荧光法测定饮料中维生素C的含量.docx

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荧光法测定饮料中维生素C的含量

荧光法测定饮料中维生素C的含量

罗义媛

指导老师：

***

（重庆工商大学,食品科学与工程,2008级食品班）

摘要：

本文建立了荧光分光光度法测定饮料中维生素C的含量的方法。

方法是饮料经草酸提取，活性碳氧化处理后，可氧化为顺式脱氢型，此化合物的α-酮基与邻苯二胺反应形成喹喔啉，在激发波长340nm,发射波长424nm处测定其荧光强度。

实验结果表明维生素C在15~60ug/14ml范围内有良好的线性关系，相关系数为0.9993。

利用本方法进行回收实验与样品测定，结果令人满意，适用于饮料中维生素C的测定。

关键词：

荧光光度法；维生素C;饮料

FluorescenceSpectrometryDeterminationForVitaminCInSoftDrink

LuoYiyuan

Instructor:

WangCongjun

（ChongqingTechnologyandBusinessUniversity,FoodScienceandEngineering,Foodclassof2008level）

Abstract:

ThisarticleestablishedafluorescencespectrophotometricmethodforthedeterminationofvitaminCinsoftdrink.Methodthebeveragewasextractedbyoxalicacid,afteroxidationtreatmentbycarbonoxidation,vitaminCisoxidizedtocis-dehydrogenatedtype,Thenitsα-ketonereactswitho-benzenediamineandproducesafluorescentcompound,Theoptimumexcitationwavelengthis340nm,andtheemissionis424nm,TheexperimentalresultsshowedthatthelinearrangeofthevitaminCwas15-60ug/14ml,relationshipcoefficientwas0.9993.Thepro-posedmethodcanbeusedinrecoveryandsampledetermination,whichwasfittedwelltomostbeverage.

Keywords:

fluorescencespectroscopy;vitaminC;softdrink

1绪论

1.1课题研究目的

随着人类生活水平的不断提高，人们更加提倡合理的膳食结构，除了每天摄入相应的营养物质以维持正常生活外，适当的补充维生素也是必不可少的，特别是维生素C，维生素C又称抗坏血酸，属于水溶性维生素，它是人体所需营养素中六类物质中一种，是维持正常生命过程所必需的一类有机物[1],人体每天消耗量和排出量较高，但人体不能自身合成，必须从饮食中摄取，因此，合理的补充维生素C对人体健康至关重要，测定食品中的维生素C成为食品营养分析的重要内容。

市售的饮料中维生素C含量不尽相同，本实验以市售三种饮料为检测对象，对其维生素C的含量进行测定，由于测定维生素C的方法比较多，但由于荧光法具有灵敏度高，线性关系好，精密度高以及不受其它荧光杂质的干扰等优点，故本实验采用荧光法测定饮料中的维生素C。

