9第八章 生物氧化Word格式.docx

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（一）复合体I将NADH+H＋中的电子传递给泛醌

复合体I又称NADH一泛醌还原酶或NADH脱氢酶，接受来自NADH+H+的电子并转移给泛醌（ubiquinone）。

在柠檬酸循环和脂肪酸β一氧化等过程的脱氢反应中，大部分代谢物脱下的2H是由氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamideadeninedinucleotide，NAD+）接受，形成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH+H＋）。

NAD+（图8-2）是脱氢酶类的辅酶，分子中烟酰胺芳环中的氮为五价，易接受电子被还原，还原时能接受2H中的双电子成为三价氮，同时芳环也接受一个氢质子进行加氢反应，为双电子传递体。

烟酰胺在加氢反应时只能接受1个氢质子和2个电子，游离出一个H+在溶液中，因此将还原型的NAD+写成NADH+H+（NADH）（图8-3）。

还原型NADH可失去电子被氧化而生成NAD+，其电子被复合体I接受并传递给泛醌。

复合体I由黄素蛋白（flavoprotein）、铁硫蛋白（iron-sulfurprotein）等蛋白及其辅基组成，呈L形，一端突出于线粒体基质中，包括黄素蛋白及黄素单核苷酸（flavinmononucleotide，FMN）辅基和2个铁硫中心（iron-sulfurcenter,Fe-S）辅基、铁硫蛋白及其3个Fe-S辅基；

嵌于内膜的横臂为疏水蛋白部分，也含1个Fe-S辅基。

所以，黄素蛋白和铁硫蛋白都能通过辅基发挥传递电子作用。

FMN分子中含核黄素（维生素B2），结构中的异咯嗪环可接受1个质子和1个电子形成不稳定

第八章生物氧化177

的FMNH·

，再接受1个质子和1个电子转变为还原型FMNH2。

反之，FMNH2氧化时也逐步脱去电子和质子，属于单、双电子传递体（图8-4）。

氧化呼吸链含有多种铁硫蛋白，其中的Fe离子通过与无机硫（S）原子或（和）铁硫蛋白中的半胱氨酸残基的S原子相连，形成铁硫中心。

（Fe-S，图85）。

Fe一S可有多种形式，最简单的铁硫中心是1个Fe离子与4个半胱氨酸残基的S原子相连，而复杂的铁硫中心可以含2个、4个Fe离子并通过无机S原子及半胱氨酸残基的S原子相连（如Fe2S2，Fe4S4）·

铁硫中心的铁离子可进行Fe2+→Fe3++e一的可逆反应，每次传递一个电子，因此铁硫蛋白为单电子传递体。

复合体I中黄素蛋白辅基FMN从基质中接受还原型NADH中的2个质子和2个电子生成FMNH2，经一系列铁硫中心，再经位于线粒体内膜中疏水蛋白的铁硫中心将电子传递给内膜中的泛醌。

泛醌又称辅酶Q（coenzymeQ，CoQ，Q），是一种小分子、脂溶性醌类化合物。

泛醌结构中含多个异戊二烯单位形成较长的疏水侧链。

人的CoQ侧链含10个异戊二烯单位，用CoQ10（Q10）表示。

泛醌脂溶性强，能在线粒体内膜中自由扩散，不包含在上述复合体中。

泛醌和FMN

178第二篇物质代谢及其调节

类似，能进行可逆的电子传递，有3种氧化还原状态，接受1个电子和1个质子还原成半醌型泛醌（QH·

），再接受1个电子和1个质子还原成二氢泛醌（QH2），后者可逆向逐步失去质子和电子再被氧化为泛醌（图8-6）。

由于泛醌能在线粒体内膜中自由移动，同时传递氢和电子，可在各复合体间募集并穿梭传递还原当量，在氧化呼吸链中具有重要作用，同时还在下述的电子传递和质子移动的偶联中起着核心作用。

复合体I可催化两个同时进行的过程：

将一对电子从还原型的NADH传递给泛醌的过程中，可同时偶联质子的泵出过程，将4个H+从内膜基质侧（negativeside，显负电,N侧）泵到内膜胞质侧（positiveside,显正电,P侧），故复合体I有质子泵功能，泵出质子所需的能量来自电子传递过程。

