白细胞SIRT1SIRT4与2型糖尿病.docx

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白细胞SIRT1SIRT4与2型糖尿病

白细胞（WBC）SIRT1,4与2型糖尿病

SIRT1,4inwhitebloodcells（WBC）andtype2diabetes

宋荣华1，许文灿1，傅玉才2

[摘　要]　目的:

了解外周血白细胞（WBC）中Sirt1，4与2型糖尿病（T2DM）的相关性，能否作为检测指标用于反映T2DM患者的血糖/血脂水平以及胰岛β细胞功能。

方法:

收集正常健康对照组（NC组）与T2DM组的资料，用免疫细胞化学染色检测sirt1,4在WBC（包括粒细胞、单核细胞、淋巴细胞）中的表达情况，用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测WBC中Sirt1，4的相对mRNA水平。

结果显示SIRT1在粒细胞、单核细胞的胞核和胞浆中都有表达，而SIRT4主要在这两种细胞的胞浆中表达，但SIRT1,4在淋巴细胞中表达不明显。

RT-PCR结果显示，T2DM组sirt1、4mRNA水平显著低于NC组（P<0.01）。

相关性分析结果显示WBC中SIRT1,4表达与T2DM及其血糖、血脂是相关的。

结论:

SIRT1,4在WBC中有表达，WBC中SIRT1，4表达也许可以间接反映胰岛β细胞功能，并且与T2DM之间可能存在关系。

关键词:

SIRT1，SIRT4;2型糖尿病；外周血白细胞，胰岛β细胞

[Abstract]Objective:

ToexploretherelevancebetweenSirt1,4inwhitebloodcells（WBC）ofperipheralbloodandtype2diabetes（T2DM）,whetherSIRT1,4inWBCasadetectionindexcanbeusedtoreflecttheglucose/lipidlevels,andisletβ-cellsfunctionofT2DMpatients.

Methods:

Collectthedataofnormalcontrolgroup（NCgroup）andT2DMgroup,immunocytochemistrystainingisusedtodetectsirt1,4expressioninWBC（includinggranulocytes,monocytes,lymphocytes）,reversetranscriptionpolymerasechainreaction（RT-PCR）isusedtodetecttherelativeSirt1,4mRNAlevelsinWBC.

Result:

ImmunocytochemistrystainingshowsthatSIRT1expressesinthenucleus,cytoplasmofgranulocytesandmonocytes,andSIRT4mainlyexpressesinthecytoplasmofthesetwocells,buttheexpressionofSIRT1,4inlymphocytesaren’tobvious.RT-PCRresultsshowthat,SIRT1,4mRNAlevelsofT2DMgrouparesignificantlylowerthanthoseofNCgroup（P<0.01）.CorrelationanalysisshowsthereisasignificantlycorrelationbetweenSIRT1,4andbloodglucose/lipidlevels.

Conclusion:

SIRT1,4expressinWBC（granulocytes,monocytes）;theremaybeexistarelationshipbetweenSIRT1,4expressioninWBCandtype2diabetes（T2DM）;SIRT1,4expressioninWBCmayindirectlyreflectthefunctionofisletβ-cells.

2型糖尿病（T2DM）是一种衰老相关性疾病。

目前的研究已经显示出，能量限制（CR）是最有效的措施，来延缓衰老进程和延迟许多衰老相关性疾病的发生，甚至延长低等生物（酵母、线虫、果蝇）和哺乳动物的寿命[1]。

众多的研究表明，CR主要通过通过沉默信息调节因子（silentinformationregulator2,Sir2）信号通路来发挥作用[2]。

Sir2，一种组蛋白脱乙酰化酶，在酵母和线虫中已经显示出是一种对能量限制敏感和减缓衰老的关键性因子[3]。

Sir2在哺乳动物的同源基因命名为sirtuins（简写为SIRT），包括了七个同源基因SIRT1-7[4]。

T2DM是糖脂代谢失衡性疾病，而SIRT1,4在糖脂代谢平衡的维持中扮演着关键性的角色[7]，极有可能与糖尿病的发生相关，所以研究SIRT1,4和T2DM的关系就显得极其重要。

胰岛β细胞的功能与T2DM有着密切的关系，如果在临床能方便、快捷地检测β细胞的功能，从而对于监测T2DM的病程、严重程度、药物治疗后的效果很有意义。

研究发现SIRT1在肝、脑、肾、脂肪、肌肉组织中表达，并且相对特异地、均匀地表达在胰岛细胞中,胰岛之外的外分泌腺细胞几乎未见表达[8]；SIRT4在胰腺的胰岛中表达[9]。

然而，SIRT1,4在白细胞（包括粒细胞、单核细胞、淋巴细胞）中有无表达以及与能量代谢的关系仍不清楚。

证据表明，哺乳动物在CR情况下，胰腺内的SIRT1表达上调,而SIRT4表达下调[10]。

而当T2DM的前期胰岛素抵抗发生时，伴随着β细胞的受损，细胞中SIRT1，4表达都是下降的[7]。

但是当T2DM发生时，外周血白细胞（WBC）中SIRT1，4如何变化，是否与β细胞中SIRT1,4的表达情况一致，还没有文献报道。

本实验着重于研究SIRT1,4在β细胞和WBC中表达是否具有对应性，WBC中SIRT1,4表达是否可以反映β细胞的功能，探讨WBC中SIRT1，4表达变化与T2DM的关系。