1.2饮料的简介

1.2.1饮料的概念

饮料（drink，beverage）是指以水为基本原料，由不同的配方和制造工艺生产出来，供人们直接饮用的液体食品。

饮料除了供水分外，由于在不同品种的饮料中含有不等量的糖、酸、乳以及各种氨基酸、维生素、无机盐等营养成分，因此有一定的营养。

1.2.2饮料的分类

饮料一般分为含酒精饮料和不含酒精饮料（软饮料）。

酒精饮料是指供人们饮用且酒精（乙醇）含量在百分之0.5-65（V/V）的饮料，包括各种发酵酒、蒸馏酒及配制酒。

不含酒精饮料又称软饮料，是指酒精含量小于百分之0.5（V/V），以补充人体水分为主要目的的流质食品，包括固体饮料。

软饮料大致的种类有：

碳酸饮料、果蔬汁饮料、植物蛋白饮料、矿泉水和纯净水、乳及乳饮料、其他饮料（三大传统饮料：

茶饮料、运动饮料、功能饮料）。

1.2.3中国饮料行业发展情况

中国饮料行业是改革开放以来发展起来的新兴行业，是中国消费品中的发展热点和新增长点。

30年来，饮料行业不断地发展和成熟，逐渐改变了以往规模小、产品结构单一、竞争无序的局面，饮料企业的规模和集约化程度不断提高，产品结构日趋合理。

中国饮料在品牌方面的发展成果显著，全国性品牌已有十几家，五类产品中22个品牌被评为中国名牌。

（1）饮料市场百花齐放，逆势增长

近几年，中国饮料行业产值增长速度均超过GDP的增长速度，良好的发展前景，加之整个行业市场化程度较高，吸引了国际饮料巨头纷纷进入，竞争非常激烈。

同时，近几年来，我国软饮料年产量以超过20%的年均增长率递增，达到1300多万吨。

在产量增长的同时，品种也日趋多样化，为消费者提供了更多的选择机会。

中国饮料行业逆势而动，一边是饮料巨头加快扩张，一边是一批以具有健康概念、以独特的农产品为原料的新产品快速涌现。

在饮用水市场，新品牌层出不穷，众多企业纷纷推出瓶装饮用水。

除农夫山泉的天然弱碱水、康师傅的矿物质水、娃哈哈的纯净水外，可口、百事、汇源、达利园、今麦郎等企业也纷纷加大瓶装水的推广力度，借助自身的渠道优势吹响攻城略地的号角。

同时，高端水的推出是2009年的一大亮点，知名品牌Heidiland、依云等都在高端水市场集中发力，坐享高额利润。

（2）饮料市场三足鼎立之势

我国饮料市场始终是一个风云变幻、群雄逐鹿的战场。

历经改革开放30多年的市场大潮，我国饮料市场已由当年的“汽水”一张面孔，发展为由碳酸饮料、果汁饮料、茶饮料、功能饮料、含乳饮料等瓜分天下，果蔬、粗粮、大豆、咖啡等饮料寻求突破的市场格局。

2009年以来，我国饮料市场更加红火、热闹，形成茶饮料、果汁饮料、功能性饮料三足鼎立之势，而在新兴的细分市场内，新老品牌轮流坐庄亦司空见惯。

（3）饮料行业的质量现状

名牌产品质量无需置疑，而且与国外产品没有太大差别。

名牌产品近几年抽样合格率100%（“中国名牌”产品销量占总销量近60%）。

可以说主流产品的质量是非常优秀的。

但非主流产品的质量还存在一些问题，主要体现在以下几个方面：

1.少数产品质量较差。

不少饮料产品是故意偷工减料，比如在强化维生素、微量元素上不添加或添加不够，在基本营养素、脂肪、蛋白等营养物质上很多产品达不到要求，有些产品卫生指标也达不到要求；2.存在劣质假冒产。

这样的产品大多流向农村和城乡结合部，这些地方是监管的薄弱环节；3.“误导”性宣。

在功能性饮料“误导”性的宣传下，很多消费者错误地认为，功能饮料可以补充人体所需的所有营养物质。

但科学研究证明，在瓶装水中添加几毫克的维生素、微量元素制造而成的功能饮料，根本无法满足人体对维生素等营养成分的全面需求，其作用在于只能起到进一步补充人体养分的作用，而人体所需的营养物质只能从日常食物中摄取；4.运动型饮料营养成分数据模。

在众多饮料企业纷纷涉足功能性饮料市场时，生产运动型饮料的企业占据比例最高，但是在产品标签上对所含的营养成分没有标出确切的数据，让消费者消费得“不明不白”；5.违规添加添加剂或防腐剂超。

