僵蚕抗凝活性部位中化学成分的初步研究Word文档格式.docx

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各部位的固形物中,15种氨基酸含量在40%～50%,占定氮法测定的蛋白质含量的60%～76%；

多肽类成分的分子量为～kDa。

结论本研究为僵蚕抗凝活性成分的进一步分离纯化提供了实验基础。

　　【关键词】僵蚕　抗凝活性部位　化学成分　凝胶色谱法　高效液相色谱法　氮测定法

　　Abstract：

ObjectiveToexploretheanticoagulatingactivecomponentsinwaterextraction,alcoholsedimentationandfractionseparatedbygelfiltrationchromatographyofBombyxBatryticatus.MethodsAnticoagulatingactivefractionswerepreparedbythemethodsofwaterextraction,70%alcoholsedimentationandgelfiltrationchromatography.Components（suchasporteinsorpolypeptide,aminoacids,oxalicacidammonium）ineachfractionweredeterminedbychemicalreactionindentification,Kjeldahlmethod,conductance,UVandHPLC.ResultsPolypeptide,aminoacidsandoxalicacidammoniumwerethemaincomponentsinanticoagulatingactivefractions,contentofwhichreachedmorethan80%.Thecontentofoxalicacidammoniumdecreasedabout52%processedbyalcoholsedimentation,whilethecontentofpolypeptideandaminoacidsonlydecreasedabout8%.Thecontentofpeptidesandaminoacidsincreasedabout28%purifiedbygelfiltrationchromatographycomparedwiththeoneinwaterextractionandabout39%comparedwiththeoneinalcoholsedimentation.Thecontentofoxalicacidammoniumwasthesameastheoneinalcoholsedimentation,butdecreasedabout1timecomparedwiththeoneinwaterextraction.Thecontentof15kindsofaminoacidswere40%～50%inthesolidsofeachfractions,whichmakedupto60%～76%ofthecontentofproteinsdeterminedbyKjeldahlmethod.Molecularweightrangeofpeptidesis～kDa.ConclusionThisstudyprovidesaexperimentalbasisforfurtherseparationandpurificationofanticoagulatingactivecomponentsfromBombyxBatryticatus.

　　Keywords：

BombyxBatryticatus；

anticoagulatingactivefractions；

chemicalcomponents；

gelfiltrationchromatography；

HPLC；

Kjeldahlmethod

　　　僵蚕为蚕蛾科昆虫家蚕Bombyxmori～5龄的幼虫感染（或人工接种）白僵菌而致死的干燥体,为传统中药,性味咸、辛、平,归肝、肺、胃经[1]。

具熄风止痉、活血通络、化痰散结等功效,可用于治疗急性惊风、癫痫、中风、面瘫及顽固性头痛等。

僵蚕含有蛋白质、脂肪酸、氨基酸、草酸铵、白僵菌素以及微量元素等成分[2-4],其水提液在体内外实验中均表现出很强的抗凝、抗血栓、促纤溶及抗内毒素所致红细胞膜损伤等作用[5-7],草酸铵和蛋白质（或多肽）、氨基酸等可能为其主要活性成分[8]。

为进一步研究僵蚕的抗凝活性成分,本实验探讨了僵蚕水煎煮液的醇沉液和凝胶色谱分离净化,及其抗凝活性成分中氨基酸和草酸铵等的定性定量分析,现报道如下。

　　1实验材料

　　Waters515HPLC系统（Waters公司）；

BS100A自动部分收集系统（上海市沪西仪器厂）；

Start-4半自动四通道血凝仪（法国STAGO公司）；

4300-Pro紫外分光光度计（瑞士安玛西亚公司）；

HR2838型匀浆机（菲力普公司）；

LP115pH计（METTERTOLEDO公司）；

DDS-ⅡA电导率仪（上海理达仪器厂）；

移液枪（mL和mL,日本）；

半微量凯氏定氮装置；

Z-16和Z-26层析柱（上海化学仪器厂）。

制僵蚕（购自湖南振兴中药饮片有限公司）；

葡聚糖凝胶（Biotech公司）；

凝血酶试剂（上海太阳生物技术公司,批号N25006）；

兔血浆（自制）；

15种氨基酸对照品（Sigma公司）；

水为超纯水；

甲醇（色谱纯）、三氟乙酸（THF）、2-巯基乙醇、邻苯二甲醛（OPA）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）等化学试剂均为分析纯。

　　2方法与结果

　　样品溶液的制备

　　称取制僵蚕1500g（样品A）,用8倍量水浸泡过夜,以3000r/min匀浆,然后煎煮2次,每次30min,过滤,合并滤液,离心,得提取液8450mL（样品B）,将其浓缩至含原药材2g/mL,加无水乙醇浓度至60%,4℃放置过夜,3000r/min离心,取上清液水浴浓缩至含原药材约6g/mL,即得粗提液240mL（样品C）。

