实验动物设计模板Word文件下载.docx

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从RSV发现至今,已建立的黑猩猩、猕猴、雪貂、牛、棉鼠、豚鼠和小鼠等感染模型各有优势和局限[6],除灵长类动物可出现临床症状,其他都是无症状隐性感染[7]。

BALB/c小鼠为近交繁殖产生，其对多种病原体具有易感性，利用小鼠建立模型的优点是它易获得,遗传背景清楚而均一,基因改造技术成熟,已有多种商品化试剂,是目前应用最广泛的实验动物。

但小鼠不是RSV自然宿主,我们以往实验发现BALB/c鼠感染RSV没有临床症状,肺内病毒复制水平相对低,病毒滴度下降快,带毒时间短,限制了治疗效果的观察[8]。

裸小鼠采用nu／+雌鼠与nu／nu雄鼠交配方法产生，这种无毛小鼠是由于第11号染色体等位基因突变引起的，裸小鼠主要特征是无毛、裸体和无胸腺，缺乏成熟T细胞的免疫功能，B淋巴细胞正常，成年裸小鼠较普通小鼠有较高水平的NK细胞活性，目前未做过裸小鼠RSV感染模型，对其优势和局限尚不完全清楚。

（三）存在的问题

目前虽然已有许多抗RSV制剂和疫苗的研究,但尚无安全有效的防治方法，RSV感染具体发病机制也不够清楚，其发病机制和抗RSV制剂的研究需要建立理想的动物模型,但目前已建立的系列感染模型均不够满意。

（四）解决问题的思路

复制BALB/c鼠和裸鼠RSV感染模型，不同时间空斑形成实验检测肺组织病毒滴度,计数支气管肺泡灌洗液白细胞总数和分类情况,免疫荧光和免疫组化检测RSV抗原,光镜和电镜检查肺组织病理学改变，比较研究BALB/c小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒（RSV）感染模型的特点。

参考文献：

[1]BlackCP.SystematicReviewoftheBiologyandMedicalManagementof

RespiratorySyncytialVirusInfection[J].RespiratoryCare,2003;

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[3]MeissnerHC,RennelsMB,PickeringLK,etal.Riskofsevererespiratory

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[4]OddywH,deMerkNH,S1yPD,eta1.Theeffectsofrespiratoryinfections,

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virusinfectionmodelinmice[J].JXi’anJiaotongUniversity（Medical

Sciences）,2003;

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329-332.

二、实验设计方案

（一）实验设计目标，拟解决的关键问题

设计目标：

比较研究BALB/c小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒（RSV）感染模型的特点,以建立理想动物模型

拟解决的关键问题：

BALB/c小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒（RSV）感染模型的复制，对试验性RSV感染的模型进行分组与实验结果分析。

（二）实验设计

1、实验动物设计

（1）遗传背景

BALB/c鼠遗传背景：

近交系BALB/c小鼠

裸小鼠遗传背景：

采用nu／+雌鼠与nu／nu雄鼠交配方法产生的同源导入近交系小鼠

（2）微生物质量控制

BALB/c小鼠微生物质量要求：

普通级动物要求。

裸小鼠微生物质量要求：

SPF（无特定病原体）或无菌要求

（3）育种繁殖

BALB/c小鼠育种繁殖：

繁殖方法：

近交繁殖

初始动物的选择：

挑选一对或几对具有育种目标要求的性状的全同胞兄妹

性别鉴定：

1、雄鼠的生殖器距肛门较远

2、雄鼠生殖器与肛门之间长毛

3、雄鼠的生殖器较雌鼠大

4、雌鼠乳头较雄鼠明显

性成熟期：

35-55日龄；

实配年龄：

60日龄左右；

成熟时体重：

20克以上

发情鉴定：

动情期小鼠外阴部肿胀红润，抚摸其身体出现脊柱前凹、抬臀等行为现象

配种：

动情前期交配

交配形式：

采用全同胞兄妹交配形式

妊娠诊断：

摸胎法、阴道涂片法、外形涂片法、直肠检查法

育种代数：

作为亲本的全同胞兄妹（初始动物）记为0代，按雌雄1：

1进行交配，所生后代记为第1代，从中又选留满意的一对或几对全同胞兄妹作亲本，按雌雄1：

1进行交配，以此类推，直到20代以上

个体选择：

选择留繁殖力强，生活力强，特别是目标性状和基因

保种方法：

平行线系统

扩大繁殖生产方法：

交通信号灯方法

裸小鼠育种繁殖:

近交繁殖（同源导入近交）

2、雄鼠的生殖器较雌鼠大

3、雌鼠乳头较雄鼠明显

动情前期交配

采用nu／+雌鼠与nu／nu雄鼠交配方法，雌雄比例为1：

1，有时可采用1：

2或1：

3

摸胎法、阴道涂片法、外形涂片法、直肠检查法（平均每胎所得纯合子仔鼠能占仔数的55．0％，离乳率97％，1—4胎生育恒定，一年存活率达100％，最长生存期可达752d。

