分子生物学笔记完全版.docx

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分子生物学笔记完全版

分子生物学笔记

第一章基因的结构

第一节基因和基因组

一、基因（gene）是合成一种功能蛋白或RNA分子所必须的全部DNA序列．

一个典型的真核基因包括

①编码序列—外显子（exon）②插入外显子之间的非编码序列—内合子（intron）③5'-端和3'-端非翻译区（UTR）④调控序列（可位于上述三种序列中）绝大多数真核基因是断裂基因（split-gene），外显子不连续。

二、基因组（genome）一特定生物体的整套（单倍体）遗传物质的总和，基因组的大小用全部DNA的碱基对总数表示。

人基因组3X109（30亿bp），共编码约10万个基因。

每种真核生物的单倍体基因组中的全部DNA量称为C值，与进化的复杂性并不一致（C-valueParadox）。

人类基因组计划（humangenomeproject,HGP）

基因组学（genomics）,结构基因组学（structuralgenomics）和功能基因组学（functionalgenomics）。

蛋白质组（proteome）和蛋白质组学（proteomics）

第二节真核生物基因组

一、真核生物基因组的特点：

，

①真核基因组DNA在细胞核内处于以核小体为基本单位的染色体结构中．

②真核基因组中，编码序列只占整个基因组的很小部分（2—3％），

三、基因家族（genefamily）一组功能相似且核苷酸序列具有同源性的基因．可能由某一共同祖先基因（ancestralgene）经重复（duplication）和突变产生。

基因家族的特点：

①基因家族的成员可以串联排列在一起，形成基因簇（genecluster）或串联重复基因（tandemlyrepeatedgenes），如rRNA、tRNA和组蛋白的基因；②有些基因家族的成员也可位于不同的染色体上，如珠蛋白基因；③有些成员不产生有功能的基因产物，这种基因称为假基因（Pseudogene）．Ψa1表示与a1相似的假基因．

四、超基因家族（Supergenefamily，Superfamily）由基因家族和单基因组成的大基因家族，结构上有程度不等的同源性，但功能不同．

第四节细菌和病毒基因组

一、细菌基因组的特点。

1．功能相关的几个结构基因往往串联在—起，受它们上游的共同调控区控制，形成操纵子结构，

2．结构基因中没有内含子，也无重叠现象。

3．细菌DNA大部分为编码序列。

二、病毒基因组的特点

1．每种病毒只有一种核酸，或者DNA，或者RNA；

2．病毒核酸大小差别很大，3X103一3X106bp；

3．除逆病毒外，所有病毒基因都是单拷贝的。

4．大部份病毒核酸是由一条双链或单链分子（RNA或DNA），仅少数RNA病毒由几个核酸片段组成．

5．真核病毒基因有内含子，而噬菌体（感染细菌的病毒）基因中无内含子．

6．有重叠基因．

第五节染色质和染色体

（二）组蛋白（histone）：

一类小的带有丰富正电荷<富含Lys，Arg）的核蛋白，与DNA有高亲和力．

（二）．端粒（telomere）：

真核生物线状染色体分子末端的DNA区域

端粒DNA的特点：

1、由富含G的简单串联重复序列组成（长达数kb）．

人的端粒DNA重复序列：

TTAGGC。

2、端粒的末端都有一条12-16碱基的单链3’端突出。

端粒的作用：

防止DNA末端降解，保证染色体的稳定性和功能

（三）、复制原点

第二章DNA的复制、修复和重组

第一节DNA的复制（DNAReplication）

一、DNA复制的基本特性

1.半保留性（Semi-Conservative）

2.双向复制（一般）复制起始点（origin）+两侧复制叉=复制单位（复制子,Replicon）

3.半不连续性（Semi-discontinuous）

前导链（leadingstrand）-连续合成，随从链（LaggingStrand）-不连续,由岗崎片段（okazakifragment）连接而成.

二、DNA复制必需的成份（真核生物）

1.染色体DNA复制必需三种核苷酸序列①复制起点②着丝粒③端粒.

