基于产酸能力和高活菌数的益生菌复合菌种发酵技术研究.docx
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基于产酸能力和高活菌数的益生菌复合菌种发酵技术研究
基于产酸能力和高活菌数的益生菌复合菌种发酵技术研究
摘要：
为了提高益生菌发酵乳的活菌数及发酵过程中的产酸能力，本研究以干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌为试验菌种，通过单菌种发酵和复合菌种发酵试验，筛选出最佳的复合菌种组合。
试验结果表明：
在接种量为5%，接种比例为1∶1，发酵温度为37℃，葡萄糖的添加量为2.5%（质量分数），脱脂乳乳固体质量分数为12%的条件下，干酪乳杆菌和双歧杆菌复合发酵效果最佳，最大滴定酸度可达到328°T，最大活菌数达到2.3×1011mL-1，与其他菌种组合相比，提高了一个对数级，且在贮藏过程中活菌
数下降速度较慢。
关键词：
益生菌；乳酸菌饮料；干酪乳杆菌；双歧杆菌；共生作用
Abstract:
Toincreasethenumberofviablebacteriainprobioticdrinksandtheacidproducingabilityinthefermentationprocess,Lactobacillus
casei、Lactobacillusacidophilus、Bifidobacterium、StreptococcusthermophilusandLactobacillusbulgaricuswerestudied.Probioticswithhighacidsandhign
numberofviablebacteriawereselectedbysinglestrainfermentationandcompoundmicrobialfermentation.Intheconditionof5%inocula-
tionvolume,1∶1inoculationproportion,37℃fermentationtemperature,2.5%glucosecontent，12%milksolidcontent，theoptimalport-
foliooffermentationisthecombinationofLactobacilluscaseiandBifidobacterium,themaximumacidproductionis328°T，themaximum
numberofviableprobioticsis2.3×10
11
mL
-1
.Comparedwithotherbacteriacombination,alogarithmiclevelisimprovedandthenumberof
viableprobioticsdeclinesslowlyduringthestorage.
Keywords:
probiotic;Lactobacillusdrink;Lactobacilluscasei;Bifidobacterium;symbiosis
zgrpgy@
中国乳品工业
18Vol.41，No.92013（total274）
0
引言
益生菌是一类可通过改变肠道菌群平衡而对动
物施加有利影响的活的微生物添加剂
[1]
。
益生菌在人
体内发挥益生作用的前提条件是进入人体后能够存
活并且增殖
[2]
。
要获得益生菌的保健功效，每日摄入的
益生菌数量要达到10
8
~10
9
个
[3-4]
。
目前市场上乳酸菌饮
料含益生菌数量少，随着货架期延长，益生菌数量逐
渐下降
[5-6]
。
相关研究表明，有些市售产品货架期结束
后活菌数可达90%的衰减
[7]
。
在乳酸菌饮料的制备过程
中，由于受到乳酸菌产酸能力的限制，在产品中需要
补充柠檬酸等有机酸，但是柠檬酸的添加会导致活菌
数下降
[8]
。
同时饮料中添加额外的有机酸又是产生沉
淀的因素，从而影响饮料的稳定性。
若菌种的产酸能
力足够强，在乳酸菌饮料的调配过程中就不需要额外
添加酸味剂。
本研究以菌种自身特性为依据，考虑相
互间的共生作用，研究发酵过程中不同菌种的产酸能
力以及活菌数变化，以期开发出产酸能力和活菌数高
的复合菌种发酵技术。
1
实验
1.1
材料及设备
菌种：
干酪乳杆菌，双歧杆菌，嗜酸乳杆菌，保加
利亚乳杆菌，嗜热链球菌。
脱脂奶粉（进口），葡萄糖（市售一级）。
氢氧化钠、
酚酞指示剂，均为分析纯。
MRS合成培养基。
设备：
SW-CJ-1FD型单人单面净化工作台；MJ-
250BS-Ⅱ型霉菌培养箱；101型电热鼓风干燥器；S20
