食品毒理学第89章Word文档格式.docx
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第一节生殖毒性与发育毒性
环境有害因素造成对亲代的生殖功能及对子代发育过程的有害影响的作用称为生殖毒性和发育毒性。
两者关系密切，但不同研究者对其研究的侧重面有所不同，多数主张对生殖毒性和发育毒性应有所区分。
一、生殖毒性（reproductivetoxicity）
生殖毒性指对雄性和雌性生殖功能或能力的损害和对后代的有害影响。
生殖毒性既可发生于妊娠期，也可发生于妊前期和哺乳期。
表现为外源化学物对生殖过程的影响，例如生殖
器官及内分泌系统的变化，对性周期和性行为的影响，以及对生育力和妊娠结局的影响等。
二、发育毒性（developmentaltoxicity）
发育毒性指在到达成体之前诱发的任何有害影响，包括在胚期（embryonicperiod）和胎期（fetalperiod）诱发或显示的影响，以及在出生后诱发和显示的影响。
发育毒性的主要表现为：
1.发育生物体死亡（deathofthedevelopingorganism）：
指受精卵未发育即死亡，或胚泡未着床即死亡，或着床后生长发育到一定阶段死亡。
早期死亡被吸收或自子宫排出（即自然流产），晚期死亡成为死胎。
2.生长改变（alteredgrowth）：
即生长迟缓（growthretardation）。
能引起胚胎死亡和畸形的毒物多数能引起生长迟缓。
一般认为胎儿的生长发育指标比正常对照的均值低2个标准差时，即可定为生长迟缓。
胎鼠胸骨及枕骨骨化迟缓及低出生体重等是生长迟缓的较敏感指标。
生长迟缓造成的局部发育不全可视为畸形，如脑小畸形和眼小畸形等。
3.功能缺陷（functionaldeficiency）：
包括器官系统、生化、免疫等功能的变化。
功能缺陷往往要在出生后经过相当时间才能诊断。
如听力或视力异常、行为发育迟缓等。
4.结构异常（structuralabnormality）：
指胎儿形态结构异常，即畸形。
致畸性（teratogenicity）是指化学物在胚胎发育期间引起永久的结构与功能异常的性质。
致畸物（teratogen）是指出生前接触，诱发永久的结构与功能异常的物质。
三、生殖与发育毒性的特点及靶器官
生殖与发育过程包括配子（精子与卵子）的发育与形成、交配、受精、合子形成与植入、胚胎形成与发育、分娩等阶段。
生殖与发育过程的每个阶段所涉及的细胞或器官都可能成为外源化学物毒作用的靶。
外源化学物对生殖与发育过程的损害主要有以下几个方面：
1.亲性腺作用（性腺毒性）某些化学物可作用于性腺，影响生殖器官的发育与性腺成熟，或造成性腺组织病理学改变。
例如氯乙烯单体可使睾丸曲细精管萎缩，氯化镉可引起小鼠卵巢出血，排卵抑制。
某些化学物可影响配子的发生、增殖和成熟，使生殖细胞数量减少，功能减退及突变。
例如过量接触二硫化碳的男工多见性机能减退，表现为性欲下降、阳萎。
铅作业工人，特别是铅中毒患者易发生生殖细胞受损，导致精子数目减少，精子活动力降低，精子畸变率增加。
生殖细胞受损的结果是不育、流产、死胎、畸胎和其他先天缺陷。
生殖细胞突变造成的畸胎与妊娠期内接触毒物的致畸作用不同，前者突变发生于父体或母体的性细胞中，突变诱发的畸形可传给后代。
后者突变发生在胚胎的体细胞中，引起的畸形不具有遗传性。
已知的亲性腺毒物有多种，包括固醇类药物，化疗药物，有机磷和有机氯农药，镉、铅、汞和二硫化碳等。
2.亲胚体作用（胚体毒性embryotoxicity）某些化学物可作用于妊娠早期（即从受孕到胚体形成阶段），对胚体发育产生损害作用。
某些化学物可以降低胚体对必需营养素的利用度，如EDTA降低胚体对微量元素的利用度，氨基蝶呤降低胚体对叶酸的利用度。
当给予母体这些化学物时，可导致与缺乏这些必需营养素相似的胚体毒性。
胚体毒性、胎体毒性（fetotoxicity）和胚胎毒性（embryo-fetaltoxicity）是指由出生前接触引起对孕体的任何有害影响，包括结构和功能异常，或这种影响在出生后的表现。