）

作为亲本nu／+雌鼠与nu／nu雄鼠记为0代，按雌雄1：

（4）饲养管理

BALB/c小鼠饲养管理:

BALB/c小鼠环境标准：

实验动物饲养室的温度为18-19℃，相对湿度为40%-70%，每小时换气次数为10-20次，噪声在60分贝以下，每立方米空气中氨浓度在14mg以下，工作照度为150-300lx

BALB/c小鼠设施：

开放系统

BALB/c小鼠笼器具：

采用无毒塑料笼具，垫料选用具良好吸湿性、无毒性、无异味、尘埃少的材料如电刨花，垫料须经高压蒸汽灭菌

BALB/c小鼠饲喂：

饲喂小鼠全价营养颗粒饲料，饲料的消毒灭菌应达到相应等级小鼠微生物控制的要求。

饲喂采取“少量勤添”的原则，每周喂料3-4次，饮水应保证连续不断，每周换水2-3次，垫料每周更换1-2次

BALB/c小鼠饲养环境卫生消毒：

做好室内的清洁、消毒、及饲料笼器具的清洗消毒，每次饲养完后，用苯扎溴铵擦拭笼架、地板，每月定期彻底喷雾消毒1次

裸小鼠饲养管理:

裸小鼠环境标准：

实验动物饲养室的温度为18-19℃，相对湿度为40%-70%，每小时换气次数为10-20次，噪声在60分贝以下，每立方米空气中氨浓度在14mg以下，工作照度为150-300lx，空气洁净度为100000级

裸小鼠设施：

屏障系统或隔离系统

裸小鼠笼器具：

采用无毒塑料笼具，垫料选用具良好吸湿性、无毒性、无异味、尘埃少的材料如电刨花，一般所有的笼具、垫料、饲料、饮水等都得经过灭菌消毒

裸小鼠饲喂：

每周饲喂全价营养饲料2—3次。

饲料、饮水、垫料及鼠笼均用双层包布包装高压蒸汽灭菌消毒。

进室前经缓冲室紫外灯照射后去除外层包布，才能进入繁殖室及实验室

裸小鼠饲养环境卫生消毒：

繁殖室设在空气过滤十万级环境中放置层流柜作为裸小鼠繁殖饲养条件。

启用前，先用2％新洁而灭全面擦拭，然后按消毒区域的容积用高锰酸钾15g，In2加福尔马林15mL混和熏蒸。

最后经紫外灯照射，细菌培养阴性才使用。

启用后我们的常规消毒是：

进实验室前后紫外灯照射30rain，每2周用2％新洁而灭擦拭墙壁、天花板，每一个月用过氧乙酸喷射消毒。

每三个月用甲醛和高锰酸甲熏蒸一次（用备用实验室轮流消毒和使用）。

每三个月将层流柜的过滤材料拆下进行清洗。

每年更换一次过滤材料。

饲养人员定期入繁殖室进行饲养管理操作。

进室前需淋浴并用新洁而灭常规泡手、消毒、穿无菌衣、带袜的无菌裤、戴口罩、帽子。

外层穿上手术隔离衣，并带手术胶手套及无菌纱手套。

每次操作完毕，用新洁而灭抹台面及地面。

常规每周换两次笼具，投放34d的饲料与饮水。

每周加两次鸡蛋和瓜子及一次维生素。

2、实验专业设计

选用BALB/c鼠和裸小鼠作为实验动物，感染RSV后不同时间空斑形成实验检测肺组织病毒滴度,计数支气管肺泡灌洗液白细胞总数和分类情况,免疫荧光和免疫组化检测RSV抗原,光镜和电镜检查肺组织病理学改变

3、实验统计设计

结果用均数±

标准差表示,两两组间比较用t检验,各组间比较用方差分析。

α=0.05,P<

0.05认为有显著性差异。

4、实验方法设计

（1）实验技术路线

（2）实验技术方法

1）随机抽样：

选正常成年健康体重相近的BALB/c小鼠30只和裸小鼠30只，分别将30只BALB/c小鼠和30只裸小鼠按体重由小变大编号后，从随机数字表中查取随机数字，依次抄录于小鼠编号下。

具体方法：

两种动物编号为1—30号，30只BALB/c小鼠按照能被3除的规律：

不余到A组，余1到B组，余2到C组；

30只裸小鼠BALB/c小鼠按照能被3除的规律：

不余到D组，余1到E组，余2到F组

2）实验分组：

实验分六组：

A：

对照BALB/c小鼠

B：

感染3天的BALB/c小鼠

C：

感染6天的BALB/c小鼠

D：

对照裸鼠

E：

感染3天的裸鼠

F：

感染6天的裸鼠

3）模型复制

病毒和细胞培养:

Hep-2细胞接种RSV标准A2株病毒,含2%胎牛血清（FBS）DMEM培养至病变达90%~100%,吸取培养液,4℃,3000g离心10min收集上清,-80℃储存备用。