2008年乳品行业发生了震惊全国的三聚氰胺事件，含乳饮料虽然未报道被检出三聚氰胺超标，但三聚氰胺事件对饮料行业来说最大的警示是不能违规添加添加剂。

据报道，还有的企业在饮料中超标添加苯甲酸钠等防腐剂。

有的饮料含有合成香料、色素，消费者饮用此类产品不仅会影响胃肠功能，而且会加重肾脏负担，给其健康带来了较大的影响。

1.2.4饮料行业发展趋势

“十一五”期间，中国着重调整饮料产品结构，降低碳酸饮料的比例。

饮料行业生产总量继续提高，重点发展果蔬汁饮料、植物蛋白饮料和茶饮料等产品，适度发展瓶（罐）装饮用矿泉水，逐步降低可乐等碳酸类饮料的发展。

因此在利好政策的推动下，未来几年将是软饮料行业框架结构重构时期，功能饮料、果汁饮料、茶饮料等健康饮料将组成框架结构的主体。

追求健康价值，是未来中国饮料市场发展的必然方向。

健康饮品占领市场的一个重要方面是产业技术创新，“创新是企业的灵魂”。

中国饮料企业在未来相当长的时间内将面临更为广阔的市场和更好的发展环境。

1.3维生素C简介

1.3.1维生素C概念

维生素C是显示抗坏血酸生物活性的化合物的通称，是一种水溶性维生素。

在氧化还原代谢反应中起调节作用，缺乏它可引起坏血病。

维生素C是可溶于水的无色结晶，是一种分子结构最简单的维生素。

由于其防治坏血病的功能，所以在医药上常把它叫做抗坏血酸（ascorbicacid）。

维生素C是一种具有六个碳原子的酸性多羟基化合物，是烯醇式己糖酸内酯。

其分子中2位和3位碳原子的两个烯醇式羟基容易解离，释放出H+,因此维生素C是酸性的。

维生素C有D（氧化型）型和L型（还原型）两种异构体，只有L型有生理功能。

维生素C自身可发生氧化还原反应，氧化型抗坏血酸和还原型脱氢抗坏血酸可以互相转变，在生物细胞中自成一氧化系统，在体内参与氧化还原反应，羟化反应，人体不能合成。

化学名称：

L—抗坏血酸

分子式：

C6H8O6分子量：

176.13

结构式：

（2,3,4,5,6-五羟基-2-己烯酸-4-内酯）

1.3.2维生素C来源及性质

维生素C是最不稳定的一种维生素，易被氧化。

只有新鲜的蔬菜、水果或生拌菜才是维生素C的丰富来源。

植物及绝大多数动物（除人、灵长类及豚鼠以外）均可在自身体内合成维生素C。

（注：

1907年挪威化学家霍尔斯特在柠檬汁中发现维生素C，1934年才获得纯品，现已可人工合成）

维生素C为无色片状结晶，熔点为192℃，味酸，极易溶于水及乙醇，为水溶性维生素C。

维生素C在酸性溶液中比在中性和碱性溶液中稳定；极易受温度、光照、射线、盐和糖浓度、氧气、酶、金属离子（Fe3+和Cu2+）、水分活度等因素的影响，在加工储藏过程中很容易被破坏。

