整理基因克隆备课教案.docx

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整理基因克隆备课教案

备课教案

学年学期：

2011-2012秋季学期

课程名称：

基因克隆

主讲教师：

李海英

授课对象：

2009级生命科学学院本科

黑龙江大学

第1教学周/第3.4.5节（第1次课）

教学基本内容

备注

教学目的：

通过本章的学习，使学生掌握基因克隆、重组DNA等相关概念，同时介绍基因工程的发展简史和基因工程的巨大意义，引导学生对科学的严谨、谦虚态度。

教具：

多媒体课件

教学重点：

DNA嵌合体概念

课时安排：

3学时

教学难点：

基因克隆与基因表达的技术路线的区别

教学内容：

第一章绪论

一、基因工程的概念

1.基因工程（geneticengineering）、遗传工程、重组体DNA技术

2.嵌合DNA、DNA嵌合体（DNAchimera）

3.分子克隆（molecularcloning）、基因克隆（genecloning）、重组DNA（recombinantDNA）

4.基因工程的操作步骤

（1）基因克隆的操作步骤

（2）基因表达的操作步骤

二、基因工程发展简史

三、基因工程的巨大意义

1.利用微生物制药

（1）利用微生物生产胰岛素

（2）重组微生物生产生长激素

（3）重组微生物生产干扰素

2.克隆技术（clonetechnology）

（1）克隆的概念

（2）器官移植

（3）干细胞研究及人类伦理观念

3.基因工程育种

（1）基因改造的农作物

（2）转基因动物

四、基因工程的安全性问题

复习题

1、基因克隆与基因表达技术路线的区别。

2、收集整理有关转基因植物、转基因动物的报道和照片资料。

1、启发式教学内容：

启发学生的学习科学和实验操作的态度。

2、互动教学内容：

课堂讨论克隆的伦理道德问题。

3、启发式教学内容

通过对转基因植物和转基因动物的介绍，激发学生的学习兴趣。

第2教学周/第3.4.5节（第2次课）

教学基本内容

备注

教学目的：

本节主要讲述有关“限制性核酸内切酶”的相关知识，通过对大肠杆菌限制-修饰现象的讲解，引导学生探究宿主控制性限制的生物学机理；掌握各类限制性核酸内切酶的生物学功能和命名原则。

教具：

多媒体课件

教学重点：

Ⅱ型限制性核酸内切酶的特点和限制性核酸内切酶生物学功能的英文表述。

课时安排：

3学时

教学难点：

限制-修饰现象的理解

教学内容：

第二章基因工程的工具酶

第一节限制性核酸内切酶

一、限制性核酸内切酶的发现

1.发现过程

2.相关概念

（1）限制（restriction）

（2）修饰（modification）

（3）宿主控制性限制（host—controlledrestriction）

3.限制性核酸内切酶的生物学功能

Restriction-modificationsystemsoccurinmanybacterialspecies,andconstituteadefensemechanismagainsttheintroductionofforeignDNAintothecell.Theyconsistoftwocomponents;thefirstisarestrictionendonuclease,whichrecognizesashort,symmetricalDNAsequence,andcuts（hydrolyzes）theDNAbackboneineachstrandataspecificsitewithinthatsequence.ForeignDNAwillhencebedegradedtorelativelyshortfragments.Thesecondcomponentofthesystemisamethylase,whichaddsamethylgrouptoaCorAbasewithinthesamerecognitionsequencesinthecellularDNA.ThismodificationrendersthehostDNAresistanttodegradationbytheendonuclease.