（二）复合体II将电子从琥珀酸传递到泛醌

复合体II是柠檬酸循环中的琥珀酸脱氢酶，又称琥珀酸一泛醌还原酶，其功能是将电子从琥珀酸传递给泛醌。

人复合体II又称黄素蛋白2（FP2），由4个亚基组成，其中2个小疏水亚基，将复合体锚定于内膜；

另外2个亚基位于基质侧，含底物琥珀酸的结合位点、3个铁硫中心辅基和1个黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）辅基。

FAD的结构母核与FMN相同，也是通过异咯嗪环进行电子传递。

琥珀酸的脱氢反应使FAD转变为还原型FADH2，后者再将电子传递到铁硫中心，然后传递给泛醌。

该过程传递电子释放的自由能较小，不足以将H+泵出线粒体内膜，因此复合体II没有H＋泵的功能。

代谢途径中另外一些含FAD的脱氢酶，如脂酰CoA脱氢酶、α一磷酸甘油脱氢酶、胆碱脱氢酶，可以不同方式将相应底物脱下的2个H`和2个电子经FAD传递给泛醌，进入氧化呼吸链。

（三）复合体III将电子从还原型泛醌传递至细饱色素c

泛醌从复合体I或II募集还原当量并穿梭传递到复合体III，后者再将电子传递给细胞色素c，因此复合体皿又称泛醌一细胞色素c还原酶。

人复合体III含有细胞色素b（b562，b566）、细胞色素c1和一种可移动的Rieske铁硫蛋白（Rieskeiron-sulfurprotein）。

细胞色素（cytochrome,Cyt）是一类含血红素样辅基的电子传递蛋白，血红素样辅基中的铁离子可通过Fe2+→Fe2++e一反应传递电子，为单电子传递体。

还原型细胞色素均有特征的α、β、γ三个可见吸收峰。

而氧化型细胞色素吸收峰和还原型的相比有明显改变，可作为分析细胞色素种类和状态的重要指标。

根据它们吸收光谱和最大吸收波长不同，可将线粒体的细胞色素分为细胞色素a,b,c（Cyta,Cytb,Cytc）三类，及不同亚类。

各种细胞色素光吸收性质不同是由于辅基铁卟啉环的侧链以及血红素所处分子环境各有不同。

细胞色素b的铁卟啉是铁一原卟啉IX，与血红蛋白的血红素相同，称为血红素b（图8-7）；

而细胞色素a中铁一原卟啉IX环含有甲酰基，1个乙烯基侧链连接的聚异戊二烯长链，称血红素a（图8-7）。

细胞色素a和b中的血红素与其蛋白质通过非共价键结合，但为紧密连接。

细胞色素c中，铁一原卟啉IX的乙烯侧链通过共价键与蛋白质部分的半胱氨酸残基的疏基相连，称血红素c（图8-8）。

人复合体III为二聚体，呈梨形。

每个单体中有11个亚基，其功能区包括3部分：

细胞色素b,细胞色素c1，和铁硫蛋白。

其中细胞色素c1和铁硫蛋白都有球形结构域，并以疏水区段锚定在线粒体内膜。

细胞色素b亚基结合2个不同血红素辅基，一个还原电位较低称CytbL，根据吸

第八章生物氧化179

收波长称Cytb566,,，另一个电位较高称CytbH,，根据吸收波长称Cytb562，位置接近于内膜基质侧。

复合体III还有2个泛酪结合位点，分处内膜胞质侧和基质侧，称为QP和QN位点。

复合体III的电子传递过程通过“Q循环”（Qcycle）实现。

“Q循环”是为了实现双电子传递体泛酿与单电子传递体细胞色素之间的电子传递，是一个复杂的电子传递过程，最终将电子从泛酿经铁硫蛋白传递给Cytc1。

每2分子QH2通过Q循环，生成1分子QH2和1分子Q.将2个电子传给2分子Cytc1，同时复合体III向膜间隙释放4H十。