病毒接种:

BALB/c小鼠和无特殊病原菌（specificpathogenfree,SPF）级8～12周龄、雌性裸鼠，腹腔注射戊巴比妥钠0.06mg/g麻醉后,感染组鼻腔缓慢滴入2×

106PFU/mlRSVA2株病毒液50μl,阴性对照组滴入50μl2%FBSDMEM。

4）取材

病毒分离和滴度分析:

感染后不同时间处死小鼠,无菌条件下取左肺、肝脏和

脾脏称重,按10ml/g（wt/vol）加入预冷组织平衡液,匀浆制备肺脏、肝脏和脾脏组织悬液,4℃,2500g离心10min,取上清接种于Hep2细胞,2%FBS1640培养基,37℃,5%CO2培养,逐日观察细胞病变。

同时取肺组织悬液上清空斑形成实验分析肺组织病毒滴度。

5）相关指标测定:

空斑形成实验测定病毒滴度:

3×

105/mlVero细胞接种至6孔板,10%FBS的1640培养至单层致密无孔细胞,接种10倍倍比稀释的病毒液100μl,每个浓度设复孔,未感染病毒为对照孔。

病毒吸附2h后覆盖含1.5%的琼脂糖凝胶和2%FBS的1640培养基,培养5天,5mg/mlMTT显色,计数空斑,计算病毒滴度:

PFU/ml=稀释度×

×

P=该浓度下各孔空斑数;

n=复孔数;

v=每孔接种病毒液体积（ml）

支气管肺泡灌洗液白细胞计数:

感染后第3天、6天和9天处死小鼠,气管插管,预冷生理盐水0.5ml灌洗2次,收集支气管肺泡灌洗液（BALF）,血球计数仪计数白细胞总数。

4℃,1000g离心10min,取细胞沉渣涂片,Wright染色,显微镜下计数200个白细胞,按中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞形态学特点分类计数。

直接免疫荧光实验:

取感染后第3天小鼠BALF离心细胞沉渣涂片,4℃丙酮固定干燥,按LightDiagnosticsRespiratorypanel1DFA免疫荧光试剂盒说明书（Chemicon,USA）鉴定RSV抗原,荧光显微镜下观察结果。

肺组织病理学检查:

感染后第3天、6天处死小鼠,取未经支气管肺泡灌洗

的右肺组织,一部分4%多聚甲醛固定,常规苏木素-伊红（HE）染色,光镜观察形态结构。

另一部分立即2.5%戊二醛固定,送重庆医科大学电镜室包埋、制成超薄切片,透射电镜检查。

免疫组织化学检查:

RSV抗原免疫组织化学染色SP染色试剂盒（北京中杉

生物技术公司）,一抗是针对RSV整个病毒抗原的山羊多克隆抗体（USBiological,USA）。

4%多聚甲醛固定肺组织,常规切片,各步操作按试剂盒说明进行,DAB显色后显微镜下观察。

同一标本未滴加一抗的切片作阴性对照。

图像分析采用北航真彩色病理图像分析系统4.0,平均光密度反映染色强弱。

（三）可行性分析

1.小鼠易获得,易饲养;

小鼠遗传背景清楚而均一,基因改造技术成熟,已有多种商品化试剂,

2.实验器械容易解决;

本实验模型操作不复杂;

3.实验所需费用不多;

实验时间不长。

（四）预期效果

裸小鼠和BALB/c小鼠遗传背景、RSV感染形式、炎症类型和发生发展过程一致,裸小鼠既保留BALB/c鼠的优点,又有持续高水平病毒滴度,感染更严重，持续时间更长,炎症反应更明显,有利于抗RSV药物效果评价和RSV发病机理的研究，是较理想的小鼠模型。

（五）实验设计工作时间安排

1、共计1天完成实验动物模型制备。

2、共计1天完成取材。

3、共计9天完成相关指标测定。

4、共计3天完成BALB/c小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒（RSV）感染模型特点的比较。

5、总共实验在15完成。

三、完成实验的条件

1、仪器设备情况：

哺乳动物的手术器械、Y字型气管插管、注射器、气管插管、离心机、离心管、试管血球计数仪计、免疫荧光试剂盒、RSV抗原免疫组织化学染色SP染色试剂盒、荧光显微镜、

2、实验动物来源:

健康的BALB/c小鼠和裸小鼠从四川大学华西医学中心购买，各30只。

BALB/c小鼠25元/只，裸小鼠60元/只。

3、药品试剂来源：

2%胎牛血清（FBS）、10%FBS、1.5%的琼脂糖凝胶、5mg/mlMTT、戊巴比妥钠0.06mg/g、2×

106PFU/mlRSVA2株病毒液、2%FBSDMEM、生理盐水、2.5%戊二醛、4%多聚甲醛、预冷组织平衡液、苏木素-伊红（HE）