二、限制性核酸内切酶的分类

1.Ⅰ型限制性核酸内切酶

2.Ⅱ型限制性核酸内切酶

（1）一般性质

（2）Ⅱ型酶的识别序列与切割作用

A.识别序列

B.平末端（blunt/flushend/termini）

C.粘性末端（sticky/cohesiveend/termini）

（3）Ⅱ型限制性内切酶的特点

（4）酶切位点的计算

3.III型限制性内切酶

三、限制性核酸内切酶的命名

复习题

一、填空题

1、完全的回文序列具有两个基本的特点，分别是（）和（）。

2、由于DNA是由4种碱基组成的，所以任何限制性内切核酸酶的切割频率的理论值应该是（）。

3、第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是（）。

4、核酸内切酶命名原则是，第一个大写字母取自（），第二、三两个字母取自（），第四个字母则用（）表示。

二、简答题

下面几种序列中，那些最有可能是Ⅱ类酶的识别序列，为什么？

GAATCG，AAATTT，GATATC，ACGGCA

1、课前提问

（1）DNA嵌合体概念

（2）基因克隆的操作步骤

（3）基因表达的操作步骤

2、通过对大肠杆菌限制-修饰现象的描述，引导学生探究其中的原因。

3、利用对Smith和Nathans获得1978年诺贝尔生物医学奖的介绍，激励学生探索生命的奥秘。

4、注意区别粘性末端和平末端、同裂酶和同尾酶两对概念。

第3教学周/第3.4.5节（第3次课）

教学基本内容

备注

教学目的：

通过本章的学习，使学生掌握天然DNA的制备、纯化和浓缩以及限制性内切酶反应系统的建立，本章重点内容是影响限制性核酸内切酶活性的各种因素，并要求学生掌握限制性核酸内切酶的星活性、限制性图谱等概念。

教具：

多媒体课件、教具

教学重点：

影响核酸内切限制酶活性的因素

课时安排：

3学时

教学难点：

DNA分子的限制性图谱的构建

教学内容：

第二章基因工程的工具酶

第二节DNA分子片段化

一、天然DNA的制备

1.天然DNA的来源

2.天然DNA的提取

二、DNA的纯化

三、DNA的浓缩

四、限制性核酸内切酶反应系统

1.限制性核酸内切酶反应缓冲液

2.单酶切法

3.双酶切法

4.部分酶切

5.DNA分子的限制性图谱

五、影响核酸内切限制酶活性的因素

1.性活性

2.DNA样品的纯度

3.DNA甲基化的程度

4.DNA的分子结构

5.侧翼序列长度

6.酶切反应缓冲液

7.酶切反应温度和时间

复习题

1.什么是限制性内切酶的星活性？

受哪些因素影响？

2.分别用EcoRⅠ、HpaⅡ、EcoRⅠ+HpaⅡ酶切一个DNA片段的三个样品，然后通过凝胶电泳分离DNA片段，溴化乙锭染色后观察DNA带型（如下图），请根据这些结果，绘制一个限制性图谱，要标明EcoRⅠ和HpaⅡ识别位点间的相对位置，以及它们之间的距离（kb）。