CytC是氧化呼吸链唯一的水溶性球状蛋白，与线粒体内膜外表面疏松结合，不包含在上述复合体中。

Cytc从复合体III中的Cytc1获得电子传递到复合体IV。

（四）复合体IV将电子从细胞色索c传递给氧

人复合体IV又称细胞色素c氧化酶（cytochrome。

oxidase），将CytC的电子传递给分子氧，使其还原为H2O。

人复合体IV包含13个亚基，其中亚基I~III由线粒体基因编码，是还原当量传递的功能性亚基，其他10个亚基起调节作用。

亚基I呈圆柱形，含2个血红素辅基，分别称为Cyta和Cyta3，由a一螺旋结构支持。

另外还含1个Cu离子，称CuB。

细胞色素a3和CuB定位接近而形成1个Fe-Cu中心。

蛋白结合的Cu可发生Cu+→Cu2++e一的可逆反应，也属单电子传递体。

亚基II、III分别位于亚基I两侧，亚基II内膜膜间腔侧膜外域含桶状的10股β片层结构，通过2个半胱氨酸残基稳定结合2个Cu离子，称CuA，形成类似Fe2S2铁硫中心的结构。

而亚基III的功能主要与质子泵出有关。

复合体IV中含4个氧化还原中心，即2个血红素中心（Cyta,Cyta3）,2个Cu位点（CuACuB）。

其中CuA中心与Cyta中血红素的Fe定位极为接近，仅距1.5nm,电子可由CuA中心（2个Cu离子）传递到Cyta;

而Cyta3-CuB,形成一个Fe-Cu中心，这样就形成了2CuA和Cyta3-CuB两组电子传递单元，称为双核中心（binuclearcenter）功能单元。

复合体IV电子传递过程是在双核中心上进行（图8-9）。

Cytc供出的电子经CuA双核中心传递到Cyta，再到Cyta3-CuB双核中心。

需要依次传递4个电子，并从线粒体基质获得4个H+，

180第二篇物质代谢及其调节

最终将1分子O2还原成2分子H20（图8-9）。

其电子传递过程为：

Cyta传递第一个、第二个电子到氧化态的Cyta3-CuB,双核中心（Cu2十和Fe3+），经CuB。

到Cyta3，使双核中心的Cu2十和Fe3+被还原为Cu+;

Fe2+，并使双核中心结合O2分子，形成过氧桥连接的CuB。

和Cyta3，相当于2个电子传递给结合的O2。

中心再获得2个H+和第三个电子,O2分子键断开，Cyta3出现Fe4+中间态。

再接受第四个电子Fe4+还原为Fe3+并形成CuB2+和Cyta3的Fe3+各结合1个OH基团的中间态。

最后再获得2个H+，双核中心解离出2个分子H20后恢复初始氧化状态（图8-10）。

生成的H20通过亚基I、III间亲水通道排人膜间腔侧。

复合体Ⅳ也有质子泵功能，相当于每传递2个电子使2个H+跨内膜向膜间腔侧转移。

由于上述O2获得电子过程产生的具有强氧化性的.O2-和O2-2中间物始终和双核中心紧密结合，不会引起对细胞组分的损伤。

二、NADH和FADH2是氧化呼吸链的电子供体

营养物质的分解代谢中，大部分脱氢酶以NAD+，NADP+，FMN或者FAD为辅酶，用来接受从底物上脱下来的成对氢，生成还原态的NADH+H+，NADPH+H+，FMNH2和FADH2图8-3和8-4）。

还原态的NADH和NADPH都是水溶性的电子载体，由于氧化呼吸链的复合体I即为NADH脱氢酶，可使线粒体NADH所携带的还原当量通过氧化呼吸链彻底氧化并释能，而NADPH的还原当量主要用于合成代谢反应。