2．RNA引物（RNAPrimer）一般8-14nt.带游离3'-OH末端.

3.参加DNA复制的主要酶和蛋白质

①DNA聚合酶（DNAPolymerase）真核DNA复制的主要酶DNAPola/δ.功能:

从5'-3'方向延伸与模板互补的子代链.

②引发酶（Primase）与其他多种蛋白组成多蛋白复合体-引发体（Primosome）.催化RNA引物合成和复制起始.

③DNA连接酶（DNALigase）催化一个双链DNA的5'磷酸与另一双链DNA的3'-OH形成磷酸二酯键.

④DNA解链酶（DNAHelicase）,打开DNA双链.

⑤增殖细胞核抗原（Proliferatingcellnuclearantigen.PCNA）辅助催化前导链合成.

⑥端粒酶（Telomerase）

末端复制问题。

端粒酶负责染色体末端（端粒）复制,是由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白.其中的RNA成分是端粒复制的模板.（因此端粒是逆转录酶）

作用:

维持端粒长度.

端粒酶活性可用基于PCR的“TRAP”（Telomeraserepeatamplificationprotocol）法测定

端粒与细胞寿命。

端粒、端粒酶与肿瘤的关系：

绝大多数恶性肿瘤具有端粒酶活性但端粒缩短，但也有约5%的肿瘤无端粒酶活性且端粒较长。

端粒酶作为新的肿瘤标志和肿瘤治疗靶点.

第二节DNA修复（DNArepair）

DNA修复是维持基因组完整性的重要机制，在保护基因组避免发生可能导致肿瘤或遗传疾病的突变中起关键的作用。

引起DNA损伤的因素：

1、细胞内源性损伤因素：

DNA复制错误；自发损伤包括碱基互变异构、碱基脱氨（C→U、A→I）和碱基丢失等；氧化代谢副产物如活性氧物质（Reactiveoxygenspecies，ROS）的攻击等。

2、环境中的损伤因素：

辐射（含紫外线、X射线）产生胸腺嘧啶二聚体；化学致癌物（氧化脱氨，烷化剂或代谢活化物如苯并芘、黄曲霉素等产生碱基加合物）

一、碱基切除修复（Baseexcisionrepair、BER）

该途径中最关键的是必须通过一种糖苷酶（glycosylase）先除去变异碱基（如被氧化、烷基化或脱氨的碱基），该糖苷酶催化连接损伤碱基与脱氧核糖之间的糖苷键水解，释放游离碱基并在DNA中产生一个去碱基位点，然后由去嘌呤／去嘧啶（AP）核酸内切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶等利用相对的一条正常链为模板进行修补合成。

BER是修复内源性DNA损伤（自发水解、烷基化和活性氧攻击）的主要途径，因此对于降低自发突变的频率、防止肿瘤发生有重要作用。

二、核苷酸切除修复（Nucleotideexcisionrepair，NER）

首先由多聚体复合物识别损伤，再在损伤的两侧进行切除。

随着DNA链被解开，包含损伤的单链片段释放出来，留下的缺口由DNA聚合酶填补，DNA连接酶封闭。

该途径包括20种以上蛋白，可以修复紫外辐射诱导的环丁烷嘧啶二聚体（CPD）和（6—4）光产物（（6—4）PPs），以及一些化学物质产生的大加合物。

NER可再分为二条子途径：

（1）全基因组修复（GlobalGenomicrepair，GGR）途径：

修复整个基因组内的损伤，其效率取决于损伤的化学特性、损伤部位的DNA序列和染色质结构。

（2）转录藕联修复（Trancsription—coupledrepair，TCR，）：

特异地修复基因组中具有转录活性（即表达）的基因的被转录DNA链上的损伤，该途径的特点是依赖RNA聚合酶II催化的转录，其中的一些蛋白是普通转录因子TFIIH的亚基。

三、错配修复（Mismatchrepair）负责修复DNA复制过程中由于错误掺入而产生的错配。

四、重组修复（Recomhinantrepair）修复DNA的两条链均受损伤的部位的双链断裂或链间交连。

第三节重组（recombination）

重组的本质是基因的重排或交换.即2个DNA分子间或一个DNA分子的不同部位间,通过断裂和重接,交换DNA片段从而改变基因的组合和序列.

