第四章 培养基Word格式文档下载.docx
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糖类
v葡萄糖：
葡萄糖、淀粉水解液
v蔗糖：
甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜、粗红糖、精白糖、
v乳糖：
纯乳糖、乳清粉
v淀粉：
大麦、大米、燕麦粉、黑麦粉、玉米、野生植物、薯类等
还有脂肪、有机酸和醇、烃类化合物、食品工厂的下脚料等。
糖蜜
糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。
糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%～75%。
一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜。
除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。
例：
谷氨酸发酵
有害物质：
胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶）、生物素（发酵控制）
预处理：
澄清→脱钙→脱除生物素
柠檬酸发酵
铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）
→黄血盐
淀粉
用于抗生素、氨基酸、核苷酸、有机酸、醇、酶制剂等发酵生产
v优点：
来源广泛、价格低，可解除葡萄糖效应。
v缺点：
难利用。
微生物必须能分泌水解淀粉的酶类，发酵液比较稠、一般>
2.0%时加入一定的α-淀粉酶
脂肪
霉菌和放线菌可以用脂肪作为碳源。
发酵过程中加油脂主要是用于消沫和补充碳源。
利用油脂作碳源需要大量的氧，供氧不充分易产生过量有机酸而降低pH值，且油脂贮藏过程易酸败。
有机酸、醇
• 主要在单细胞蛋白、氨基酸、维生素和某些抗生素的发酵生产中作为碳源。
• 甘油是最常用的补充碳源，常用于抗生素和甾体转化的发酵中，而山梨醇是生物Vc的重要中间体。
碳氢化合物（各种烃类）
多为各种石油产品，已在单细胞蛋白、氨基酸、核甘酸、有机酸、维生素、酶类、糖类、某些抗生素发酵中应用。
最常用效果最好是正十六烷。
裂烃棒状菌RT的抗青霉素突变株用正十六烷生产谷氨酸，可达每升84g/L。
用正十六烷和正十四烷生产α-酮戊二酸、柠檬酸、VB12等。
常用的烃有甲烷、乙烷、丁烷、C12-C20等各种烷烃。
二、氮源
是指构成微生物细胞和代谢产物中的氮素的营养物质。
其主要功能是构成微生物菌体的细胞物质（如氨基酸、蛋白质、核算等）和含氮的代谢产物。
主要分为有机氮源和无机氮源。
1.有机氮源：
v蛋白胨：
多由动物组织或植物水解制备
v黄豆饼粉：
全脂、低脂、脱脂三类
v棉籽饼粉：
低温提取油脂、高温提取油脂，青霉素生产等
v玉米浆：
玉米淀粉生产的副产物，干玉米浆和液态玉米浆，含可溶性蛋白、生长因子（生物素），硫、磷、微量元素等
v酵母粉：
含蛋白质，氨基酸、维生素等，来自啤酒酵母和面包酵母
v尿素：
相对单一，流加时温度不宜过高，否则游离氨过多，使pH升高，一般在培养基冷却后加入。
含有丰富的蛋白质、肽类、游离的氨基酸
含有少量的糖类、脂肪、无机盐和生长因子等。
成分复杂：
除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。
例玉米浆：
①可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸
②较多的乳酸
③硫、磷、微量元素等
有机氮源成分复杂可以从多个方面对发酵过程进行影响，而另一方面有机氮源的来源具有不稳定性。
所以在有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑原料的波动对发酵的影响，经常需要摇瓶小试。
2.无机氮源
铵盐、硫酸铵、硝酸盐和氨水：
成分单一，质量较稳定
铵盐中的氮与细胞中的有机氮化合物中的氮处于相同的氧化水平，可被菌体直接吸收利用。
硝酸盐中的氮原子必先还原成氨后，才能被菌体吸收利用。
特点：
微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。
但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化如：
（书本P69）
所以选择合适的无机氮源有两层意义：
❑满足菌体生长
❑稳定和调节发酵过程中的pH
三、无机盐和微量元素
磷、硫、铁、镁、钙、锌、钴、钾、钠、锰、氯等，低浓度时常呈刺激作用，而高浓度时常表现抑制作用。
无机盐类是微生物生命活动所不可缺少的物质。
主要功用是：
v①构成菌体成分；
v②作为酶活性基团的组成部分或维持酶的活性；
v③调节渗透压、pH值、氧化还原电位等；
磷：
是构成菌体核酸、核蛋白等细胞质的组成成分，是许多辅酶和高能磷酸键的成分，又是氧化磷酸化反应的必需元素。
硫：
含硫氨基酸（胱氨酸，半胱氨酸，蛋氨酸等）的组成部分，辅酶的活性基。
钠、钾、钙：
可维持细胞渗透压，可调节细胞透性，一些酶的激活剂。
镁：
激活一些酶活性。
铁：
是菌体的细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化物酶的组成元素。
过量可降低抗生素的产量。
（青霉素发酵）
锌：
是链霉素发酵的必需元素，微量的锌能促进链霉素、青霉素的发酵。
钴：
是VB12组成元素之一，适量可提高产量。
注意事项
A.对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和微量元素在发酵过程中必须加以考虑