FMN或FAD是氧化呼吸链复合体中黄素蛋白的辅基，能通过氧化还原态的变化进行电子传递。

由于复合体II是柠檬酸循环中的琥珀酸脱氢酶，通过结合底物琥珀酸并将其还原当量传递给FAD，生成的FADH2直接进人呼吸链进行氧化释能。

因此NADH和FADH2是氧化呼吸链的电子供体。

根据电子供体及其传递过程，目前认

第八章生物氧化181

为，氧化呼吸链有两条途径：

一条称为NADH氧化呼吸链，该途径以NADH为电子供体，从NADH+H+开始经复合体I到O2而生成H2O。

电子传递顺序是：

NADH→复合体I→COQ→复合体Ⅲ→Cytc-→复合体Ⅳ→O2

另一条称为FADHZ氧化呼吸链，也称境拍酸氧化呼吸链，以FADH2为电子供体，经复合体B到OZ而生成Hz0o电子传递顺序是：

JIM酸。

复合体]I-+COQ-+复合体In-+Cytc--复合体W-.OZ

呼吸链各组分的排列顺序是由下列实验确定的：

①根据呼吸链各组分的标准氧化还原电位进行排序。

简单来讲，标准氧化还原电位E0（单位：

电压Volts）是指在特定条件下，参与氧化还原反应的组分对电子的亲和力大小。

电位高的组分对电子的亲和力强，易接受电子。

相反，电位低的组分倾向于给出电子。

因此，呼吸链中电子应从电位低的组分向电位高的组分进行传递（表8-2）。

②底物存在时，利用呼吸链特异的抑制剂阻断某一组分的电子传递，在阻断部位以前的组分处于还原状态，后面的组分处于氧化状态。

根据各组分的氧化和还原状态吸收光谱的改变分析其排列次序。

③利用呼吸链各组分特有的吸收光谱，以离体线粒体无氧时处于还原状态作为对照，缓慢给氧，观察各组分被氧化的顺序。

④在体外将呼吸链拆开和重组，鉴定四种复合体的组成与排列。

182第二篇物质代谢及其调节

第二节氧化磷酸化将氧化呼吸链释能与ADP

磷酸化偶联生成ATP

在机体能量代谢中，ATP作为能量载体分子，是体内主要供能的高能化合物。

细胞内由ADP磷酸化生成ATP的方式有两种，一种是与脱氢反应偶联，直接将高能代谢物分子中的能量转移至ADP或GDP），生成ATP（或GTP）的过程，称为底物水平磷酸化，已在糖代谢中叙述。

而ATP形成的主要方式是氧化磷酸化（oxidativephosphorylation），即由代谢物脱下的氢，经线粒体氧化呼吸链电子传递释放能量，此释能过程与驱动ADP磷酸化生成ATP相偶联，即还原当量的氧化过程与ADP的磷酸化过程相偶联，产生能量ATP。

因此又称为偶联磷酸化。

一、氧化磷酸化偶联部位在复合体I、Ⅲ、Ⅳ内

成对电子经氧化呼吸链传递所能合成ATP的分子数可反映该过程的效率。

理论推测的氧化呼吸链中偶联生成ATP的部位称为氧化磷酸化的偶联部位，可根据下述实验方法及数据大致确定。

（一）P/O比值

一对电子通过氧化呼吸链传递给1个氧原子生成1分子H2O，其释放的能量使ADP磷酸化合成ATP,此过程需要消耗氧和磷酸。

P/O比值是指氧化磷酸化过程中，每消耗1/2摩尔O2所需磷酸的摩尔数，即所能合成ATP的摩尔数（或一对电子通过氧化呼吸链传递给氧所生成ATP分子数）。

研究发现丙酮酸等底物脱氢反应产生NADH+H+，通过NADH氧化呼吸链传递，P/O比值接近2.5，说明传递一对电子需消耗1个氧原子且需消耗约2.5分子的磷酸，因此NADH氧化呼吸链可能存在3个ATP生成部位。

而琥珀酸脱氢时，P/O比值接近1.5，说明琥珀酸氧化呼吸链可能存在2个ATP生成部位。

根据NADH、琥珀酸氧化呼吸链P/O比值的差异，提示在NADH和泛醌之间存在1个ATP生成部位。

而抗坏血酸底物直接通过Cytc传递电子进行氧化，其P/O比值接近1，推测Cytc和O2之间存在1个ATP生成部位。

而另1个ATP生成部位应在泛醌和Cyt。

之间。

经实验证实，一对电子经NADH氧化呼吸链传递，P/O比值约为2.5，生成2.5分子的ATP；

一对电子经琥珀酸氧化呼吸链传递，P/O比值约为1.5，可产生1.5分子的ATP.