并请写出分析的过程

1、课前提问

Ⅱ型限制性核酸内切酶的特点。

2、互动教学内容：

让学生总结DNA的制备、DNA的纯化和DNA的浓缩三个概念的区别，引导学生利用比较的方法学习知识。

第4教学周/第3.4.5节（第4次课）

教学基本内容

备注

教学目的：

通过本章的学习，使学生掌握DNA聚合酶概念、分类、各种DNA聚合酶的性质和用途，以及对一些专业名词的正确理解，如间断、缺刻等。

教具：

多媒体课件

教学重点：

各种DNA聚合酶的性质和用途

课时安排：

3学时

教学难点：

用切口平移（缺口转移）方法标记DNA以及一些专业名词的正确理解。

教学内容：

第二章基因工程的工具酶

第三节DNA聚合酶

一、DNA聚合酶概述

1.DNA聚合酶（polymerase）的概念

2.DNA聚合酶的分类

（1）以DNA聚合酶I为代表的“合成型”；

（2）以klenow聚合酶为代表，只有聚合酶活性和部分外切酶的活性；

（3）逆转录酶类，以RNA作为聚合模板。

二、大肠杆菌DNA聚合酶I（全酶）

1.性质

2.用途：

用切口平移（缺口转移）方法标记DNA

三、大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow片段）

1.性质

2.用途

四、T4噬菌体DNA聚合酶

1.性质

2.用途

五、T7噬菌体DNA聚合酶

1.性质

2.主要用途

六、TaqDNA聚合酶

1.性质

2.用途：

用于PCR反应，使得PCR技术得以推广。

七、逆转录酶（reversetranscriptase）——（依赖于RNA的DNA聚合酶）

1.性质

2.用途

复习题

一、填空

1.T4DNA聚合酶与Klenow酶一样，具有5’→3’聚合酶和3’→5’外切酶两种活性，但它的3’→5’外切酶活性比Klenow酶强（）倍，T4DNA聚合酶作用于（）链的活性要强于（）链。

2.反转录酶除了催化DNA的合成外，还具有（）的作用，可以将DNA-RNA杂种双链中的（）水解掉。

二、判断题

1.反转录酶能够以单链RNA或DNA为模板，在引物的引发下合成一条互补的DNA链。

2.以RNA为模板，用反转录酶可同时产生单链和双链的cDNA，双链DNA是由自身引物引导合成。

三、问答题

如何利用T4NA聚合酶制备3’隐含末端或双链平末端？

1、课前提问：

（1）影响限制性核酸内切酶活性的因素有哪些？

（2）双酶切时有哪些是需要主义的问题？

2、启发式教学内容：

（1）启发学生比较间断（discontinuity）和缺刻（nick）两个概念。

（2）引导学生比较三类DNA聚合酶在作用方式上的差别。

3、课堂活动内容：

大肠杆菌DNA聚合酶I同时具有5ˊ→3ˊ方向的聚合酶活性和3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性，这意味着即使5ˊ→3ˊ方向的聚合酶活性新合成了DNA分子也会立即被其同时具有的3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性所降解。

真实情况是这样的吗？

4、课堂互动内容

自1983年PCR技术问世年到发明人Dr.KaryMullis1993年获得诺贝尔化学奖经历了10年的时间，那么一项技术得到广泛应用、认同需要什么？

第5教学周/第3.4.5节（第5次课）

教学基本内容

备注

教学目的：

通过对本次课的学习，重点使学生掌握锚定PCR、不对称PCR和反向PCR三种特殊的聚合酶链式反应以及一种分子标记技术——RAPD。

教具：

多媒体课件

教学重点：

三种特殊的聚合酶链式反应的原理

课时安排：

3学时

教学难点：

RAPD技术的基本原理

教学内容：

第二章基因工程的工具酶

第四节聚合酶链式反应及应用

一、锚定PCR

1.已知序列3’端区域的扩增

2.已知序列5’端区域的扩增

二、不对称PCR

三、反向PCR

第五节RAPD技术

一、多态性（polymorphism）

1.多态性/差异性的概念

2.多态性的种类

3.多态性产生的过程

4.多态性的相关技术

二、RAPD基本原理

三、技术问题

1.引物

2.Mg2+浓度要求

四、RAPD技术的应用

1.遗传指纹作图

2.检测遗传多样性与稳定性

复习题

1.生么情况下可以考虑使用不对称PCR?

2.反向PCR的原理？

3.RACE技术的原理？

1、课前提问：

（1）缺刻（nick）和间断（discontinuity）两个概念。

（2）比较各种DNA聚合酶的活性用什么不同之处。

互动内容：

提问常规PCR的原理，引导学生思考如果目的片段两侧的序列未知，而是只知道目的片段中间的一部分的序列信息，用什么方法可以获得目的片段？

第6教学周/第3.4.5节（第6次课）

教学基本内容

备注

教学目的：

通过对本次课的学习，重点使学生掌握DNA连接酶相关知识，如DNA连接酶的特性、粘性末端连接技术、连接反应的建立等。

教具：

多媒体课件

教学重点：

DNA连接酶的功能和粘性末端连接技术

课时安排：

3学时

教学难点：

粘性末端连接技术

教学内容：

第二章基因工程的工具酶

第六节DNA连接酶（ligase）

一、连接酶反应

1.间断修复功能

2.连接功能

二、常用的DNA连接酶

1.E.coliDNA连接酶

2.T4DNA连接酶

T4DNAligaserepairsbreaksinadsDNAbackboneandcancovalentlyrejoinannealedcohesiveendsinthereverseofarestrictionenzymereaction,　tocreatenewDNAmolecules.T4ligasecanevenligateonebluntendtoanother,　albeitwithratherlowerefficiency.