这些术语与有害作用诱发的瞬间／时期有关，而不考虑检测的时间。
3.亲胎盘作用（胎盘毒性placentaltoxicity）某些化学物可对胎盘造成损伤，改变胎盘血流量，降低胎盘对营养物质的转运，特异地干扰胎盘功能（如内分泌和代谢功能）。
例如5-羟色胺使小鼠动、静脉狭窄，胎盘血流量减少，胎盘转运功能障碍，引起死胎和先天畸形；
甲基汞改变人胎盘滋养层微绒毛对不能代谢的氨基酸的摄取，而致功能致畸，即先天水俣病。
患儿严重神经迟钝，共济失调，步行困难，语言、咀嚼，下咽困难和大发作性癫痫。
除上述外，化学物还可引起胎期毒性，哺乳期毒性（通过乳汁致婴儿中毒，如铅中毒），和通过对中枢神经系统及全身机能状态的毒作用来影响生殖过程。
某些化学物还能经胎盘致癌（transplacentalcarcinogenesis）即致癌物由母血经胎盘进入胚胎，造成胚胎期接触，引发后代肿瘤。
己烯雌酚（diethylstibestml）是第一个被证明的人类经胎盘致癌物（transplacentalcarcinogen）。
孕妇孕早期作为保胎药服用时，女性后代可发现阴道透明细胞腺癌（clearcelladenocacinoma）、阴道腺癌（adenosis）及阴道和子宫颈隆起；
男性后代可发生附睾囊肿、睾丸营养性衰竭、睾丸囊性硬结、小阴茎畸形及精子异常。
经胎盘致癌的发育致癌物（developmentalcarcinogen）通过动物实验已发现了40多种。
化学物的生殖发育毒性有两个显著的特点：
一是生殖过程较机体的其他系统或功能对某些化学物的毒作用更为敏感，在成体系统毒性的未观察到有害作用的水平（noobservedad-verseeffectlevel，NOAEL）胎儿即可受到影响。
例如妊娠期接触过不足以引起肿瘤的低剂量二乙基亚硝胺（diethyllnitrosamine），仔鼠成年后再次接触，则肿瘤发生率增加。
二是损害作用不仅表现在接触化学物质的机体本身，还可影响其后代。
例如母鼠接触高浓度二硫化碳引起致畸作用，其子一代既使不再接触二硫化碳，交配后所生的子二代仔鼠也出现与子一代仔鼠几乎完全相同的畸变类型。
第二节生殖与发育毒性试验的目的和实验设计的要点
评价化学物对生殖和发育的毒性需要三方面的资料，即环境流行病学，动物生殖与发育毒性试验和控制的临床研究。
另外体外筛选试验还可为发育毒性提供初筛和补充。
但是在一些新化学品和药品开发初期，显然不可能得到流行病学方面的资料，也不能直接对人体做临床研究，首先要靠动物试验来预测它们对人生殖与发育的危险。
生殖与发育毒性研究的目的是揭示化学品／药品对哺乳动物生殖发育的任何有害影响，并将研究的结果与所有可以得到的其他药理学和毒理学资料联系起来，以推测对人可能造成的生殖危险。
研究应包括成年动物和从受孕到子代性成熟的各个发育阶段接触受试物。
为检测接触所致的即发和迟发效应，应连续通过一个完整的生命周期，即从亲代受孕到子一代受孕。
为清楚地阐述各试验方案的组合，现将完整的生殖发育过程细分为如下阶段。
A阶段交配前到受孕：
检查成年雄性和雌性生殖功能，配子的发育与成熟，交配行
为，受精。
B阶段受孕到着床：
检查成年雌性生殖功能，胚胎着床前发育、着床。
C阶段着床到硬腭闭合：
检查成年雌性生殖功能，胎体发育，主要器官形成。
D阶段硬腭闭合到妊娠结束：
检查成年雌性生殖功能、胎体的发育与生长，器官的发育与生长。
E阶段出生到断乳：
检查成年雌性生殖功能，新生仔对宫外生活的适应，断乳前的发
育与生长。
F阶段断乳到性成熟：
检查断乳后的发育与生长，对独立生活的适应，达到完全的性
功能。
以上不同阶段的组合可以构成许多可能的测试方案，各个国家和国际机构均发布了不同
的试验准则和研究设计细则。
本章介绍ICH准则和我国新药评价、农药及健康相关产品安全性评价中推荐的三段生殖毒性试验，一代和二代（多代）生殖毒性试验。
本章将用如下术语来描述整个生殖与发育过程：