我们进一步收集了T2DM组和NC组的一般资料和实验室生化资料，分析两组血糖、血脂及一般临床资料的差异，以及WBC中SIRT1，4的表达与血糖/血脂的相关性。

材料和方法

1研究对象

1.1正常健康对照组（NC组）　共52例，其中男性32例,女性20例,年龄39-68岁[（49.58±8.67）岁],均为2010年3月-2010年10月汕头大学医学院第一附属医院门诊体检健康人群，排除冠心病、脑血管病、四肢血管病变、肾脏病、糖尿病等内分泌疾病以及其它严重内脏疾病。

1.22型糖尿病组（T2DM组）共113例，其中男性57例，女性56例，年龄40-75岁[（62.01±10.28）岁]，均为2010年3月-2010年10月汕头大学医学院第一附属医院内分泌科住院患者，入选标准为符合1999年WHO糖尿病诊断标准。

2研究方法

2.1我们对52例来自大学医院的门诊健康人（正常对照组，NC组）与113例住院T2DM患者进行了临床一般资料收集和实验室生化检查，分析了T2DM组和NC组血糖、血脂、肝肾功能及一般临床资料的差异。

2.2外周血白细胞分离方法：

取3ml新鲜外周抗凝血，离心弃上清。

加入6-10倍细胞体积的红细胞裂解液（KHCO31.0g，NH4Cl8.3g，EDTA-Na0.037g，加水至1000ml），轻轻吹打混匀，裂解4-5min，离心弃上清。

洗涤1-2次：

加入适量PBS，重悬沉淀，800-1000rpm离心弃上清。

即可得到白细胞沉淀，用于提取总RNA，进行后续的RT-PCR实验。

2.3用免疫细胞化学染色检测sirt1,4在外周血白细胞中的表达和定位。

简述步骤如下：

取新鲜外周抗凝血涂片，4%多聚甲醛固定20min，0.5%TritonX-100作用20min，0.3%H2O2室温孵育10min，2%BSA室温孵育30min，滴加一抗（SIRT1/SIRT4多克隆抗体，SantaCruzBiotechnology公司，浓度1：

100）4℃过夜，滴加二抗（生物素连接的抗兔或羊IgG抗体，JacksonImmunoResearch公司，浓度1：

200）室温孵育1h，滴加ABC复合物室温孵育30min，DAB显色，自来水洗净，苏木素复染20s，1%盐酸酒精分化数秒，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。

镜检，胞核、胞膜或者胞浆中棕褐色反应产物代表SIRT1,SIRT4蛋白的定位。

2.4用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测Sirt1，4在外周血白细胞中mRNA的相对表达水平，从基因水平比较T2DM组和NC组SIRT1，4表达的不同。

RT-PCR简要步骤如下：

提取WBC的总RNA（RNAsimpleTotalRNAkit总RNA提取试剂盒离心柱型，TIANGEN公司），合成cDNA（EasyScriptFirst-StandcDNASynthesisSuperMix试剂盒，TransGenBiotech公司），进行PCR反应（2×EasyTaqPCRSuperMix试剂盒，TransGenBiotech公司），最终将PCR产物进行脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像系统拍照，Quanlity-one软件分析计算条带灰度值。

引物序列：

SIRT1F:

GCAACATCTTATGATTGGCACA；SIRT1R:

AAATACCATCCCTTGACCTGAA。

SIRT4F:

ACCCTGAGAAGGTCAAAGAGTTAC；SIRT4R:

TTCCCCACAATCCAAGCAC（上海基康公司）。

PCR循环：

94℃，3min；循环35次（94℃，30s；53℃，30s；72℃，1min）；72℃，10min。

3统计学处理

采用SPSS15.0统计软件进行。

计量资料数据以均数±标准差（

±s）表示。

均数组间比较采用T检验并做正态性检测和方差齐性分析，相关分析采用直线相关分析。

以P<0.05为差异有统计学意义，以P<0.01为有显著性差异。

结果

1一般资料分析

1.1两组人群的实验室检查资料分析（表1-1）

根据实验室资料，NC组的空腹血糖（FPG）在4.84-6.50mmol/L,T2DM组FPG在7.02-13.27mmol/L，符合NC组与T2DM组的筛选要求。

统计学结果显示，T2DM组FPG、甘油三酯（TG）、脂蛋白a（LPa）显著高于NC组（P<0.01）,T2DM组与NC组间总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDLc）、低密度脂蛋白（LDLc）无显著性差异（P>0.05）。