1.3.3维生素C的作用

（1）具有抗氧化作用，主要是抗细胞液、细胞间质及血浆的氧化，也可以保护其它抗氧化剂，如维生素A、维生素E、不饱和脂肪酸，减少自由基对身体的损坏。

（2）预防坏血病，坏血病因缺乏维生素C所致，体内VC不足，微血管容易破裂，血液流到邻近组织。

初期病症为微血管出血：

牙龈出血、皮下出血等，重者：

口腔溃疡，身体衰弱，严重死亡。

（3）与蛋白质结合，有助促进胶原蛋白的合成，帮助创口愈合；有助于巩固结缔组织，保护骨骼、牙齿和牙龈健康。

（4）预防动脉硬化，可促进胆固醇的排泄，防止胆固醇在动脉内壁沉积，甚至可以使沉积的粥样斑块溶解。

（5）防止牙床出血，防止关节痛、腰腿痛。

（6）治疗贫血。

使难以吸收利用的三价铁还原成二价铁，促进肠道对铁的吸收，提高肝脏对铁的利用率，有助于治疗缺铁性贫血。

（7）防癌[2-3]。

丰富的胶原蛋白有助于防止癌细胞的扩散；VC的抗氧化作用可以抵御自由基对细胞的伤害防止细胞的变异；阻断亚硝酸盐和仲胺形成强致癌物亚硝胺。

（8）保护细胞、解毒，保护肝脏。

只要VC充足，则VC、谷胱甘肽、-SH形成有力的抗氧化组合拳，清除自由基，阻止脂类过氧化及某些化学物质的毒害作用，保护肝脏的解毒能力和细胞的正常代谢。

（9）提高机体的应急能力。

人体受到异常的刺激，如剧痛、寒冷、缺氧、精神强刺激，会引发抵御异常刺激的紧张状态。

该状态伴有一系列身体，包括交感神经兴奋、肾上腺髓质和皮质激素分泌增多。

肾上腺髓质所分泌的肾上腺素和去甲肾上腺素是有酪氨酸转化而来，在次过程需要VC的参与。

（10）提高人体的免疫力。

VC可增强中性粒细胞的趋化性和变形能力，提高杀菌能力。

促进淋巴母细胞的生成，提高机体对外来和恶变细胞的识别和杀灭。

参与免疫球蛋白的合成。

促进干扰素的产生，干扰病毒mRNA的转录，抑制病毒的增生。

总的来说，维生素C（抗坏血酸）是人体内不可缺少的基本营养成分。

人体需要维生素C主要是由食品供给的，因此，测定食品中的维生素C含量是食品营养分析的重要内容，同时也是评价食品贮藏、流动、加工过程中的主要指标[4]。

1.4维生素C检测方法简介

维生素C（抗坏血酸）是人体必需儿又不能在体内合成的一种维生素；由于它与多种疾病之预防和治疗有关，早已引起人们普遍重视，随着医学与营养学研究的日益深入，对测定方法提出了更高的要求，而且维生素C的测定方法有很多，2，6-二氯靛酚滴定法[5-7]、2，4-二硝基苯肼法[8-10]、碘量法[11-12]、紫外分光光度法[13]、荧光法[14-15]等方法，但因荧光法具有灵敏度高，线性关系好，精密度高以及不受其它荧光杂质的干扰等优点，故以荧光法测定食品中维生素C已越来越为广大分析工作者采用[16-17]。

1.4.12，6-二氯靛酚滴定法（还原型VC）

原理：

还原型抗坏血酸还原染料2，6-二氯靛酚，该染料在酸性中呈红色，被还原后红色消失。

还原型抗坏血酸还原2，6-二氯靛酚后，本身被氧化成脱氢抗坏血酸。

在没有杂质干扰时，一定量的样品提取液还原标准2，6-二氯靛酚的量与样品中所含维生素C的量成正比。

本法用于测定还原型抗坏血酸，总抗坏血酸的量常用2，4-二硝基苯肼法和荧光分光光度法测定。

它具有简便、快速、比较准确等优点，适用于许多不同类型样品的分析。

缺点是不能直接测定样品中的脱氢抗坏血酸及结合抗坏血酸的含量，易受其他还原物质的干扰。

如果样品中含有色素类物质，将给滴定终点的观察造成困难。

1.4.2紫外分光光度测定法

原理：

根据维生素C具有对紫外光产生吸收、对碱不稳定的特性，在243nm处测定样品液与碱处理样品液两者吸光度值之差，并通过标准曲线，即可计算出维生素C的含量。

紫外测定法是维生素C快速测定的方法，操作简单，不受其它还原性物质等成分的干扰。

由于食品样品中所含有的其它成分在紫外区有很高的本底吸收，因此，还原型维生素Ｃ紫外光谱法很少用于食品分析。

1.4.3碘量法

原理：

维生素C包括氧化型、还原型和二酮古乐糖酸三种。

当用碘滴定维生素C时，所滴定的碘被维生素C还原为碘离子。

随着滴定过程中维生素C全被氧化，所滴入的碘将以碘分子形式出现。

碘分子可以使含指示剂（淀粉）的溶液产生蓝色，即为滴定终点。

滴定过程中，要保持缓慢滴定，同时要晃动锥形瓶。

这样既可以防止碘溶液过量，又可以使碘溶液与被滴定溶液充分混合。

有时仅仅通过观察颜色，不容易确定氧化还原反应是否达到终点。

1.4.42，4-二硝基苯肼法

原理：

总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸。

样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，再与2，4-二硝基苯肼作用生成红色脎，脎的含量与总抗坏血酸含量成正比，进行比色测定。

2，4-二硝基苯肼法是比色法，易受杂质干扰，灵敏度较低，而荧光法的灵敏度高于比色法2～3个数量级。

另外，2，4－二硝基苯肼法采用85％的浓硫酸作溶剂，实验时不易操作。

1.4.5荧光光度测定法

原理：

样品中还原型坏血酸经活性炭氧化成脱氢型抗坏血酸后，与邻苯二胺（OPOA）反应生成具有荧光的喹喔啉（quinoxaline），其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一起条件下成正比，以此测定食物中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。

脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与OPDA反应，以此排除样品中荧光杂质所产生的干扰。

本实验采用F-2500荧光分光光度计，原产地为日本日立公司。

要用来检测荧光，散射光强度；其原理为某些特定的荧光物质在受到光的照射时，除吸收各种波长的光以外，还会发射出波长相同或波长更长的光；后者又分荧光和磷光。

F-2500荧光分光光度计如图：

2实验

2.1实验部分

2.1.1实验原料：

样品一统一鲜橙多（450ml）：

成都统一企业食品有限公司

Vc含量：

25mg/100ml

样品二统一蜜桃多（450ml）:

成都统一企业食品有限公司

Vc含量:

15mg/100ml

样品三达能的脉动（600ml）:

乐百氏食品饮料有限公司

Vc含量：

20mg/100ml

2.1.2实验试剂：

水：

全为蒸馏水

盐酸（AR,成都市科龙化工试剂厂）

活性碳（AR,重庆博艺化学试剂有限公司）

草酸（AR，上海化学试剂总厂）

硼酸（AR,重庆博艺化学试剂有限公司）

醋酸钠溶液（AR,成都市科龙化工试剂厂）

领苯二胺溶液（AR，天津市光复精细化工研究所）

VC标准溶液（重庆川东化工有限公司）

硼酸—醋酸钠溶液

2.1.3实验设备和仪器：

F-2500荧光分光光度计（重庆普乐菲进出口有限公司）

CS1012型电热鼓风干燥箱（中华人民共和国重庆实验设备厂）

电子天平（梅特勒—托利仪器，上海有限公司）

电炉（重庆海森机电设备开发公司）

100ml烧杯（若干）25ml容量瓶

250ml烧杯（若干）50ml容量瓶

500ml烧杯（若干）100ml容量瓶（两个）

100ml量筒（一个）250ml容量瓶（两个）

250ml量筒（一个）90mm漏斗

2ml移液管（5根）25ml比色管（10个）

5ml移液管（2根）150ml锥形瓶（4个）

10ml移液管（3根）玻璃棒（3根）

洗耳球（一个）滤纸（若干）

2.2实验原理及荧光光度计的使用方法

2.2.1实验原理：

试样中的还原型抗坏血酸经（AA）过活性碳氧化成为脱氢抗坏血酸（DHAA）后，再与领苯二胺（OPDA）反应生成有荧光的喹喔啉，其荧光强度与抗坏血酸的浓度在一定条件下是成正比的，以此来测定样品中抗坏血酸和脱氢抗环血酸的总量；实验中为消除其他荧光物质（丙酮酸）的影响，加入硼酸（硼酸与脱氢抗坏血酸可形成不与邻苯二胺反应的络合物），以此为空白实验；样品处理好后用荧光光度计测其荧光值，对不同浓度的标准溶液进行测定，从而得出线性相关方程。

在其他条件一样的情况下测定醋酸钠和硼酸醋酸钠的影响。

在同等条件下平行做多组实验进行对比（变异系数的测定），判断此方法的重现性是否良好。

样品中再加入标准品，测定其回收率，判断其数据是否可靠[18-19]。

2.2.2F-2500荧光光度计的使用方法：

（1）先打开仪器主机，打开电脑。

（2）点击桌面FL－Solutions使其激活。

（3）寻找激发波长：

放入样品，寻找激发波长，点击Method，出现对话框，点击General，在Measurement中选择wavelengthscan，点击Instrument，在scanmode中选择Excitation，在datamode中只选Fluorescence，在EMWL中输入发射波长数值（420nm）。

在EXstart中输入激发起始波长（220nm），在EXendWL中输入激发终止波长（700nm）。

点击确定即可得到荧光物质的激发光谱曲线。

（4）寻找发射波长：

同上法。

在scanmode中选Emission。

在datamode中只选Fluorescence，在EXWL中输入激发波长数值（350nm）。

在EMstart中输入发射起始波长（220nm），在EMendWL中输入发射终止波长（700nm）。

点击确定即可得到荧光物质的发射光谱曲线。

（5）将样品放入，在scanmode中选Emission。

在datamode中只选Fluorescence，在EXWL中输入激发波长数值（350nm）。

在EMstart中输入发射起始波长（220nm），在EMendWL中输入发射终止波长（700nm）。

点击确定即可得到荧光物质的发射光谱曲线。

记录在424nm处的荧光值F。

（6）在完成测量之后，关闭仪器按下列步骤执行。

从文件菜单（F）中，选择退出（X）指令。

⊙closethemonitorwindow,butkeeplampoperating?