型PH计。
1.2
方法
1.2.1菌种的制备与活化
称取干酪乳杆菌、双歧杆菌冻干发酵剂各1g，分
别投放于99mL的灭菌脱脂奶中，摇匀，制成菌含量
为1%的接种菌液。
发酵接种量以接种的脱脂乳体积
计算。
嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌→分别接种于
灭菌脱脂奶中→37℃发酵至凝乳（第一次活化）→第二次活
化→备用
1.2.2益生菌发酵乳制备工艺流程
脱脂奶粉+葡萄糖+水→60~65℃溶解→116℃杀菌15min→
冷却至37℃左右→接种→37℃发酵→冷却至15℃→4℃冷藏
[9]
1.3
实验内容与设计
1.3.1益生菌单菌种发酵能力
以干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、嗜热链球
菌、保加利亚乳杆菌为试验对象，接种量为5%，发酵
温度为37℃，葡糖糖的添加量为2.5%（质量分数），脱
脂乳乳固体质量分数为12%。
从接种开始计时，到发
酵乳的酸度不随时间变化为发酵终点。
实验过程中测定不同乳酸菌的产酸能力和发酵
活菌数，筛选出产酸能力强、活菌数高的菌种进行混
合发酵试验研究。
1.3.2益生菌复合菌种发酵
以单菌种发酵实验筛选出的干酪乳杆菌、双歧杆
菌、和嗜酸乳杆菌为实验对象，按1︰1的比例进行接种，
其他发酵条件不变。
从接种开始计时，到发酵乳的酸度
不随时间变化为发酵终点。
试验过程中考查不同复合
菌种的产酸能力和发酵活菌数，筛选最优发酵组合。
1.4
主要指标的测定方法
1.4.1酸度的测定
pH值采用pH计直接测定。
滴定酸度：
采用氢氧化钠直接滴定法，准确称取10g
左右的样品，以酚酞为指示剂，用浓度为0.01mol/L的氢
氧化钠溶液标定至微红色，其计算公式为
滴定酸度/°T=
C×V×100
m×0.1
，
式中：
C为氢氧化钠的浓度；V为滴定的体积；m为
样品的质量。
1.4.2活菌数的测定
益生菌的活菌计数采用国标GB4789.35-2010中
改良MRS固体培养基平板倾注法
[10]
。
2
结果与分析
2.1
不同益生菌产酸能力及发酵活菌数
2.1.1单菌种发酵过程的酸度变化及最大产酸量
本文研究了干酪乳杆菌等5个菌种的发酵速度及最
大的产酸能力，结果如图1和图2所示。
由图1可以看出，产
酸能力最大的是干酪乳杆菌，培养96h酸度达到305°T，
嗜酸乳杆菌产酸能力为220°T，双歧杆菌为205°T，保加
利亚乳杆菌为136°T，嗜热链球菌为130°T。
嗜热链球菌
和保加利亚乳杆菌的产酸曲线很相似，且两者在发酵
24h后，发酵乳的酸度基本不变。
嗜酸乳杆菌在发酵初
期，产酸速度较快，发酵5h即发生凝乳，48h后，发酵
乳的酸度变化不明显。
干酪乳杆菌与双歧杆菌发酵初
期产酸速度相对较慢，干酪乳杆菌的产酸周期最长，
产酸能力最强。
由图2可以看出，随着时间的增长，发酵乳的pH值
不断变小。
但试验菌种的pH值在24h后变化幅度均很
小。
从图1和图2的曲线变化幅度可以直观看出，发酵
乳的滴定酸度要滞后于pH值，主要由于pH值的大小
不仅取决于酸的数量和性质,而且还受到该介质中缓
冲物质的影响
[11]
。
所以不同菌种发酵的pH值大小主要
取决于从接种开始到24h这段时间pH的变化值。
目前乳酸菌饮料的制备一般都需48h甚至更长时
间的发酵，以产生足够的风味物质和酸度。
嗜热链球
菌和保加利亚乳杆菌的产酸能力不强，发酵周期短，
不适合作为乳酸菌饮料的发酵菌种。
直接筛选产酸能
力较强的干酪乳杆菌、双歧杆菌、嗜热链球菌进行活
菌总数测定试验。
2.1.2单菌种发酵过程的活菌总数变化
以上述试验中产酸能力较强的3种菌种（干酪乳杆
菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌）为试验对象，实验条件不变，
每隔24h取样，进行活菌总数的测定，结果如图3所示。
图
1
单菌种发酵的滴定酸度随时间变化曲线
图
2
单菌种发酵的
pH
值随时间变化曲线
ResearchPapers
研究报告
192013年第41卷第9期（总第274期）
由图3可以看出，发酵24h后，干酪乳杆菌的总活
菌数要明显高于其他两种菌种。
在发酵72h后干酪乳
杆菌活菌数达到最大值为8.4×10
10
mL
-1
，随后活菌数
下降缓慢；双歧杆菌和嗜酸乳杆菌在发酵48h后活菌
数达到最大值分别为3.0×10
9
mL
-1
和2.0×10
9
mL
-1
，随
后下降，且下降速度较快。
随着发酵的进行，菌种由稳
定期进入衰亡期，菌体出现自溶现象，再加上酸度对
菌体的抑制作用随着酸度的增大越明显