（二）自由能变化

根据热力学公式，pH7.0时标准自由能变化（△G）与还原电位变化（△E,标准还原电位表示物质对电子的亲和力，还原电位高更易于接受电子）之间有以下关系：

△G＝-nF△E

n为传递电子数;

F为法拉第常数（96.5kJ/mol·

V）。

从NAD＋到COQ段测得的还原电位差约0.36V，从COQ到Cytc电位差为0.19V，从Cyta,a3到分子氧为0.58V，分别对应复合体I、Ⅱ、Ⅳ的电子传递。

计算结果，它们相应释放的△G分别约为69.5、36.7、112kJ/mol，而生成每摩尔ATP需能约30.5kJ（7.3kcal），可见复合体I、Ⅱ、Ⅳ传递一对电子释放的能量足够用于生成ATP所需的能量。

说明以上三部位各存在1个ATP的偶联部位。

这里讲的偶联部位并非意味着这三个复合体是直接生成ATP的部位，而是指经由这三个复合体的电子传递所释放的能量具有合成ATP的能力。

由于不同复合体的电势能不同，我们可以将它们形象的比喻为由不同的蛋白质复合体组成的一个“生物电场”。

电子的传递过程就是由低电势向高电势泳动的过程。

而电子传递所释放的电势能就转变为跨线粒体内膜的质子浓度梯度，驱动ATP合成。

二、氧化磷酸化偶联机制是产生跨线粒体内膜的质子梯度

1961年英国科学家P.Mitchell提出的化学渗透假说（chenmiosmotichypothesis）阐明了氧化磷

第八章生物氧化183

酸化偶联机制。

其基本要点是电子经氧化呼吸链传递时释放的能量，通过复合体的质子泵功能，驱动H十从线粒体基质侧泵出至内膜的膜间腔侧。

由于质子不能自由穿过线粒体内膜返回基质，这种质子的泵出引起内膜两侧的质子浓度和电位的差别（膜间腔侧质子的浓度和正电性高于线粒体基质），从而形成跨线粒体内膜的质子电化学梯度（H＋浓度梯度和跨膜电位差），储存电子传递释放的能量。

当质子顺浓度梯度回流至基质时驱动ADP与Pi生成ATP。

如一对电子自NADH传递至氧可释放约-220kJ/mol的能量，同时将10个H+从基质转移至内膜膜间腔侧，形成的H＋梯度储存约-200kJ/mol，当质子顺浓度梯度回流时用于驱动ATP合成。

