分子生物学校对版1.docx

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分子生物学校对版1

绪论

分子生物学

广义：

从分子的形式来研究生物现象的学科。

狭义：

从分子水平理解生命活动，主要指遗传信息的传递（复制）、保持（损伤和修复）、基因的表达（转录和翻译）与调控。

DNA是遗传物质被证实

1944年，AveryO.T.肺炎双球菌转化实验

1）DNA在原核生物中是遗传物质

1928Griffith,无毒菌株与杀死的有毒菌株混合，即可致病；

1944Avery,肺炎链球菌转化（transform）实验（DNA提取和转化）

2）T2噬菌体的遗传物质被证明是DNA（捣碎实验）。

3）真核细胞通过DNA转染（transfection）获得新的表型

基因（gene）：

能够表达和产生基因产物（蛋白质或RNA）DNA序列。

可分为蛋白质基因和RNA基因；按功能可分为结构基因和调节基因。

基因组（genome）：

一生物体内所有的基因。

现一般指生物体内所有的DNA序列。

E.coli的重要性:

在实验室中容易操作;生长迅速，只要求简单的营养物质;能进行很多生理生化过程;E.coli是发现存在有性生殖的第一种细菌

第二章

提出双螺旋结构的依据

各种生物物理资料（DNA纤维中的水含量）

X－ray衍射图谱（RosalindFranklin完成）

碱基比（Chargaff完成）

核酸的种类（RNA、DNA）

①核糖核酸（ribonucleicacid-RNA）:

转移RNA（transferRNA-tRNA）、信使RNA（messengerRNA-mRNA）、核糖体RNA（ribosomalRNA-rRNA）

小分子细胞核RNA（snRNA）、染色质RNA（chRNA）、反义RNA（antisenseRNA）、双链RNA（dsRNA）、细胞质小RNA（scRNA）、具有催化活性的RNA（ribozyme）、各种病毒RNA

②脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid-DNA）

核酸的功能：

DNA是主要的遗传物质（转化作用）

遗传信息的载体，负责遗传信息的贮存和发布。

RNA的功能：

1.参与蛋白质的合成

rRNA（75-80%）tRNA（10-15%）mRNA（2-5%）

2.遗传物质

3.具有生物催化剂功能

核酸的元素组成有两个特点：

1.一般不2.P含量较多，并且恒定（9%-10%）。

因此，实验室中用定磷法进行核酸的定量分析。

（DNA9.9%、RNA9.5%）含S。

核酸（DNA和RNA）是一种线性多聚核苷酸，它的基本结构单元是核苷酸。

核苷酸本身由核苷和磷酸组成

RNA的分子结构（RNAstructure）

RNA一级结构研究最多的是tRNA、rRNA以及一些小分子的RNA。

组成RNA的核苷酸也是以3′-5′磷酸二酯键连接。

模型构建（Watson&Crick完成）

RNA的高级结构特点：

RNA是单链分子，因此，在RNA分子中，并不遵守碱基种类的数量比例关系，即分子中的嘌呤碱基总数不一定等于嘧啶碱基的总数。

RNA分子中，部分区域也能形成双螺旋结构（类似A-DNA双螺旋结构），不能形成双螺旋的部分，则形成突环。

这种结构可以形象地称为“发夹型”结构或茎环结构。

超螺旋（supercoil/superhelix）---DNA的高级结构

定义：

DNA的高级结构指DNA分子（双螺旋）通过扭曲和折叠所形成的特定构象。

包括不同二级结构单元间、单链与二级结构单元间的相互作用以及DNA的拓扑特征。

超螺旋是DNA高级结构的主要形式。

可分为正超螺旋和负超螺旋。

正超螺旋（positivesupercoil）：

DNA扭曲方向与双螺旋方向相同，形成正超螺旋（双链紧缠）

负超螺旋（negaivesupercoil）DNA扭曲方向与双螺旋方向相反，形成正超螺旋（双链松缠）

两种超螺旋的自由能均高于松弛状态。

天然原核生物DNA都呈现哪一种超螺旋形式？

为什么？

天然原核生物呈现负超螺旋

DNA负超螺旋易于解链，在DNA复制、重组和转录等过程中都需要两条链解开，所以负超螺旋利于这些功能的实施。

在体外可形成正超螺旋，如加入溴化乙锭（EtBr，EB），可引入正超螺旋。

EB插入DNA碱基之间

EB嵌入剂

双螺旋结构的特点:

A与T，C与G配对，以氢键结合；

双链反向平行（以5’~3’为正方向），从两端看结构相同。

两条主链由脱氧核糖和3’-5’磷酸二酯键交互连接而成；碱基位于内侧

基本参数

直径：

2.0nm；

螺距：

3.4nm；

每匝10bp/10.5bp

每一碱基对比另一对沿轴旋转36°

大沟含较多信息，为复制，转录部位；

小沟具一定调节功能

三种DNA结构特性比较

A-DNA

B-DNA（含水量92%）脱水后变形为A-DNA（含水75%），相邻磷酸间距缩小，每匝增为11bp。

总体变得宽而短；

大沟变细、加深；小沟变得宽而浅。

通常DNA在细胞中以B-DNA形式存在，但可能发生改变；DNA-RNA杂交分子呈A型。

Z-DNA

Z-DNA与B-DNA的比较

最大区别：

Z-DNA为左旋！

由部分碱基反转平面所致。

螺距4.5nm，每对碱基上升0.37nm，每匝12bp。

主链变的不平滑，从之字形，以Zig-Zag得名为Z-DNA

可能与基因的调控有关

核酸的稳定性

*氢键:

在蛋白质和核酸中，氢键并不能使之稳定。

其对大分子的特殊结构有作用：

比如，α－螺旋，β折叠，DNA双螺旋等。

碱基堆积力（stackinginteraction）:

核酸分子稳定性的根源。

为什么呢？

疏水的碱基堆积起来,使水分子排除在外，从能量的角度来讲最为稳定。

核酸的光谱学和热力学特性

核酸的消光系数：

1mg/mldsDNAA260=20;ssDNA/RNAA260=25

消光系数的决定因素：

紫外光吸收

核酸因含有共轭的苯环而吸收紫外光

应用：

DNA检测、定量和纯化

减色效应（Hypochromicity）:

由于碱基在疏水环境中的堆积所造成。

单一的核苷酸在260nm（A260）的光吸收值最大，其次是单链DNA（ssDNA）或RNA，而双链DNA（dsDNA）最小。

即dsDNA相对于ssDNA是减色的（hypochromic）

增色效应（hyperchromaticeffect）:

DNA双链分离时，伴随着在260nm处的吸光值的增加。

增加的过程为慢-快-慢的S形曲线。

增加到中点时的温度叫作熔（融）解温度（meltingtemperature）。

影响变性的因素

溶液离子强度、甲酰胺、尿素、pH、DNA碱基组成。

DNA拓扑异构酶（DNAtopoisomerase

功能：

催化DNA分子拓扑异构体之间的相互转化。

作用机制：

切开磷酸二酯键，在主链上造成切口，通过改变连接数（L）来改变超螺旋状态。

分类：

I型拓扑异构酶：

每次切开一股链。

II型拓扑异构酶：

每次切开双股链。

既可消除负超螺旋，又可消除正超螺旋。

需要ATP，使分子了L值每次变化±2。

复性

快速降温只形成局部区域的双链DNA:

慢速冷却提供了足够的时间使得互补链能够相互配对，样品可以形成完全的双链DNA

退火（Annealing）

example:

annealingstepinPCRreaction。

杂交（Hybridization）:

不同核酸链之间的互补部分的复性称为杂交。

examples:

NorthernorSouthernhybridization

热变性

加热可以破坏DNA或RNA双链区的氢键

DNA的纯度

A260/A280:

dsDNA—1.8

PureRNA—2.0

Protein—0.5

如果ＤＮＡ样品中A260/A280＞1.8？

?