孕体[conceptus，包括胚体（embryo）和胎体（fetus）]、幼体（仔体pup）、成体（adult）、母体（materal）、父体（paternal）、亲代（parentalgenetation）和子代（offspring）。
实验设计的一般考虑如下：
一、动物选择
必须以哺乳动物为实验对象。
一般要求使用与其他毒理学研究中相同的物种与品系，以免必须进行另外的预试验。
原则上实验动物对受试物的动力学、毒效学及其他有关参数应与人最接近，如代谢过程与生物转化应与人相近、胎盘结构与人相似、健康、生育力强、多产、孕期短、自发畸形率低、价廉、易得和操作方便。
实际上没有一个固定物种可通用于精确模拟人类生殖毒性研究。
在毒理学评价程序中，如果借助毒物动力学，药理学和毒理学的资料，能显示所选物种是人的生殖毒性实验的恰当模型，则用一种动物就够了。
首选啮齿类中的大鼠，因用大鼠获得的其他实验结果有可比性并积累了大量的背景资料。
在胚体——胎体毒性研究中，传统上要求用第二种哺乳动物进行试验。
家兔因其也有较广泛的背景资料和比大鼠更接近人的代谢类型而作为“非啮齿类”优选使用。
在测试多巴胺类兴奋剂或降低催乳激素水平的化合物时，大鼠不是一个好的动物模型，因为大鼠需要催乳素来维持早孕，在这种情况时使用家兔可能更好。
但家兔孕期长短不定（32～36天），有时缺乏毒性资料，对某些抗生素和消化道紊乱有易感性，在其他生殖毒性研究中较少用。
二、接触选择
1.剂量剂量选择应依据从所有已进行的药理学、急性和慢性毒性、以及动力学研究中得到的资料。
高剂量应该在母体中产生轻度的毒性，如体重增长减少，体重增长速度改变（与扰乱了内环境稳定的机理有关）、特异的靶器官毒性、药理学反应增强（如镇静、惊厥）、阴道出血、流产等。
在研究中，要对所观察到的效应进行剂量—反应关系分析时，推荐至少用三个剂量水平和适当的对照组。
低剂量不应有任何可归因于受试物的有害作用。
中剂量组应在高、低剂量之间按等比级差定位，应引起最小的毒作用。
如果对结果有怀疑，应增加第四个剂量组，以免剂量间隔过大。
实验结果应提供最高未观察到有害作用水平的剂量，否则应对该受试物进行进一步深入的研究。
在大多数情况下，最高限量剂量为1g（kg·
d）假如仍未引起血浆和组织浓度增加时，可略微增加染毒剂量。
在测试低毒物质时，假如剂量达到1g（kg·
d）仍不产生胚胎毒性或致畸，则没有必要进行其他剂量水平的研究。
假如在高剂量进行的初步研究中，有明显的母体毒性的证据而未显示对胚胎的有害作用，也没有必要进行其他剂量水平的研究。
2.接触途径与频率应与人的接触途径相同，如果采用其他接触途径，必须依据动力学的资料。
接触频率一般是一日一次，每日在相同时间染毒，并按体重调整染毒剂量。
3.对照组用与试验组相同的最大容量的赋形剂。
当赋形剂可能有不良影响（如减少食物的摄取和利用）或影响受试物的作用时，应再设未处理对照组。
第三节三段生殖毒性试验
用一组试验研究全部生殖毒性的终点是不可能的，所以在决定适当的策略和选择研究设计时，应考虑该受试物和其类似物质所有可能得到的药理学、动力学和毒理学资料。
对大多数医药产品来说，三段生殖毒性试验设计通常是适当的。
关键因素是各个生殖阶段之间不得有间隔，即在三个有关联的阶段接触受试物的时期至少有一天的重迭，并能直接或间接地评价生殖过程的所有阶段。
三段生殖毒性试验由生育力和早期胚胎发育毒性试验，胚体——胎体毒性试验（致畸试验）和出生前后发育毒性试验（围产期毒性试验）三部分组成（图8-1）。
三段的划分是按有害作用诱发的时期，而不考虑检测的时间。
图8-1三段生殖试验图解
Ⅰ生育力和早期胚胎发育毒性试验Ⅱ胚体一胎体毒性试验（致畸试验）Ⅲ出生前后发育毒性试验
一、生育力和早期胚胎发育毒性试验
1.研究目的评价化学物对配子成熟、交配行为、生育力、胚胎着床前和着床的影响（包括前述生殖发育过程A和B阶段的评价）。
雌性包括对动情期、输卵管运输、着床和胚胎着床前阶段发育的影响。
雄性包括检测对功能的影响（例如性欲、附睾的精子成熟等）。
2.动物至少一种，首选大鼠。