T2DM组与NC组间肝功能（AST、ALT、GGT）、肾功能（BUN、Cr、UA）没有显著性差异（P>0.05）。

T2DM组WBC数（7.52±1.69）*109/L显著高于NC组WBC数（6.58±1.47）*109/L（P<0.01）。

1.2两组人群的一般临床资料分析（表1-2）

T2DM组体重指数（BMI）、收缩压、舒张压显著高于NC组（P＜0.01），而T2DM组与NC组间性别构成无明显差异（P>0.05）。

2免疫细胞化学染色（图1-1）

胞核、胞膜或者胞浆中棕褐色反应产物代表SIRT1或SIRT4蛋白表达阳性。

结果显示SIRT1在粒细胞、单核细胞的细胞核和细胞浆中表达，而SIRT4主要在两种细胞的胞浆中表达，但两者在淋巴细胞中表达均不明显。

3RT-PCR结果（图1-2）

T2DM组sirt1，4mRNA水平显著低于NC组（P<0.01）。

4SIRT1,4与血糖、血脂的相关性分析（表1-3）

SIRT1,4与空腹血糖（FPG）的相关性分析结果显示，SIRT1，4与空腹血糖（FPG）之间均存在显著负相关（P<0.05），相关系数分别为-0.161和-0.156。

SIRT4与TG、LPa之间呈显著性负相关（P<0.05），与HDL之间呈显著性正相关（P<0.05）。

讨论

免疫细胞化学染色结果显示，SIRT1不仅蛋白在肝、脑、肾、脂肪、肌肉组织中表达[8]，SIRT4蛋白不仅在胰腺的胰岛中表达[9]，而且两者在外周血白细胞（粒细胞、单核细胞）中也有表达。

既往很多研究证实了SIRT1，4参与糖稳态、能量代谢调节[11]，本实验RT-PCR结果表明，T2DM组SIRT1，4mRNA水平显著低于NC组，这与之前的动物研究也是一致的[7]。

而且相关性分析结果证实了外周血白细胞（WBC）中SIRT1,4表达与T2DM及其血糖、血脂是相关的。

SIRT1具有组蛋白脱乙酰基作用，作为一种多功能转录调节因子，与细胞的存活和代谢过程及增殖、衰老和凋亡等生命活动密切相关，广泛参与调控哺乳动物细胞寿命的多条信号通路及糖脂代谢、胰岛素分泌等多条代谢通路，调节机体能量代谢的平衡，保持机体糖脂代谢的稳态。

而T2DM是一种糖脂代谢紊乱性疾病，故SIRT1和T2DM之间极有可能存在密切的联系。

研究发现，啮齿类动物在禁食或者是CR的情况下，其肝脏、胰腺、肌肉、大脑、以及脂肪组织中的SIRT1表达是增高的[17]。

还有动物实验研究表明，在高糖或者高脂的胰岛素抵抗大鼠模型中，胰腺SIRT1表达量减少[2]。

这与本实验研究结果较为一致，表明胰岛β细胞和WBC中SIRT1的表达变化是一致的。

SIRT4缺乏脱乙酰基活性，与其他SIRT家族成员不同，它有很强的ADP-核糖基转移酶活动，可以转移NAD+的二磷酸腺苷核糖（ADPR）残基给它的蛋白底物[9]。

已经发现，它可以通过抑制谷氨酸脱氢酶（GDH）的活动从而调节胰岛素分泌[6]。

而在SIRT4敲除或者CR的小鼠中，GDH被激活，并上调了氨基酸刺激下β细胞的胰岛素分泌[10]。

根据以上实验研究，Haigis假设SIRT4也许在胰腺β细胞中起着与能量限制相反的作用[10]，也就是在高糖情况下，SIRT4水平被上调。

但是之前的动物研究发现，在胰岛素抵抗的大鼠模型中，SIRT4表达量是降低的[7]，与本实验发现SIRT4在T2DM组表达比NC组明显降低的结果是一致的。

故SIRT4极有可能与T2DM相关，SIRT4的缺失很可能会加速T2DM的发生[18]。

但是SIRT4在WBC和β细胞中表达是否一致，外周血SIRT4的检测能否反映胰岛β细胞的功能，还需要进一步的探索与研究。

T2DM也被认为是一种全身性慢性炎症疾病，它不仅有胰岛β细胞功能的下降，使β细胞胰岛素分泌量降低，血糖升高，同时白细胞是一种炎症细胞，T2DM的发生可能也会伴随着白细胞中糖代谢的失衡，使其功能下降，进而影响白细胞中SIRT1,4的表达，故胰岛β细胞和白细胞SIRT1表达的一致性也说明了二者具有对应性。

本研究发现T2DM组与NC组相比，白细胞有显著的增高，说明了炎症细胞白细胞的增殖、衰老和凋亡与全身性慢性炎症疾病T2DM很可能有关联，白细胞SIRT1,4的表达也很可能受到白细胞的增殖、衰老和凋亡的影响，与T2DM的发生发展产生关系，但还需要进一步的研究证实。

胰岛β细胞的功能在临床不能直接被检测，故可以采用白细胞中SIRT1,4的联合检测间接反映胰岛β细胞的功能，而且这还需要进一步的研究和证实。

同时，T2DM组与NC组SIRT1,4表达有显著差异，也暗示了SIRT1,4与T2DM的相关性。

结论

SIRT1,4在WBC中有表达，WBC中SIRT1，4表达也许可以间接反映胰岛β细胞功能，并且与T2DM之间可能存在关系。

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