如果ＤＮＡ样品中A260/A280<1.8？

?

1）消光系数表示DNA和RNA的最大紫外光吸收波长为260nm（λmax=260nm）的是不同碱基吸光值的总和（Pu>Py）

2）减色性，与核酸的二级结构有关

RNA一级结构的特点

RNA一级结构研究最多的是tRNA、rRNA以及一些小分子的RNA。

组成RNA的核苷酸也是以3′-5′磷酸二酯键连接。

RNA的高级结构特点

（1）RNA是单链分子，因此，在RNA分子中，并不遵守碱基种类的数量比例关系，即分子中的嘌呤碱基总数不一定等于嘧啶碱基的总数。

（2）RNA分子中，部分区域也能形成双螺旋结构（类似A-DNA双螺旋结构），不能形成双螺旋的部分，则形成突环。

这种结构可以形象地称为“发夹型”结构或茎环结构。

酸效应

PH=3~4:

连接嘌呤和核糖的糖苷键断裂，产生脱嘌呤核苷。

强酸＋高温：

完全水解碱基，核糖/脱氧核糖和磷酸

应用：

Maxam-GilbertDNA化学测序法

碱效应

DNA

PH>7~8，DNA结构的改变较为温和（subtle）

较高的PH可以使碱基发生互变异构（tautomeric），也会导致变性（denatured）发生

RNA

由于RNA存在2’－OH，在较高的PH值条件下RNA会发生水解

化学变性尿素（H2NCONH2）甲酰胺（HCONH2）

破坏水溶液的氢键作用

碱基的疏水效应削弱

核酸变性

第三章

一、染色质（Chromatin）

染色质是间期细胞核内伸展开的DNA-蛋白质纤维，由核小体为基本单位构成。

染色质和染色体

化学组成

DNA：

染色体的主要化学成分,也是遗传信息的载体

RNA：

含量很少,还不到DNA量的10%

蛋白质:

组蛋白（histone）：

染色体中的碱性蛋白质，其特点是富含二种碱性氨基酸（赖氨酸和精氨酸）

非组蛋白（NHP）:

染色体中组蛋白以外的蛋白质，是一大类种类繁多的各种蛋白质的总称。

1.核小体

1）单个核小体的沉降系数约为11S

2）核小体含有约200bp的DNA，核心组蛋H2A、H2B、H3、H4各2份拷贝（Corehistone）和1拷贝的组蛋白H1

3）DNA以核小体阵列方式来缠绕:

单一组织中每个核小体上DNA长度在154-260bp范围内变化,但一般情况下均值约为200bp

4）核小体DNA根据其对微球菌核酸酶的敏感性不同可分为核心DNA（146bp）和连接DNA（8-114bp），核小体DNA长度的变化是由于连接DNA长度的改变。

二、染色体（Chromosome）

染色体是细胞分裂期由染色质高度凝集而形成的一种棒状结构。

DNA

一个单倍体基因组的DNA含量是恒定的，称为C-值（C-value）

C-值矛盾（C-valueparadox）：

基因组大小与机体的遗传复杂性缺乏相关性。

第三节

原核生物基因组特点

1、结构简练。

其DNA分子绝大多数用于编码蛋白质，不翻译的序列只占4%；

2、存在转录单元（为多顺反子mRNA）.