每性别、每组的动物数应足以对数据进行有意义的解释。
建议每性别、每组16~20窝。
3.给药期应说明交配前染毒时间的长度并提供依据。
一般采取雄性交配前四周开始重复染毒，直至交配成功。
若要保证雌性受孕成功，雄性也可继续染毒，仍同笼至处死。
雌性交配前两周开始染毒（可覆盖至少两个完整的动情期）直至着床。
交配前雄性染毒期限较以往的规范变动较大，1981年OECD规定大鼠至少10周，小鼠8周。
然而与雌鼠交配不是检测对精子发生影响的敏感的方法。
实际上没有一个实例表明受试物对雄性生殖毒性的结论是仅靠雄鼠连续给药8～10周后与雌性交配得出的。
精子存活率和形态学检查等进一步研究可为在生殖毒性研究观察到的毒作用提供更敏感的终点。
另外，已知影响精子发生的外源化学物几乎总是影响减数分裂后阶段（精子成熟前3～5周）。
对雄性性腺组织和器官进行仔细的组织病理学检查（Bouin'
s液固定，石蜡包埋，睾丸作横切片，附睾作纵切片，PAS和苏木精染色）可对雄性生育力和精子发生影响提供有价值的补充信息。
所以ICH准则将雄性染毒期缩短为4周，并结合组织病理学检测。
4.交配及受孕检查雄大鼠给药4周，雌大鼠给药2周后开始同笼。
交配期2~3周，交配比例1∶1。
实验程序应能识别出各窝的2个亲本，以避免不正确结果的分析和解释。
雌性受孕检查一般靠查阴道涂片（大鼠）或阴栓（小鼠）。
阴道涂片上有较多白色分泌物，镜检可见有较多有核上皮细胞，则提示雌鼠处于动情前期。
大鼠性周期一般为4～5天，小鼠性周期为4天，动情前期向动情期移行多在夜间。
人和几种常用实验动物早期发育时间表8-1。
阴栓是雄鼠精囊与凝固腺在雌鼠阴道凝结而成的白色块状物，形似米粒，大鼠阴栓很易脱落。
观察到阴道涂片上的精子或阴栓即提示受孕，检出日为孕0天，次日为孕1天，以此推算孕龄。
表8-1某些哺乳动物早期发育的时间
早期发育的时间（由排卵起的天数）
物种
胚胞形成着床器官形成期妊娠长度
小鼠3～44～56～1519
大鼠3～45～66～1522
家兔3～47～86～18～33
猴（恒河猴）5～79～1120～45164
人5～88～1321～56267
5.终末处死雌性一般在孕中期第13-15天终止妊娠。
雄性在证实交配并受孕成功后处死检查。
6.观察项目染毒期间观察雌、雄亲代（Po）体征和死亡（至少1次／日），体重和体重改变（至少2次／周），摄食量（1次／周），镜检雌性阴道涂片（交配期间1次／天）和其他毒性研究中见到的靶效应。
处死时所有成体均作尸体解剖和肉眼观察，进行所有动物的睾丸、附睾、卵巢和子宫的组织学检查，附睾或睾丸中的精子计数以及精子存活力测定。
检查计数雌性的黄体数，着床数，吸收胎，死胎和活胎数。
保存肉眼发现改变的脏器，以便进行可能的组织学评价，并保存足够的对照组的相应脏器，以供比较。
对明显未孕的大鼠或小鼠（而不是对家兔），可用硫化铵子宫染色鉴别胚胎着床前死亡。
7.结果评定综合对F0代观察的各项指标和参数，用合适的统计方法分析和评价。
在分析对胎体（子一代，F1）的影响时，应考虑下述参数：
各组受影响的窝数比；
每窝受影响的胎体的组平均百分率；
受影响胎体总数比。
在对生殖与发育毒性的试验结果进行推理统计（显著性检验）时，应以窝（litter）[在两种性别均被处理时，以交配的双方（matingpair）]；
在两代生殖毒性试验中，以亲代交配的双方，而不是以胎体或新生仔为比较的试验单位。
二、胚体—胎体毒性试验（致畸试验）
1.研究目的评价母体自胚泡着床到硬腭闭合期间接触受试物对妊娠雌性和对胚体—胎体发育的有害影响，即前述生殖发育过程中的C和D阶段，主要包括增强了与非妊娠雌性有关的毒性，胚体—胎体死亡、生长改变与结构异常。
2.动物通常用两种，一种是啮齿类，首选大鼠，另一种是非啮齿类，最好是兔。
若仅用一种动物，需提出正当理由。
每组动物数应足以对数据进行有意义的解释。
建议每组16~20窝。
雌性宜用性成熟的，未交配过的动物。
3.给药期从着床期到硬腭闭合，即器官形成期，大、小鼠孕期的第6~15天，兔孕期的6～18天。