一.同源重组（Homologousrecombination）

指DNA同源序列间的重组,常发生于两个较长的同源DNA片段或同源染色体之间。

可通过同源重组将外源基因定位整合到细胞基因组中.

二.转座（transposition）可移动的DNA元件（mobileDNAelements）

-转座元件（Transposableelement）.它是指那些可在DNA分子内或DNA分子间转移的DNA片段.

转座元件的转移过程-转座

转座的特点:

1.转座后原来位置的转座元件序列仍然保留,但同时又把新合成的DNA复本插入到另外一个位点.

2.转座过程需要转座酶（transposase）.它催化断裂和重接两步连续的过程（需要M2+）

3.转座元件插入位置的两茶有3-12bp的正向重复序列（靶序列）,它是由于转座酶错位切割DNA造成的.这种短正向重复序列是存在转座元件的特征.

转座元件的分类

①转座子（transposon）:

通过DNA复制而转移的转座元件.

②逆转座子（retroposon）或返座子,通过RNA阶段实现转移的转座元件（DNA→RNA→DNA→插入新位点）

转座的遗传效应-导致基因重排、插入、缺失。

第三章基因表达的调控

基因表达：

DNA→mRNA→蛋白质的遗传信息传递过程

第一节基因的活化

基因的“开关”-染色质的活化

一、活性染色质的结构

二、活性染色质的结构特点

（一）DNaseI敏感性

转录活性（或有潜在转录活性）的染色质对DNaseI更敏感．

（二）组蛋白H3的CyS110上巯基暴露，

三、活性染色质结构的形成

（二）、组蛋白修饰。

（三）HMG蛋白结合

HMG（highmobilitygroup）蛋白—高迁移率蛋白,如HMG14/HMG17.

与核小体核心颗粒结合，有利转录。

四、DNA甲基化与基因表达．

（一）、真核生物基因组DNA的甲基化（Methylation）

（二）DNA甲基化的转录抑制作用。

持家基因（housekeepinggene）：

是指对所有类型组织细胞在任何时候都需要其表达的基因，通常都是维持细胞基本生存所必须的基因，其表达常保持在固定的水平。

又称为组成性基因（Constitutivegene）。

（三）甲基化与基因组印迹

基因组印迹（genomicimprinting）：

指基因表达活性只局限于来自双亲之一的基因版本。

被印迹（imprinted）的基因．

第二节转录水平的调控

一、真核基因转录基本条件：

特异性基因转录的基本条件包括：

①启动子（特别是核心启动子）

②转录模板（转录起始点（+1）---终止点）

③RNAPolⅡ

④普通转录因子（GTFs）

（一）启动子（promoter）

与基因转录启动有关的一组DNA序列，一般位于RNApoII转录起始点上游100-200bp以内，其功能是决定转录的起始点和调控转录频率．

启动子区域包括核心启动子和启动子上游近侧序列：

1、核心启动子（corepromoter）

是决定转录起始位置的关键序列，也是普通转录因子TFⅡD的结合位点，

①TATA盒（TATAbox）位于转录起始点上游-25～-30bp．

②起始子（initiator，Inr）Inr是与转录起始位点重叠的短的较保守序列．

注：

①不是所有基因都含有TATA盒或Inr序列．有的只有其中之一，有的两者都无．

②这些核心启动子的序列和它们之间的间隔多变

2、上游启动子元件（UpstreamPromoterelement，UPE）

位于较上游（-30一-110bp），能较强影响转录起始的频率，如CAAT盒和GC盒．其中GC盒是转录因子SPl的结合位点。

（二）RNA聚合酶Ⅱ

负责真核生物蛋白编码基因的转录（产物mRNA），有7-10个亚基，最大亚基的羧基末端结构域（CTD）具有7个氨基酸（Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Set）的重复序列，其中有多个磷酸化位点．CTD磷酸化对调控基因转录有重要作用．