3、基因重叠即同一段DNA片段能够编码两种甚至三种蛋白质分子

那么病毒基因组最主要的特点是什么？

一个是病毒基因组非常“经济”，一个是为多顺反子mRNA

真核基因组

真核生物复性动力学

两种复杂性大小不同的DNA序列，当DNA绝对含量（即总核苷酸数）相等时，复杂性小的分子浓度高，复性快。

待测样品复杂长度=4.2×106bp×样品DNACot1/2/大肠杆菌DNACot1/2

复性动力学（Cot曲线）

小分子可以完全复性，而大分子较难。

Cot（浓度时间常数）：

复性反应中DNA浓度与反应时间的乘积

Cot1/2:

反应完成一半时所需的Cot值，直接与复性DNA成正比

基因组的复杂性是用DNA中单一序列的长度加上各重复序列的长度。

真核Cot1/2（DNAofanygenome）/Cot1/2（E.coliDNA）=complexityofanygenome4.2×106bp

生物基因组特点

1.真核生物基因组DNA与蛋白质结合形成染色体，除配子细胞外，体细胞是双倍体

2.真核细胞基因转录产物为单顺反子。

3.存在重复序列，重复次数可达百万次以上。

4.基因组中不编码的区域多于编码区域。

5.基因是不连续的。

6.基因组远远大于原核生物的基因组。

按照拷贝数或重复频率，基因组中的基因种类有以下几种

非重复序列：

在一个基因组中只有一份的DNA序列。

重复序列：

在一个基因组中多于一份的DNA序列。

中度重复序列（moderatelyrepetitivesequence）

高度重复序列（highlyrepetitivesequence）

真核生物基因组中非重复序列和重复序列的含量变化很大

高度重复序列没有表达的基因；中度重复序列表达少数基因；大多数基因由非重复序列表达

1）高度重复序列（highlyrepetitivesequence）：

重复数一般高达106，重复单位的长度一般为2～10bp，少数可达200bp.又称简单重复序列（simplysequenceDNA）

不能转录，参与染色体结构的维持，形成结构基因间隔，可能与减数分裂时同源染色体的联合配对有关。

卫星DNA（satelliteDNA）：

一些A-T含量很高的简单高度重复序列，由于A-T碱基对浮力密度较低，经CsCl密度梯度离心，会在主要DNA带的上面，伴随着一个次要的DNA带相伴，即所谓的卫星DNA。

小（微）卫星DNA（minisatelliteDNA）

也是由短的单位串联重复组成，但总长度短得多，重复单位为6—70bp，称为小卫星或数目可变的串联重复（variablenumbertandemrepeat,VNTR）或短串联重复序列（shorttandemrepeat,STR）

由于小卫星DNA序列数量的高度可变，可用于区分不同的个体

2）中度重复顺序（moderatelyrepetitivesequence）:

真核基因组中重复数十至数万（<105）次的重复顺序。

中度重复顺序可分为两种类型:

（1）短分散片段（shortinterspersedrepeatedsegments,SINES）如：

Alufamliy

（2）长分散片段（Longinterspersedrepeatedsegments,LINES）如：

KpnIfamliy

单拷贝顺序（低度重复顺序）

单拷贝顺序在单倍体基因组中只出现一次或数次，因而复性速度很慢,占整个基因组序列的50%-80%，蕴含大量遗传信息，编码各种不同功能蛋白质。

自私DNA（selfishDNA）

非编码序列，无特殊功能，即使基因缺失、重复或突变对生物体也无影响，只是自我复制，称为自私DNA或寄生DNA（parasiteDNA）

按照基因结构和功能，基因组中的基因种类有以下几种：

（1）基因簇和基因家族

基因家族（genefamily）

真核基因组中有许多来源相同、结构相似、功能相关的基因，这组基因称为基因家族。

基因簇（genecluster）是一组相同或者相近的相邻基因。

一个基因组中的一基因家族通过复制和重组而来。

其中某些基因保留了原来的功能；另一些则通过突变，获得新的功能，或者丧失了功能。

（2）假基因（pseudogene）用符号y表示

基因家族中的某些成员并不产生有功能的基因产物，一般由先前的功能基因积累突变形成，称为假基因。

2.核外DNA

线粒体和叶绿体中也含有基因组

表现出非孟德尔遗传特性，一般为母性遗传通常为环状DNA分子

线粒体基因组（mtDNA）

人类线粒体基因组具有下列特点

1排列紧凑

2突变率高于核DNA，且缺乏修复能力

3线粒体的密码子有若干处不同于核内通用密码子。

第四章

1复制子、复制眼、复制泡

复制子（replicon）:

DNA分子中能独立进行复制的单位称为复制子。

复制原点（origin）:

DNA分子复制的特定起点。

简称Ori

复制方向可以是单向

或者双向

单向复制，即只形成一个复制叉（replicationfork）

双向复制，即形成两个复制叉。

如E.coliDNA等。

复制叉是指从未解旋的母链向新复制的子链过渡的区域

复制泡（replication）:

真核生物的多复制子

三种可能的方式：

全保留复制（conservativereplication）

半保留复制（semiconservativereplication）

弥散复制（dispersivereplication）

氮同位素试验

实验结果表明：

DNA复制是以半保留方式的进行的。

半不连续复制冈崎片断的发现

1.实验体系：

E.coli

2.3H胸腺嘧啶标记→碱性蔗糖梯度对新生DNA进行离心→分析→大量新合成的1000～2000nt长（真核中是100—200nt长）的小片段=冈崎片断（Okazakifragments）

DNA复制的半不连续性

总是超前一步合成的链称为先导链（leadingstrand）

总是滞后一步合成的链后随链（laggingstrand）

后随链不连续合成形成的短DNA片段，称为冈崎片段（Okazakifragment）

第二节

参与DNA复制的有关物质

基本过程：

双螺旋解旋

超螺旋的松弛

复制的起始和调控

新链的合成

复制的终止

1解螺旋酶（Helicase）

DNA解螺旋酶（helicase）（解链酶）

功能：

DNA的双螺旋解链，解开一对碱基，需2分子ATP

作用点：

DNA上局部单链处，向双链方向解链。

种类：

DnaB、PriA、Rep蛋白（E.coli）

2单链DNA结合蛋白（SSB）

（singlestrandDNAbindingprotein）

SSB能很快地和单链DNA结合，防止其重新配对形成双链DNA或被核酸酶降解。

特点1、协同结合（cooperativebinding）

2、重复利用

3DNA拓扑异构酶

（DNATopisomerase）

DNA拓扑异构酶有两类，E.coli的ε蛋白是一种典型的拓扑异构酶Ⅰ

E.coli中的DNA旋转酶（DNAgyrase）则的典型的拓扑异构酶Ⅱ

4引物酶（primase）

所有的DNA聚合酶都需要3’羟基起始DNA合成

引发末端可以由RNA引物、DNA切口或引发蛋白提供

就DNA复制而言，引物酶（dnaG基因产物）合成RNA链，它提供引发末端

引物酶可以看作是一种特殊的RNA聚合酶，但二者是有明显区别的。

[1]引物酶对雷米封不敏感，而RNA聚合酶则敏感;

[2]引物酶既可以利用核糖核苷酸，也可利用脱氧核糖核苷酸，而RNA聚合酶只能利用核糖核苷酸;

[3]引物酶只在复制起点处合成RNA引物而引发DNA的复制，而RNA聚合酶则是启动DNA转录。

5大肠杆菌DNA聚合酶（DNAPolymerase）

DNA聚合酶的一般结构

“右手”结构：

拇指（thumb）

手指（finger）

手掌（palm

DNA位于手掌上由拇指和手指形成的槽中

5.1DNA聚合酶Ⅰ（Kornberg酶）

（DNApolymeraseⅠ,DNApolⅠ）

PolI的理化性质

单体蛋白；含有一个二硫键和一个-SH基。

每个酶分子中含有一个Zn2+，在DNA聚合反应起着很重要的作用。

Klenow片段

PolI的功能

[1]聚合作用　

[2]3‘→5’外切酶活性──校对作用

细菌DNA聚合酶仔细检查延长末端的碱基对，如果错误会予以切除

是所有DNA聚合酶的共同特性

DNA聚合酶的校对功能

校对（proofreading）：

指在核酸或蛋白质合成过程中，在碱基或氨基酸已经加入链中后，对其进行识别并纠正错误的任何机制。

[3]5‘→3’外切酶活性──切除修复作用

（切除冈崎片段DNA末端的RNA引物）

DNApolⅠ不是大肠杆菌中DNA复制的主要聚合酶！

证据如下：

[1]纯化的DNApolⅠ催化dNTP掺入的速率为667碱基/分，而体内DNA合成速率要比此高二十倍.