致畸实验日程见表8-2。
表8-2致畸试验日程
大鼠小鼠兔
交配90～120日龄60～90日龄成年末交配过的
染毒时间孕第6～15日孕第6～15日孕期6～18日龄
处死取胎孕第20日孕第18日孕第29日
致畸试验除阴性对照外、应设阳性对照组。
阳性对照大、小鼠可用乙酰水杨酸或浓缩鱼肝油，家兔可用6-氨基烟酰胺。
阴性与阳性对照组的作用分别是为自发畸形的发生和该批实验动物在试验条件下的敏感性提供资料。
已经进行过致畸试验并确知所用试验动物有阳性结果的实验室，可略去阳性对照。
4.终末处死与标本制作在分娩前一天处死怀孕母体，以防止自然分娩后，母体吞食畸形子。
剖腹检查亲代受孕情况和胎体发育。
除逐个检查所有胎体的存活和畸形外，尚需分别检查软组织和骨骼的异常。
将每窝50％胎仔经茜素红染色后，作骨骼检查。
另外50％胎仔经Bouin’s固定后，作内脏检查。
当使用新鲜标本的显微解剖技术（microdissec-tiontechniques）检查软组织改变时（对家兔胎体检查的最好方法），100％的家兔胎体均作软组织和骨骼检查。
5.观察项目染毒期观察妊娠动物的体征和死亡（1次／日），体重和体重改变（2次／周），摄食量（1次／周）和在其他毒性研究中已证实的重要靶效应。
有流产和早产征兆者处死并进行肉眼检查。
处死时对所有妊娠动物进行尸体解剖和肉眼检查任何结构异常或病理改变。
保存肉眼发现有改变的脏器，以便进行组织学评价，亦保存足够的对照组的相应脏器，以供比较。
取出子宫，称带有胎体的子宫重，以得出妊娠雌性动物的净增重。
计数黄体数，吸收胎数，活胎数与死胎数及着床点，称胎盘重并作肉眼评价，必要时可作组织学检查。
称活胎体重，检查
胎体性别，以及外观、内脏和骨骼畸形。
6.结果评定致畸研究的发现应根据观察到的效应和产生效应的剂量水平进行评价。
有必要考虑所用试验动物的物种／品系的历史的致畸性资料。
致畸研究进行适当，应提供一个符合要求的NOAEL（未观察到有害作用水平）的估计。
虽然将实验结果外推到人的可靠性有限，然而NOAEL的建立，使得能以采取适当的安全系数。
对母体的终点评价指标包括：
体重、体重变化、食物消耗量和母体毒性体征及母体畸胎出现率等。
对胎体影响的评价应包括：
受影响的窝数比、每窝受影响胎体数的组间均数、受影响的胎体总数比、畸胎率和某单项畸胎率等。
7.影响致畸作用的因素致畸作用受多种因素影响，主要包括敏感期、遗传类型、剂量和母体毒性等。
（1）致畸敏感期实验证明器官形成期（organogenesisperiod）是发生形态结构畸形（malformation）的关键期（criticalperiod）。
迅速改变细胞分裂速度对畸形发生是极为重要的，因为增加复制速度即增强了突变的可能性。
器官形成期正是细胞分裂极旺盛的时期。
例如发育中的大鼠在妊娠第8～10天之间，有10次细胞有丝分裂，产生N×
210新细胞（N表示器官形成期开始时的细胞数）。
人的器官形成期在人妊娠的第3～8周。
60年代反应停药物致畸事件就在人怀孕后的20～35天内，在无一般毒性的“安全剂量”[1mg／（1g·
d）]下发生的，有人甚至在这阶段内只服过一次药。
大多数器官又都有其对致畸作用的特殊敏感期，即“靶窗（targetwindows）”。
形态畸形和功能缺陷的敏感期也不同。
致畸实验的染毒时间，必须安排在器官形成期，才有可能观察到形态畸形的致畸效应。
由于各物种妊娠期长短不同，敏感期的长短也不同，致畸试验的染毒时间需随动物种属而易。
图8-2表示人、大鼠和家兔的致畸作用关键期的比较，并图解狭窄的“靶窗”概念。
（2）遗传类型致畸作用存在明显的物种差异，这种差异是因代谢变化、胎盘种类、胚胎发育的速度和方式引起的。
致畸物各有其易感物种和品系，易感性取决于机体的基因型。
推测化学物生物转化成活性中间产物的速度和途径与遗传因子有关，而畸形仅发生在那些形成恰当代谢物的物种中。
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