（三）基础转录因子（basaltranscriptionfactor）

真核基因转录除RNA聚合酶外还需要许多蛋白因子—转录因子参加，其中一些转录因子是RNA聚合酶Ⅱ转录起始必需的，并且可以维持基础水平的转录，因此称为基础转录因子或普通转录因子（generaltranscriptionfactor）

1．RNA聚合酶II的普通转录因子（TFII）

包括TFIID,TFⅡB,TFIIF，TFIIE，TFIIH，TFIIA等．

TFIID是由TATA盒结合蛋白（TATAbindingprotein，TBP）和8种TBP协同因子（TBPassociatedfactor，TAF）组成的复合物，TFIID可识别和结合核心启动子（TATA盒和Inr）；

TFⅡB的C端与TFIID和DNA的复合物结合，N-端与TFⅡF协同作用募集RNA聚合酶II，再加上TFIIE,TFIIH形成完整的转录复合物．

TFIIH有蛋白激酶活性，可使RNAPol最大亚基CTD磷酸化，使转录起始过渡到转录延伸．

TFIIA有助于TFIID与TATA盒核心启动子结合．

2、TAF的作用

TFIID中包括至少8种TBP协同因子,分子量为30—250kD,分别命名为TAFⅡ-30～250．

TAFⅡ150识别起始子（1nr）序列．

TAF是基因转录调控的辅助因子，它的作用是通过与多种转录调控因子（激活物或阻遏物）的转录调控结构域结合，而介导转录激活或抑制。

二、基因转录的顺式调控元件

顺式调控元件（cis-regulatingelement）是指对基因表达有调控活性的DNA序列，其活性只影响与其自身同处于一个DNA分子上的基因．

（二）增强子（enhancer）

能显著提高基因转录效率的一类顺式调控元件（其核心序列常为8-12bp）．

增强子的作用特点：

1．能（通过启动子）提高同一条链上的靶基因转录速率；

2．增强子对同源基因或异源基因同样有效；

3．增强子的位置可在基因5’-上游、基因内或3’下游序列中；

4．自身没有5’-或3’-方向性；

5．增强子可远离转录起始点（最多30Kb）；

6．增强子一般具有组织或细胞特异性．

（三）负调控元件—沉寂子

负调控元件是能抑制基因表达的序列．如沉寂子（silencer）

（四）其它顺式调控元件

1．应答元件（responsiveelements）

真核细胞中对某些特定的环境作出应答的基因，常具有相同的顺式元件—应答元件．

应答元件能被在一些特定情况下表达的调控因子识别（又称为可诱导的顺式调控元件／反式作用因子）。

2．转座元件对基因表达的调控，。

三、基因转录的反式作用因子

转录水平的调控主要是通过与多种DNA元件结合的蛋白因子来实现．

反式作用因子（trans-actingfactor）是通过识别和结合顺式调控元件的核心序列而调控靶基因转录效率的一组蛋白质．

反式作用因子对基因表达的调控可正（激话）可负（阻遏）．

第三节转录后加工

在细胞核内对基因产物（mRNA前体）进行各种修饰、剪接和编辑，使编码蛋白质的外显子部分连接成为一个连续的开放读框（openreadingframe，ORF）的过程称为转录后加工．

一、mRNA前体加工的分子机制-

核内mRNA前体—异质性核RNA（heterogeneousnuclearRNA，hnRNA），

hnRNA与蛋白质结合形成核异质性核糖核蛋白（hnRNP）,mRNA前体的加工在hnRNP上进行．

选择性剪接（alternativesplicing）：

在mRNA前体的剪接过程中，参加剪接的外显子可以不按其线性次序剪接，内含子也可以不被切除而保留，即一个外显子或内含子是否出现在成熟mRNA中是可以选择的，这种剪接方式称为选择性剪接。