将30mL该液加到用mol/LNaCl的mol/LTris-HCl（pH）缓冲液平衡的SephadexG-25凝胶柱（φcm×

80cm）上,用相同缓冲液洗脱,自动分步收集器收集,mL/（10min·

管）,每2～3管按文献方法[8]测定凝血酶时间（TT,s）、紫外吸收光谱,用重量法测定质量百分浓度（m/v）、电导率仪测定溶液电导率,得洗脱曲线（见图1）。

将TT在40～100s之间的组分合并得洗脱液69mL（样品D）,TT≥100s的组分合并得洗脱液mL（样品E）,E即为抗凝活性部位。

　　图1表明,紫外吸收光谱法（UV）检测的最强色谱峰的前半部分为具有抗凝活性的部位,与UV法测得的G-25凝胶色谱峰值不重合,而按质量百分浓度（M/V）和电导率法测得的色谱峰值与抗凝活性峰值基本重合。

　　抗凝活性部位的化学成分理化鉴别

　　茚三酮反应、pH值、电导率、AgNO3/HNO3反应和CaCl2/HNO3反应分别取B～E样品溶液进行理化测定,结果表明,僵蚕提取分离后的B～E样品所检测的理化性质结果一致,提示所含主要成分基本相同。

茚三酮反应阳性,活性部分电导很大,与AgNO3产生白色沉淀,滴加HNO3后沉淀部分溶解,与CaCl2产生沉淀,滴加HNO3沉淀溶解。

提示抗凝活性成分可能是盐类（如氯化物、草酸盐等）、蛋白质、肽类或其它含氨基酸的化合物。

　　紫外吸收光谱

　　取各样品稀释适当后在200～400nm扫描,其紫外吸收光谱见图2。

　　图2表明,样品B～E的UV光谱形状均不相同,表明提取分离所得样品化学成分有所不同。

提取分离后除去了大量的无活性物质,特别是经过凝胶色谱纯化后,UV光谱变化较大。

　　样品E的凝胶色谱分析及其分子量分析

　　取样品E中TT≥600s的馏分2mL上SephadexG-15（φcm×

50cm）柱,用水洗脱盐,mL/（10min·

管）,自动分步收集器收集,测定各管的TT值、260nm和280nm处的吸光度及化学反应特性,结果见表1。

表1TT≥600s馏分的凝胶柱脱盐中馏分的抗凝活性和理化特性检

测结果注：

*必要时,通过稀释馏分,测定吸光度在～之间,计算而得

　　定量分析

　　固形物含量测定

　　精密吸取样品B～E各mL,80℃下烘至近干,100℃下烘至恒重,精密称定,按每1mL样品溶液扣除mg的Tris和NaCl重量,得固形物重量和浓度（各样品均为n＝3,RSD不超过%）,结果见表2。

表2僵蚕各部位中的固形物和蛋白质测定结果注：

*与样品A比

　　指标检测

　　蛋白质：

按《中华人民共和国药典》中半微量氮测定法操作,计算总氮含量。

将该氮含量扣除铵态氮含量,再与相乘,即为蛋白质质量和百分浓度（W/V）。

各样品均为n＝3,RSD不超过%。

铵根[9]：

按《中华人民共和国药典》中半微量氮测定法操作（40%NaOH试液用120g/L氧化镁悬浊液代替）,计算铵根质量和百分浓度（W/V）。

草酸根[3]：

精密取B～E样品液约5mL,氯化钙沉淀-高锰酸钾滴定法测定（各样品均为n＝3,RSD不超过%）。

结果见表3、表4。

表3僵蚕各部位中铵根和草酸根的测定结果注：

*与样品B比表4僵蚕各部位固形物中蛋白质和草酸铵含量比较

　　HPLC法测定氨基酸含量

　　色谱条件

　　色谱柱：

AgilentODS（mm×

200mm,5μm）；

流动相A为50mmol/LNaAc（pH）-甲醇-THF（82∶17∶1）,流动相B为50mmol/LNaAc（pH）-甲醇-THF（22∶77∶1）,梯度洗脱；

柱温：

27℃；

流速：

mL/min；

荧光检测器：

λex338nm,λem425nm。

样品测定样品溶液B～E经mol/L盐酸液,在110℃水解24h,OPA试剂衍生化,然后取20μL注入液相色谱仪。

测定结果见表5。

表5僵蚕各部位中氨基酸的测定结果（略）

　　　　3讨论

　　本研究表明,僵蚕的水煎煮提取、醇沉和凝胶色谱分离所得抗凝活性部位中,多肽、氨基酸类和草酸铵都是其中的主要成分。

已有报道,草酸铵具有抗凝活性[8],本研究表明,凝胶色谱分离部位中不含草酸铵,但含多肽和氨基酸类成分的馏分具有抗凝活性,因此,僵蚕中的多肽类或氨基酸类成分可能是抗凝活性成分之一。

本研究对僵蚕抗凝活性部位的化学成分和理化特性进行的初步探索,也为今后对僵蚕抗凝成分的分离纯化提供了实验基础。