐湖土壤样品中，分离筛选获得了极端嗜盐菌株。

该菌的最适生长温度为35℃，最适pH值为8.0。

通过传统的表型特征（包括形态学观察、生长因子试验、生理生化特征）以及系统发育学16SrDNA序列分析鉴定嗜盐菌株的分类学地位。

初步鉴定其为盐单胞菌科（Halomonadaceae）盐单胞菌属（Halo-monas）菌株。

成功获得了定边盐湖地区中度嗜盐菌株A426。

　　陕西定边地处沙漠环境[4]，通过盐湖地区极端微生物资源的分离收集，分析极端嗜盐微生物特性，对黄土高原盐碱环境微生物资源挖掘开发具有探索意义。

　　盐单胞菌是研究较为广泛的一类嗜盐菌，目前已经发现可以发酵产生四氢嘧啶[5]、使用废甘油生产生物塑料聚3-羟基丁酸盐[6]，也有报道盐单胞菌可在缺乏磷盐的情况下利用砷酸盐作为其营养成分[7]，盐单胞菌菌株产生冷休克蛋白具有poly-U结合能力等[8]。

该属菌已经多个标准种得以全基因测序[9-11]，对嗜盐菌的研究开展资源挖掘与利用工作，不仅在微生物适应极端环境机理研究发现新蛋白、新产物或新型发酵菌株[12-14]，而且在工业生产[15]和环境污染治理[16]等多个领域具有一定的应用。

　　4参考文献　　[1]KUSHNERDJ，SOKATEHJR，OMSTONLN，etal.TheBacteria，aTreatiseonStructureandFunction，volⅧ[M].SanDiego：

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