此外，不同的启动子或不同的poly（A）加尾位点的选择，也可看作选择性剪接．

选择性剪接的主要方式。

由来自一个基因的mRNA前体因选择性剪接而产生多种mRNA，并翻译出的不同蛋白质，称为同源异构体（isoform）．

>5%的人基因可在不同的组织或生理状态下，通过选择性剪接产生不同的蛋白质异构体，这是造成真接生物高度异质性的基础。

第四节翻译水平调控

四、翻译后修饰

1、氨基酸侧链的共价修饰：

乙酰化、磷酸化、糖基化（N-、O-）；

2、蛋白质前体的切割和成熟。

Proprotein→protein.例：

胰岛素的成熟。

五、蛋白质的分泌和胞内定位

信号肽：

作为蛋白质定位信号的短肽序列，指导蛋白质运输到正确位置，定位结束后通常被特异的信号肽酶切除。

第四章原癌基因与抑癌基因

第一节概述

病毒致癌作用，病毒癌基因Viraloncogene，V-onc）.。

细咆癌基因（cellularoncogene，c-onc）或原癌基因（protoncogene）

—正常细胞中与v-onc同源的基因，

抑癌基因（tumorsuppressorgene）：

是指由于其存在和表达而抑制细胞癌变的基因。

原癌基因与抑癌基因生物学性质差异：

1．功能：

抑癌基因在细胞生长中起负调节作用，抑制增殖、促进分化成熟与衰老，或引导多余细胞进入程序性细胞死亡（PCD），原癌基因的作用则相反．

2．遗传方式：

原癌基因是显性的，激活后即参与促进细胞增殖和癌变过程，而抑癌基因为隐性，只有发生纯合失活时才失去抑癌功能．

3．突变的细胞类型：

抑癌基因突变不仅可发生在体细胞中，也可发生在生殖系（germ1ine）细胞中，并通过其遗传突变，而原癌基因只在体细胞中产生突变。

第二节原癌基因

原癌基因是细胞的正常基因，其表达产物对细胞的生理功能极其重要，只有当原癌基因发生结构改变或过度表达时，才有可能导致细胞癌变。

一、原癌基因表达的特点：

l、正常细胞中原癌基因的表达水平一般较低，而且是受生长调节的，其表达主要有三个特点：

①具有分化阶段特异性；②细胞类型特异性；③细胞周期特异性。

2、肿瘤细胞中原癌基因的表达有2个比较普遍和突出的特点：

①一些原癌基因具有高水平的表达或过度表达•

②原癌基因的表达程度和次序发生紊乱，不再具有细胞周期特异性。

3、细胞分化与原癌基因表达．

在分化过程中，与分化有关的原癌基因表达增加，而与细胞增殖有关的原癌基因表达受抑制。

二，原癌基因的结构改变与其表达激活

（一）点突变

（二）染色体易位染色体易位（translocation）：

是染色体的一部分因断裂脱离，并与其它染色体联结的重排过程。

（三）基因扩增即基因拷贝数增加．

（四）LTR插入LTR是逆转录病毒基因组两端的长末端重复，其中含有强启动子序列。

三、原癌基因产物的功能

大多数原癌基因编码的蛋白质都是复杂的细胞信号转导网络中的成份，在信号转导途径中有着重要的作用．

原癌基因产物可作为：

1、生长因子，如sis（PDGF-β），fgf家族（int-2，csf-1等）

2、生长因子受体（质膜）：

具酪氨酸蛋白激酶活性，如neu，ht，met，erbB，trk，fms，ros-1等。

3、非受体酪氨酸蛋白激酶（质膜／胞质）如src家族：

src，syn，fyn，abl，lck，ros，yes，fes，ret等．

4、丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶（胞质）：

如raf，raf-1，mos，pim-1，