框8一1化学渗透理论阐明了氧化磷酸化偶联机制

英国学者P.Mitchell获得1978年诺贝尔化学奖，表彰他创建的化学渗透理论阐明了氧化磷酸化的偶联机制。

他提出电于传递能量驭动质子从线粒体基质转移到内膜外，形成跨内膜质子梯度，储存能量，泵出的质子再通过ATP合酶内流释能催化ATP合成。

该理论解释了氧化磷酸化中电子传递链蛋白、ATP合酶在基质内膜分布的意义及其如何利用质子作为能源。

这一理论是解决生物能学难题的重大突破，并更新了人们对涉及生命现象的生物能储存、生物合成、代谢物转运、膜结构功能等多种问题的认识。

化学渗透假说已经得到广泛的实验支持：

①氧化磷酸化依赖于完整封闭的线粒体内膜；

②线粒体内膜对H十、OH-、K+、C1-离子是不通透的；

③电子传递链可驱动质子移出线粒体，形成可测定的跨内膜电化学梯度；

④增加线粒体内膜外侧酸性可导致ATP合成，而阻止质子从线粒体基质泵出，可降低内膜两侧的质子梯度，虽然电子仍可以传递，但ATP生成却减少。

氧化呼吸链电子传递过程驱动质子从线粒体基质侧转移到膜间腔侧的机制虽已有叙述，但还不完全清楚。

实验证实电子传递过程复合体I、Ⅲ和Ⅳ有质子泵功能，一对电子经这些复合体传递分别向内膜膜间腔侧泵出4H+,4H+和2H+。

图8-11归纳了氧化呼吸链电子传递和氧化磷酸化的过程。

184第二篇物质代谢及其调节

三、质子顺浓度梯度回流释放能量用于合成ATP

由呼吸链中复合体质子泵作用形成的跨线粒体内膜的H十浓度梯度和电位差，储存电子传递释放的能量。

当质子顺浓度梯度回流至基质时，储存的能量被ATP合酶（ATPsynthase）充分利用，催化ADP与Pi生成ATP。

在线粒体内膜上的复合体V（complexV），即为ATP合酶。

ATP合酶是多蛋白组成的蘑菇样结构，含F1（亲水部分F1表示第一个被鉴定的与氧化磷酸化相关的因子）和F0（疏水部分，F0表示寡霉素敏感）两个功能结构域。

F1为线粒体基质侧的蘑菇头状突起，催化ATP合成；

而F0的大部分结构嵌人线粒体内膜中，组成离子通道，用于质子的回流。

动物细胞中，F1部分由α3β3γδε亚基复合体和OSCP,IF1等亚基组成，OSCP为寡霉素敏感蛋白（oligomycinsensitiveconferringprotein，OSCP，易与寡霉素结合而失去活性），F1可调节ATP合成。

α3β3亚基间隔排列，像橘子瓣样围绕γ亚基形成六聚体，每个β亚基有1个催化中心，用于ATP的合成，但β亚基必须与α亚基结合才有活性，因此αβ亚基配对结合，形成αβ功能单元。

F0镶嵌在线粒体内膜中，它由疏水的a、b2、c9-12亚基组成，形成跨内膜质子通道。

动物细胞F0还有其他辅助亚基。

c亚基由短环连接的2个反向跨膜α一螺旋组成,9一12个c亚基围成环状结构;

a亚基紧靠c亚基环外侧，由5个跨膜α一螺旋形成2个半穿透线粒体内膜的、不连通的亲水质子半通道，两个开口分别位于线粒体的基质侧和内膜的膜间腔侧，两个半通道分别与1个c亚基相对应（图8-12）。

目前认为,ATP合酶由F0和F1组装成可旋转的发动机样结构，完成质子回流并驱动ATP合成。

F0的2个b亚基通过长亲水头部域锚定于F1的α亚基，并通过δ亚基和α3β3稳固结合，而b亚基的疏水端锚定F0中的a亚基，使a、b2和F1中的α3β3、δ亚基组成稳定的定子部分。

F1部分γ和ε亚基共同形成中心轴，上端穿过α3β3的六聚体，γ可与β亚基疏松结合，下端伸人嵌

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于内膜的c亚基环装结构中并与之紧密结合，使c亚基环、，γ和ε亚基组成转子部分。

当质子顺梯度穿内膜向基质回流时，转子部分围绕定子部分进行旋转，使F1，中的αβ功能单元利用释放的能量结合ADP和Pi并合成ATP。

质子梯度强大势能驱动质子从a亚基胞质侧进人半通道，使对应的1个c亚基中的必需天冬氨酸残基Asp61所带负电荷被H+中和后,c亚基能与疏水内膜相互接触而发生转动，当其转到接触出口半通道相应c亚基位置时Asp61原结合的H＋从半通道出口顺梯度释放进人线粒体基质（图8-12）。

同理，各c亚基可依次进行上述循环，导致c环和γ、ε亚基相对α3β3转动。

在转动过程中，γ亚基依次和各β亚基接触，其相互作用发生周期性变化，并使每个β亚基活性中心构象循环改变。

P.Boyer提出了ATP合成的结合变构机制（bindingchangemechanism），p亚基有3种构象：

开放型（O）无活性，与ATP亲和力低；

疏松型（L）无活性，可与ADP和Pi底物疏松结合；

紧密型