铁离子：
青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20μg/ml，发酵罐必须进行表面处理
B、使用时注意盐的形式（pH的变化）
黑曲酶NRRL-330,生产α-淀粉酶，P对酶活的影响
pH酶活
不加4.25120分钟
加K2HPO45.4530分钟
加KH2PO44.6275分钟
四、生长因子
从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。
如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子,生长因子对发酵的调控起到重要的作用。
有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子
五、前体
指某些化合物加入到发酵培养基中，能被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，其自身结构并无多大变化，但产物产量却因前体的加入有较大提高。
用法：
前体使用时普遍采用流加的方法
v前体能明显提高产品的产量，在一定条件下还能控制菌体合成代谢产物的流向。
但浓度过高，则对菌体的生长有毒副作用。
v前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化。
v流加也有利于提高前体的转化率
六、水
v水是良好的溶剂，菌体所需要的营养物质都是溶解于水中被吸收的。
v渗透、分泌、排泄等作用都是以水为媒介的；
v水直接参与代谢作用中的许多反应。
所以，水在生物化学反应中占有极为重要的地位。
v水的比热高，能有效地吸收代谢过程中所放出的热，使细胞内温度不致骤然上升。
v水是热的良导体，有利于放热，可调节细胞的温度。
水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。
七、消沫剂
工业发酵中常用一些消沫剂消除发酵中产生的泡沫，保证生产的正常运行。
常用的消沫剂有植物油脂、动物油脂和一些化学合成的高分子化合物。
八、产物促进剂
所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。
促进剂提高产量的机制：
Ø
有些促进剂本身是酶的诱导物；
有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，
也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；
有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。
第三节 培养基的种类与选择
一、培养基的种类
按组成成分：
复合培养基、合成培养基
按状态：
固体培养基、半固体培养基、液体培养基
按用途：
选择性培养基、鉴别培养基、富集培养基、原生质体再生培养基、抗生素生物效价检测用的生物检测培养基等。
按生产目的和过程分为：
孢子培养基、种子培养基和发酵培养基
（一）孢子培养基
用途：
供制备孢子用。
要求：
能使孢子迅速发芽和生长，能形成大量的优质孢子，但不能引起菌种变异。
注意事项：
基质浓度（特别是有机氮源）要低些，无机盐浓度要适量。
孢子培养基成分因菌不同而异，常用的有麸皮培养基、大（小）米培养基、琼脂斜面培养基等。
（二）种子培养基
供孢子发芽和菌体生长繁殖用。
营养成分是易被菌体吸收利用的，同时要比较丰富与完整，其中氮源和维生素的含量应略高些，但总浓度以略稀薄为宜，以便菌体的生长繁殖。
常用原料：
因菌不同而不同，常用的有葡萄糖、糊精、蛋白胨、玉米浆、酵母粉、硫酸铵、尿素、硫酸镁、磷酸盐等。
种子培养基特点：
v1.必须有较完全和丰富的营养物质，特别需要充足的氮源和生长因子。
v2.种子培养基中各种营养物质的浓度不必太高。
供孢子发芽生长用的种子培养基，可添加一些易被吸收利用的碳源和氮源。
v3.种子培养基成分还应考虑与发酵培养基的主要成分相近。
（三）发酵培养基
供菌体生长繁殖和合成大量代谢产物用的
营养成分和粘度适中，同时考虑各种生化代谢过程，产物合成期pH值等条件不易发生大的变动，也不能影响产物的分离提纯。
发酵培养基是发酵生产中最主要的培养基，它不仅耗用大量的原材料，而且也是决定发酵生产成功与否的重要因素。
设计时应慎重考虑。
设计发酵培养基时需考虑的问题
（1）根据产物合成的特点来设计培养基：
对菌体生长与产物相偶联的发酵类型，充分满足细胞生长繁殖的培养基就能获得最大的产物。
对于生产氨基酸等含氮的化合物时，它的发酵培养基除供给充足的碳源物质外，还应该添加足够的铵盐或尿素等氮素化合物。
（2）发酵培养基的各种营养物质的浓度应尽可能高些，这样在同等或相近的转化率条件下有利于提高单位容积发酵罐的利用率，增加经济效益。
（3）发酵培养基需耗用大量原料，因此，原料来源、原材料的质量以及价格等必须予以重视。
二、培养基的设计
（一）原则：
1.提供必要的营养成分：
培养基成分必须满足细胞生长，代谢活动和合成产物所需的基本要求。
2.充分考虑细胞的元素组成状况。
3.分析组成代谢产物的元素种类和数量，同时分析各种营养物质与代谢、代谢产物合成的内在关系。
4.生长因子的需求情况。
5.注意两大最主要元素比（C/N），量与浓度情况。
6.进行小规模实验，根据菌的情况，进一步修改。
7.pH值的影响
（二）培养基设计的注意事项
1.pH的控制
▪在微生物培养过程中加入酸或碱或流加某些营养物质调节培养基的pH；
▪注意有些营养物质被利用后培养基的pH变化情况.