Ｏclosethelamp，thenclosethemonitorwindow.

选择yes，FLSolutions程序将终止。

关闭光度计的电源开关。

关闭电脑，清洗比色皿，结束操作

注：

关灯：

使用以上指令来关闭氙灯，为了再次打开氙灯，必须重新启动光度计。

狭缝宽度选择为5nm。

2.3实验方法

2.3.1试剂配制：

（1）酸洗活性碳：

取100g活性碳，以10%的Hcl500ml加热煮沸5分钟，以水洗涤三次（每次500ml）,然后再120℃的烘箱里烘干备用。

（2）1%草酸水溶液：

称取草酸2.5g加水溶解，并定容至250ml备用。

（3）醋酸钠溶液：

称取醋酸钠125g,溶于水中，并定容至250ml备用。

（4）硼酸—醋酸钠溶液：

称取9g硼酸，加入醋酸钠溶液35ml使之溶解，再用水定容至100ml，使用前新鲜配制。

（5）领苯二胺溶液：

称取20mg领苯二胺溶于100ml水中，使用前新鲜配制且避光保存。

（6）VC标准溶液：

称取25mgVC,以1%草酸定容至50ml，此溶液含VC500ug/ml。

再把此50ml溶液至于150ml锥形瓶中，加入2g活性碳，剧烈振摇2-3min，稍静置，过滤。

取滤液1.5ml于25ml容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，此溶液含VC30ug/ml.

2.3.2荧光化合物的激发和发射光谱

启动F-2500荧光分光光度计，选择激发和发射狭缝为5nm，对维生素C与领苯二胺所形成的荧光化合物的激发和发射光谱进行扫描。

所得激发波长和发射波长光谱如图1所示。

图1

EX为激发波长EM为发射波长

本文所选择的激发波长为340nm,发射波长为424nm。

2.3.3影响荧光强度的因素

（1）草酸

维生素C极易在空气中被氧化尤其是在碱性的的条件下，而在酸性的介质中它受空气氧化的速度和程度稍慢，且较稳定。

本文用1%的草酸[20]水溶液作为实验中维生素C的提取液，是为了减慢维生素C的氧化速度，也防止维生素C的氧化损失，也可以减少实验的的误差，使实验数据更为准确。

（2）活性碳

活性碳是很好的氧化剂和吸附剂[21]，其在此实验中既起氧化作用将样品中的还原型抗坏血酸氧化为脱氢抗坏血酸，也对饮料样品起脱色的作用。

所以适量的活性碳对实验结果测定有重要作用，本实验选择活性碳的用量[22]为2g,能够使测定样品中维生素C完全氧化且吸附作用不是很明显。

实验中还需注意样品和标准品中活性碳的加入量需要一致，这样可以消除系统误差。

（3）硼酸—醋酸钠

取25ml具塞比色管

、

、

、

、

、

6管，各加入标准溶液2.0ml,再各加入2.0ml硼酸—醋酸钠溶液，摇匀，各放置0min,5min,10min,15min,20min,25min,然后立即于各管中加入邻苯二胺溶液10ml（黑暗中加入），摇匀，在暗处放置40min后，用荧光光度计测定其荧光值（F）。

平行实验做三组。

根据实验得到相关数据，制表，判断硼酸—醋酸钠溶液加入后反应时间对荧光强度的影响。

（4）醋酸钠

取25ml具塞比色管

、

、

、

、

、

5管，各加入标准溶液2.0ml（VC加入量为60ug）,再各加入2.0ml醋酸钠溶液，各放置0min,3min,6min,10min,15min后,立即在黑暗处各加入邻苯二胺溶液10ml,摇匀，在暗处放置40分钟后，用荧光光度计测