3.RNA连接酶

三、粘性末端连接技术

1、衔接体（linker）技术

2、结合体（adaptor）技术

3、同聚体（homopolymer）加尾技术

第七节结合体技术的应用—AFLP

一、概述

二、基本原理

AFLPtechnologyisbasedontheselectiveamplificationofgenomicrestrictionfragmentusingPCR.DNAisdigestedwithrestrictionendonucleases,anddouble-strandedDNAadaptersareligatedtotheendsoftheDNAfragmentstogeneratetemplateDNAforamplification.Thus,thesequenceoftheadapersandtheadjacentrestrictionsiteserveasprimerbindingsitesforsubsequentamplificationoftherestrictonfragmentsbyPCR.Selectivenucleotidesextendingintotherestrictionfragmentsareaddedtothe3’endsofthePCRprimerssuchthatonlyrestrictionfragmentsinwhichthenucleotideflankingtherestrictionsitematchtheselectivenucleotidewillbeamplified.Theamplifiedfragmentsarethenanalyzedbygelelectrophoresistogeneratethefingerprint.

三、技术特点

四、主要应用

复习题（填空题）

（1）为了防止DNA的自身环化，可用（）脱去双链DNA（）。

（2）欲将某一具有突出单链末段的双链DNA分子转变成平末段的双链形式，统常可采用（）和（）的作用。

2、判断题

（1）T4DNA连接酶和E.coli连接酶都能催化平末端和粘性末端的连接。

（2）T4DNA连接酶和E.coli连接酶都能催化双链DNA和单链DNA连接。

课前提问：

1、反向PCR？

2、RAPD的原理？

课堂互动内容

1.启发学生思考DNA连接酶和DNA聚合酶的功能差别。

2.为什么在基因克隆中连接酶是另一个重要的工具酶？

3.为什么粘性末端要比平末端的连接效率要高？

课堂互动内容：

粘性末端的连接效率远远高于平末端的连接，但在基因工程操作中得到的片段往往都是平末端的，同学们能否想出一些办法，将本是平末端的连接转变成粘性末端的连接呢？

第7教学周/第1.2.3节（第7次课）

教学基本内容

备注

教学目的：

本节课主要讲述核酸修饰酶（如未端转移酶、碱性磷酸酶、多核苷酸激酶等）、单链核酸内切酶（如S1核酸酶和Bal31核酸酶等）以及核酸外切酶等基因工程常用酶，使学生掌握这些酶的生物学活性，明确这些酶在基因工程中的应用。