▪控制pH最常用的方法是在培养基中添加具有一定缓冲能力的物质作为营养物，如以磷酸盐作为磷的成分；
或者避免使用容易产生生理酸性或碱性使培养基pH波动太大的物质。
2.避免产生微生物不能利用的物质或形成沉淀
葡萄糖与铵盐或氨基酸的氨基在灭菌高温下作用形成深褐色物质。
这种物质不被微生物利用。
因此这两类营养物不宜直接配在一起进行灭菌，而应采用分开灭菌后再加入发酵罐内。
硫酸铵中的SO42-与钙盐易形成难溶的硫酸钙，因此二者也不宜直接配成培养基。
3.注意代谢调节物的影响：
有些物质存在于培养基中往往能明显地促进或抑制发酵产物的形成。
例如：
前体物质、诱导剂、阻遏物、抑制剂、金属离子
（三）培养基确定方法
1.做好调查研究工作，了解菌种的来源、生活习惯、生理生化特性和一般的营养要求；
2.根据前人的经验和培养基成分，初步确定可能的培养基成分；
3.通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分；
4.确定各成分最适的浓度，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法。
5.再确定各种重要的金属和非金属离子对发酵的影响，即对各种无机元素的营养要求，试验其最高、最低和最适用量。
6.有些发酵产物，如抗生素等，除了配制培养基以外，还要通过中间补料法，一面对碳及氮的代谢予以适当的控制，一面间歇添加各种养料和前体类物质，引导发酵走向合成产物的途径。
7.根据生产和科学研究的需要选择培养基类型
8.根据经济效益选择培养基原料
第四节 影响培养基质量的因素
一、原材料质量的影响
有机氮源：
加工用的原材料品种、产地、加工方法和储存条件。
（黄豆饼粉、玉米浆、蛋白胨等）
质量控制：
监测各种有机氮源中的蛋白质、磷、脂肪和水分的含量，注意酸价变化；
重视储藏温度和时间
碳源：
淀粉、葡萄糖和乳糖-不同的原料、产地、加工方法
油脂：
原料（豆油、玉米油、米糠油、杂鱼油）以及储藏条件和时间的影响
无机盐和前体物
二、水质的影响
大生产中使用的水有深井水、自来水、地表水和蒸馏水。
含有的无机离子和有机物的含量不同。
措施：
定期检测水质，地表水应经过适当的处理
三、灭菌的影响
工业发酵中常采用饱和蒸汽灭菌方法杀灭培养基中的有机体。
糖类（还原糖）与氨基酸（赖氨酸）、肽类或蛋白质等有机氮源一起加热，会产生化学反应，形成5-甲基糠醛和棕色的类黑精；
糖类还能与磷酸盐产生络合反应，形成棕色色素；
将糖与其他物质分别灭菌
四、其他影响因素
pH值：
改变营养物质的浓度比例，尤其是生理酸碱性物质的用量来调节培养基pH值为主，用酸碱调节为辅。
培养基粘度：
为保证灭菌质量，尽量使培养基液体化
概念
v培养基
v生理酸性物质
v生理碱性物质
v生长因子
v前体
要点
v1.培养基的组成要素
v2.配制工业发酵培养基的一般要求
v3.培养基的种类
v4.培养基设计的原则（了解）
v5.培养基设计的具体方法
v6.影响培养基质量的因素
补充内容：
淀粉水解糖的制备
在工业生产中，将淀粉水解为葡萄糖（glucose）的过程称淀粉的糖化，制得的溶液叫淀粉水解糖。
根据原料淀粉的性质和水解使用的催化剂的不同
酸解法（acidhydrolysisprocess）
水解的方法酶解法（enzymatic hydrolysis process）
酸酶结合法（acid-enzymatichydrolysis）
一、淀粉水解制糖的意义
1.大多数微生物不能直接利用淀粉（所有的氨基酸生产菌不能直接利用）
2.有些微生物能够直接利用淀粉作原料，但必须在微生物产生淀粉酶后才能进行，过程缓慢，发酵周期延长。
3.若直接利用淀粉作原料，灭菌过程的高温会导致淀粉结块，发酵液粘度剧增。
二、淀粉水解糖的制备方法及原理
（一）酸解法（acidhydrolysismethod）