[12]
，所以总活
菌数呈现下降的趋势。
菌种的发酵性能除了受外部生
长环境的影响，还与自身生理特性有关
[13]
。
各菌种进入
衰亡期的时间不同加之对酸度的耐受性不一样，活菌
数下降的时间和速度也就不一样。
在相同发酵条件
下，干酪乳杆菌的最大活菌数要明显高于其它两种菌
种，且活菌数下降的时间比其他两种菌种晚。
2.2
菌种混合发酵对发酵乳酸度和活菌数的影响
2.2.1复合菌种发酵对发酵乳酸度的影响
发酵过程中每隔12h取样，测定发酵乳的滴定酸
度和pH值，结果如图4和图5所示。
用方差分析法对发
酵乳的最大产酸量进行显著性分析，发酵乳最大产酸
量之间差异极显著（P﹤0.01）。
由图4和图5可以看出，干酪乳杆菌与双歧杆菌混
合发酵时，产酸量最大，pH值达到3.24，滴点酸度达到
328°T，比干酪乳杆菌单独发酵时的产酸量稍大。
且在
同一时间点时，复合发酵的产酸量要大于其中任何一
种菌种单独发酵的产酸量。
这就充分说明复合发酵可
以加速菌种的产酸速度。
2.2.2复合菌种发酵对发酵乳中活菌数的影响
采用方差分析法对复合菌种的最大活菌数进行显
著性分析。
各复合菌种的最大活菌数之间差异极显著
（P﹤0.01）。
图6中列出了不同组合混合菌种发酵过程
中的活菌数变化。
由图6可以看出，4组复合菌种均在发
酵第48h后达到最大活菌数，与图3对比可得，复合菌
种的最大活菌数要大于其中单菌种发酵的最大活菌
数。
所以当复合菌种存在共生作用时，可以提高发酵效
率，缩短发酵时间，提高发酵乳的总活菌数，但是否加
快发酵乳风味物质的形成则有待进一步的研究。
其中
干酪乳杆菌和双歧杆菌混合发酵的共生作用最为明
显，最大活菌数的对数值达到11.36（2.3×10
11
mL
-1
），且
活菌数下降速度较慢。
3种菌种以1∶1∶1的比例混合发
酵时，其总活菌数和产酸量低于干酪乳杆菌与双歧杆
菌复合发酵以及干酪乳杆菌与嗜酸乳杆菌复合发酵
的总活菌数和产酸量，具体原因有待进一步的研究。
由图6与图4和图5对比可以看出，几组复合菌种
的活菌数与酸度成线性关系，活菌数越大，复合菌种
的产酸量也越大。
可能由于菌体在生长对数期大量增
殖，并利用乳糖作为能量来源生成大量乳酸
[1]
，48h之
后，虽然活菌总数下降，但是发酵乳中的乳糖和葡萄
糖还没有消耗完，活菌仍可以利用其作为能量来源物
质生成乳酸
[14]
。
因此活菌基数越大，活菌下降速度越
慢，产生的乳酸也就越多。
2.3
结果与讨论
从本次实验的结果可看出，干酪乳杆菌和双歧杆
菌复合发酵效果最佳，产酸量可达到328°T，最大活菌
数达到2.3×10
11
mL
-1
，与其他条件下的
图
3
各菌种的活菌总数随时间变化曲线
图
4
复合菌种发酵的滴定酸度随时间变化曲线
图
5
复合菌种发酵的
pH
随时间变化曲线
图
6
复合菌种发酵的活菌总数的变化曲线图
（下转第40页）
研究报告
ResearchPapers
202013年第41卷第9期（总第274期）
最大活菌数相比，提高了1~2个数量级。
张天鸿报道的
益生菌产品活菌数与保健效果关系之研究
[15]
一文从菌
体细胞的大小角度分析得出，若产品含10
12
g
-1
以上的
活菌，则表明其生产效率已经达到理论值。
所以不管在
何种条件下，活菌数不会超过10
12
g
-1
。
而本试验在没有
进行发酵条件优化的前提下，最大活菌数可达10
11
mL
-1
，
对实践生产中菌种的选择具有重大指导意义。
3
结论
从菌种的产酸性能和活菌数变化两方面比较可
得，在单菌种实验中，干酪乳杆菌的发酵性能要优于
其他菌种的发酵性能。
当复合菌种存在协同生长机制
时，可显著促进发酵。
这种作用表现最为明显的是干
酪乳杆菌和双歧杆菌的复合发酵。
在接种量为5%，接
种比例为1∶1，发酵温度为37℃，葡萄糖的添加量为2.5%
（质量分数），脱脂乳乳固体质量分数为12%的条件
下，干酪乳杆菌和双歧杆菌复合发酵的滴定酸度可达
到328T°，最大活菌数达到2.3×10
11
mL
-1
，与其他条件
下的结果相比，有显著性差异。
本研究从生产源头出
发，解决了目前乳酸菌饮料活菌数量不足的问题，为
实践生产中菌种的筛选提供了依据。
参考文献
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（上接第20页）
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研究报告
ResearchPapers
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