VIGS小知识总结.docx

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1.TRV1和TRV2共注射时，选择植株下部的叶子（lowerleaves）；

2.一般注射后过2周左右时，发生基因沉默，这个时候进行表型分析；

3.用反转录定量PCR检测目的基因在VIGS植株中的表达量，一般TRV-VIGS能使目的基因的表达水平大约下调80%；

4.为了确保侯选siRNA序列只沉默单一的靶基因,侯选siRNA序列应在美国NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）的EST或Unigene数据库进行BLAST同源性比对。

当siRNA序列只同源于靶基因时，才可以用于下一步的基因功能研究。

5.为确保对靶mRNA的有效抑制，针对每一个靶基因应该设计4条以上siRNA序列，进行化学合成后，通过实验筛选出沉默效率最高的siRNA序列进行下一步的基因功能研究。

6.烟草（Nicotianabenthamiana）植株中八氢番茄红素脱氢酶（phytoenedesaturase）基因PDS

GGCACTCAACTTTATAAACCCTGACGAGCTTTCGATGCAGTGCATTTTGATTGCTTTGAACAGATTTCTTCAGGAGAAACATGGTTCAAAAATGGCCTTTTTAGATGGTAACCCTCCTGAGAGACTTTGCATGCCGATTGTGGAACATATTGAGTCAAAAGGTGGCCAAGTCAGACTAAACTCACGAATAAAAAAGATCGAGCTGAATGAGGATGGAAGTGTCAAATGTTTTATACTGAATAATGGCAGTACAATTAAAGGAGATGCTTTTGTGTTTGCCACTCCAGTGGATATCTTGAAGCTTCTTTTGCCTGAAGACTGGAAAGAGATCCCATATTTCCAAAAGTTGGAGAAGCTAGTGGGAGTTCCTGTGATAAATGTCCATATATGGTTTGACAGAAAACTGAAG

7.VIGS载体中对插入片段的方向并无要求，正义链方向及反义链方向的序列均可高效诱导基因沉默（Alkinsonetal.,1998;Bruun-Rasmussenetal.,2007），但是对片段长度和序列特异性有一定的要求。

BothsenseandantisenseorientationsoftheinsertintheTRV2vectorhavebeenshowntoinvokesimilarVIGS.

8.用于VIGS的同源序列需要有较高的特异性，这样可以尽可能降低实验中的“脱靶”效应。

“脱靶”是指siRNA和非目的基因结合，导致非靶标基因沉默。

9.植物基因组中有大量的基因家族，家族间的基因序列相似性非常高，如果需要

特异性地沉默家族中的某个基因，则构建载体的同源片段必须适当的缩短长度以保持沉默的特异性。

10.siRNA设计原则

RNAi发挥作用的核心在于siRNA的序列结构，因此不同的siRNA导致的沉默效果差异非常巨大。

影响siRNA功能因素主要包括siRNA序列结构特点、靶向mRNA的空间结构、RISC与siRNA的相互作用、以及siRNA与mRNA错配。

目前siRNA设计的原则有两种方式：

（1）统计不同siRNA对靶序列抑制程度得到siRNA设计原则。

这个原则就是统计目前已有的siRNA序列，根据序列特点和序列沉默效果分析得到。

a.GC含量在30%-52%

b.有义链15-19位至少有3个A或者U

c.避免出现倒置重复，以防形成发卡结构

d.有义链的第3位核苷酸为A

e.有义链的第10位核苷酸为U

f.有义链的第19位核苷酸为A

g.有义链的第19位核苷酸不能为G或C

h.有义链的第13位核苷酸不能为G

（2）以siRNA序列上的能量为依据，筛选有效序列。

a.总的siRNA双联能量<>

b.反义链5'端的结合能<>

c.有义链的5'端结合能在5-9

e.GC含量在36%-53%

f.中间7-12位的结合能<>

g.反义链5’端与正义链5'端的能量差最好在-1~0

11.根据VIGS的作用机制，理论上引起目的基因沉默的最小插入片段为23bp，但是在实际操作中，23bp的核苷酸长度常常不能有效的启动目的基因沉默的发生，所以需要选择数倍于23nt的目的基因片段，但也不能过长。

为了使目的基因能够有效地沉默，通过实验表明200-500bp插入片段的沉默效果最佳。

当然，也可能存在其他影响沉默效果的因素，如目标基因序列的核苷酸组成、siRNA及目标序列的碱基对的热力学特性等。