[2]大肠杆菌的一个突变株中，此酶的活力正常，但染色体DNA复制不正常;而在另一些突变株中，DNApolⅠ的活力只是野生型的1%，但是DNA复制却正常，而且此突变株增加了对紫外线、烷化剂等突变因素的敏感性。

这表明该酶与DNA复制关系不大，而在DNA修复中起着重要的作用

5.2DNA聚合酶Ⅱ

DNApolⅡ，MW为120KD，每个细胞内约有100个酶分子，但活性只有DNApolⅠ的5%。

催化特性

（1）聚合作用

（2）有3‘→5’外切酶活性，无5‘→3’外切酶活性。

（3）不是复制的主要聚合酶，可能在DNA的损伤修复中起到一定的作用。

5.3DNApolⅢ

DNApolⅢ有3‘→5’外切酶活性,无5‘→3’外切酶活性

DNA聚合酶Ⅲ是细胞内DNA复制所必需的酶

DNA聚合酶III全酶

DNApolymeraseIIIholoenzyme:

为一多亚基复合体，是一个二聚体

包含10个蛋白质，组成四个亚复合体

催化核心：

α亚基:

DNA聚合酶活性

ε亚基：

3’－5’校正作用的外切核酸酶

θ亚基：

刺激核酸外切酶活性

τ亚基：

将两个催化核心连接到一起

β亚基：

有前进能力，负责保持催化核心和模板链的结合，组成夹钳（clamp）

γ复合体：

组成夹钳装载机（clamploader）,使β亚基结合到DNA上。

6DNA连接酶

DNA连接酶（以AMP为中间体）封闭邻近的核苷酸之间的缺口

冈崎片断的合成需要起始引发、延伸、RNA去除、填补间隙和切口连接

DNA修复中产生的缺口由DNAligase封闭

真核生物细胞中也存在DNA连接酶，有两种，分别为连接酶Ⅰ和Ⅱ，反应需ATP供能。

DNA连接酶Ⅰ分子量约为200KD，主要存在于生长旺盛细胞中。

DNA连接酶Ⅱ分子量约85KD，主要存在于生长于不活跃的胞中（restingcell）。

第三节

细菌DNA的复制（原核生物）

1.起始（initiation）

2.解旋（unwinding）

3.延伸（elongation）

4.终止与分离（termination&segregation）

1:

起始（Initiation）

E.coli的起始点位于遗传基因座oriC,并与细胞膜相连。

复制起始以复合物形式开始。

需要6个蛋白质：

DnaA、DnaB、DnaC、HU、DnaG和SSB

起始过程：

DnaA单体识别并结合于9bp重复序列；

20-40个DnaA单体形成大的聚合体，oriC缠绕在外面；

DnaA蛋白使13bp序列熔解；

DnaB和DnaC进入熔解区，形成前引物复合物（preprimingcomplex），DnaB使DNA形成两个复制叉；

DnaG进入，合成引物

起始点的最短长度是由13bp＆9bp的重复序列外边界之间的距离所决定的。

2:

解旋（Unwinding）

正超螺旋（Positivesupercoiling）

通过II型拓扑异构酶即DNA解旋酶（DNAgyrase）作用引入负超螺旋而得到不断释放

复制体（replisome）

主要蛋白

DnaB解螺旋酶

gyrase旋转酶

PolIII复制酶

DnaG引物酶

SSB保持单链伸展

3:

延伸

Elongation

1.引发体：

包含DnaB解旋酶