5、G蛋白（质膜内侧），具GTP结合作用和GTP酶活性，如ras家族中的H-ras，K-ras，N-ras，以及mel和ral等．，

6．核内DNA结合蛋白（转录因子）如myc家族，fos家族，Jun家族，ets家族，rel，erbA（类固醇激素受体）

第三节抑癌基因

一、抑癌基因失活与杂合性丢失

抑癌基因为隐性癌基因，只有发生纯合失活时才对肿瘤形成起作用，通常的表现为抑癌基因的一个等位基因丢失，面另一个存留的等位基因发生突变（点突变、微缺失，重排等），等位基因丢失常伴有抑癌基因相邻区域的杂合性丢失（Lossofheterozygosity，LOH），

LOS指肿瘤中特定染色体上某种DNA多态性标志（如RFLP，VNTR、STR或SSCP等）的等位基因片段在同一患者中由正常组织基因组中的两种变为一种，即等位基因型由杂合子变为纯合子。

LOH是肿瘤细胞中部分染色体区域缺失的表现。

二、抑癌基因产物的功能

巳知的肿瘤抑制基因及其蛋白产物功能

基因相关癌产物胞内定位作用

p53RbWT-1APCDCCNFlRETVHLP16（MTS-1）WAF／CIPlBRCAl肺癌、乳腺癌等（>51种）视网膜细胞瘤等

wilm’肿瘤结肠癌结肠癌神经纤维瘤甲状腺癌肾癌黑素瘤等（多种）多种乳腺癌、宫颈癌等

核胞质？

粘附分子GTP酶激活剂受体酪氨酸激酶转录延伸因子CDK抑制剂CDK抑制剂转录因子抑癌基因p53

人P53基因定位：

17P13，11个外显子编码393个氨基酸。

p53基因突变：

存在于一半以上的人肿瘤中，多为点突变，主要发生于外显子5-8,如肝癌中的249号密码子第3碱基G→T,与黄曲霉素B1有关。

P53蛋白结构和功能：

P53蛋白为核内转录因子，包括①核心区的DNA结合域；②N端转录激活域；③C端介导寡聚体化的结构域。

1、P53的中央域识别和结合一个10bp的启动子序列，可激活转录（通过N-端的反式激活域）。

P53突变大多发生于中央DNA结合域。

2、P53也可结合DNA损伤时产生的单链区域。

3、P53是四聚体，寡聚化需要C-端域

4、P53激活ckip21,后者抑制细胞周期于G1期.

5、p53激活与负责辐身损伤的修复蛋白GADD45，维持基因组稳定性。

6、P53诱导凋亡的机制尚不清楚。

7、正常情况下p53以低水平存在，半衰期短。

DNA损伤稳定P53并增加其转录活性

8、Mdm2使p53不稳定，易被降解，并能直接抑制其反式激活活性（Mdm2是癌基因）

第五章信号转导

细胞外信号通过与细胞表面的受体相互作用转变为胞内信号并在细胞内传递的过程称为信号转导（signaltransduction）

跨膜信号转导过程包括：

1，胞外信号被质膜上的特异性受体蛋白识别，受体被活化；

2，通过胞内信号转导物（蛋白激酶，第二信使等）的相互作用传递信号；

3，信号导致效应物蛋白的活化，引发细胞应答（如激活核内转录因子，调节基因表达）。

第一节胞内信使

细胞内信使（intracellularmessenger）是具有信息传递作用的一些小分子，也称为第二信使（secondmessengers）。

一、cAMP{环磷酸腺苷），

生成：

腺苷酸环化酶催化ATP生成cAMP;

代谢：

cAMP磷酸二酯酶水解cAMP产生5’-AMP

功能：

，

①激活蛋白激酶A

②抑制蛋白磷酸酯酶

二、cGMP（环磷酸鸟苷）

生成酶：

鸟苷酸环化酶

代谢酶：

cGMP磷酸二酯酶

功能：

①激活蛋白激酶G②调控细胞膜离子通道

三、三磷酸肌醇（i