以酸为催化剂，在高温高压下使淀粉水解生成葡萄糖的方法。
1.水解过程：
总反应式：
（C6H10O5）n+nH2OnC6H12O6
过程：
（C6H10O5）n（C6H10O5）xC12H22O11C6H12O6
淀粉糊精麦芽糖葡萄糖
H+对作用点无选择性，-1,4-糖苷键和-1,6-糖苷键均被切断。
2.葡萄糖的复合反应和分解反应
在水解过程中，由于受到酸和热的作用，一部分葡萄糖会发生复合反应和分解反应。
盐酸
葡萄糖
复合反应分解反应
复合二糖5‘－羟甲基糠醛
复合低聚糖有机酸、有色物质
损失葡萄糖量7％<
1％
不利影响：
（1）降低了葡萄糖的收率。
（2）给产物的提取和糖化液的精制带来困难。
复合反应：
生成的多数复合糖不能被微生物利用，使发酵结束时残糖高。
分解反应：
生成的5‘－羟甲基糠醛是产生色素的根源，增加了糖化液精制脱色的困难。
如何控制分解反应和复合反应的发生？
（1）淀粉乳浓度
（2）酸浓度不能过高
（3）温度
3.评价
优点：
工艺简单，水解时间短，生产效率高，设备周转快。
缺点：
（1）副产物多，影响糖液纯度，一般DE值只有90％左右。
（2）对淀粉原料要求严格，不能用粗淀粉，只能用纯度较高的精制淀粉。
DE值：
dextroseequivalentvalue（葡萄糖当量值），表示淀粉糖的含糖量。
还原糖含量（％）
DE值＝100％
干物质含量（％）
（二）酶解法（enzymehydrolysismethod）
用专一性很强的淀粉酶及糖化酶将淀粉水解为葡萄糖的工艺。
分两步：
（1）液化：
用-淀粉酶将淀粉转化为糊精和低聚糖
（2）糖化：
用糖化酶（又称葡萄糖淀粉酶）将糊精
和低聚糖转化为葡萄糖。
所以，淀粉的液化和糖化均在酶作用下进行，又称双酶法
1.液化（liquification）
－淀粉酶水解底物内部的－1,4糖苷键，不能水解－1,6糖苷键，一般采用耐高温淀粉酶，使液化速度加快。
85－90。
液化程度的控制（液化后需糖化的原因）
a.糖液的DE值低（α-淀粉酶不能水解α-1,6糖苷键）
b.液化在较高温度下进行，液化时间加长，淀粉老化，使糖化酶难以利用。
c.糖化酶水解的底物分子要求有一定的大小范围。
根据生产经验，DE值在2030之间为好，液化终点可通过碘液判断，此时呈棕色。
2.糖化（saccharification）
糖化酶从非还原性末端水解-1,4糖苷键和-1,6糖苷键。
终点确定：
DE值达最高时，停止酶反应。
优点：
（1）反应条件温和，不需高温、高压设备。
（2）副反应少，水解糖液纯度高。
（3）对原料要求粗放，可用粗原料并在较高淀粉乳浓度下水解。
（4）糖液颜色浅，质量高。
（1）生产周期长，一般需要48小时。
（2）需要更多的设备，且操作严格。
（三）酸酶结合法
集酸解法和酶解法的优点而采取的生产工艺。
根据原料淀粉性质分：
1.酸酶法：
先将淀粉酸水解成糊精和低聚糖，再用糖化酶将其水解为葡萄糖。
适用：
淀粉颗粒坚硬（如玉米、小麦）的原料，若用-淀粉酶液化，短时间液化，反应往往不彻底。
2.酶酸法：
先用-淀粉酶液化，再用酸水解。
适用：
颗粒大小不一（如碎米淀粉）的淀粉原料，若用酸法，则水解不均匀。
（四）不同糖化工艺的比较
v碳元素总量与氮元素总量之比。
vC/N影响菌体的生长和产物的代谢，还能调节pH。
所以碳源与氮源的应用应有一个合适的比例。
v例如：
黄源胶（XanthanGum发酵）：
前期，较低的C/N，目的是强化菌体的生长和增殖：
但是，在黄源胶的生物合成期，则需要较高的C/N，假如在这一时期，培养基中氮源仍然很高，其导致的发酵结果是，底物消耗了但产物的产率却很低。
v不同菌种，不同时期（生长阶段），甚至不同培养方式，对C/N的要求不同。
v最适C/N还与最适pH有关。
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