教具：

多媒体课件

教学重点：

核酸修饰酶和单链核酸内切酶生物学活性

课时安排：

3学时

教学难点：

核酸修饰酶的应用

教学内容：

第八节基因工程的其它酶类

一、核酸修饰酶

1.未端（脱氧核苷酸）转移酶

2.碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）

3.多核苷酸激酶（polynucleotidekinase）

二、单链核酸内切酶

1.S1核酸酶

2.Bal31核酸酶

三、核酸外切酶（exonucleases）

1.核酸外切酶VII（exoVII）

2.核酸外切酶III（exoIII）

3.λ核酸外切酶（λexo）

4.T7基因6核酸外切酶

复习题

1.欲将某一具有突出单链末段的双链DNA分子转变成平末段的双链形式，统常可采用（）和（）的作用。

2.为了防止DNA的自身环化，可用（）脱去双链DNA（）。

3.、简答题

按适当的顺序，列出将一种mRNA的cDNA克隆到表达载体所用到的酶。

课前提问：

1、AFLP技术的英文表述？

2、衔接体（linker）、结合体（adaptor）、同聚体（homopolymer）加尾等技术。

课堂互动内容

在基因操作中，常常会遇到不希望发生连接作用的互补粘性末端末端发生了自连作用，引导学生思考怎样才能避免这种情况的发生？

第8教学周/第3.4.5节（第8次课）

教学基本内容

备注

教学目的：

本章首先基因克隆技术做了概述讲述了基因工程载体的基本概念和载体的种类、性质。

着重介绍了质粒载体的概念、生物学特性、质粒的遗传与复制、构建质粒克隆载体的基本策略。

教具：

多媒体课件

教学重点：

质粒的生物学特性

课时安排：

3学时

教学难点：

构建质粒克隆载体的基本策略

教学内容：

第三章基因工程载体

第一节基因克隆技术概述

一、基因克隆技术

二、目的基因的取得

三、重组体的构建

1.载体的概念

2.载体的性质

四、转化及重组子筛选鉴定

1.转化（transformation）

2.重组子

3.重组子的筛选方法

第二节质粒载体（PlasmidVector）

一、质粒的概念

二、质粒的一般生物学特性

1.质粒DNA

（1）SC构型

（2）OC构型

（3）L型

2.质粒的复制与遗传

3.构建质粒克隆载体的基本策略

4.质粒的改造

复习题

1、基因克隆技术的一般过程？

2、在琼脂糖凝胶电泳中，质粒DNA的SC型、OC型和L型是如何分布的？

3、质粒载体必须具备的4个特性？

4、构建质粒克隆载体的基本策略？

课前提问：

采取什么措施可以防止接头发生自连作用？

课堂互动内容：

基因工程操作为什么要用到载体？

课堂互动内容：

转化子与重组子的区别？

课堂互动内容：

质粒DNA在琼脂糖凝胶上会呈现出几条带？

为什么？

第9教学周/第3.4.5节（第9次课）

教学基本内容

备注

教学目的：

本章主要讲述pBR322质粒载体、pUC质粒载体、TA克隆载体和酵母中的质粒载体等内容。

要求学生重点掌握pBR322质粒载体的构建、pUC质粒载体的结构和TA克隆载体的构建等内容。

教具：

多媒体课件

教学重点：

pBR322质粒载体的构建、pUC质粒载体的结构和TA克隆载体的构建

课时安排：

3学时

教学难点：

pBR322质粒载体的构建

教学内容：

第二节质粒载体（PlasmidVector）

三、常用的质粒载体

1.pBR322质粒载体

（1）标准的质粒载体命名法则

（2）pBR322质粒载体的物理图谱

（3）pBR322质粒载体的构建

（4）pBR322质粒载体的优点

2.pUC质粒载体

（1）概述

（2）pUC质粒载体的结构

（3）pUC质粒载体的优点

3.TA克隆载体

4.酵母中的质粒载体

复习题

1.在质粒中如何增减酶切位点？

2.构建质粒载体的基本原则是什么？

课前提问：

1.克隆基因的一般过程？

2.重组子、转化子、转化。

3.构建质粒克隆载体的基本策略？

课堂互动内容

“pBR”是指“细菌抗药性质粒”吗？

第10教学周/第3.4.5节（第10次课）

教学基本内容

备注

教学目的：

本章主要内容为噬菌体的生物学、λ噬菌体克隆载体、柯斯克隆载体、人工染色体克隆载体等内容，要求学生重点掌握λ噬菌体克隆载体的相关知识以及温和噬菌体、溶源性细菌、溶源化、整合、原噬菌体和YAC、BAC等概念。

教具：

多媒体课件

教学重点：

λ噬菌体克隆载体

课时安排：

3学时

教学难点：

λ噬菌体克隆外源DNA的策略

教学内容：

第三节其他克隆载体

一、噬菌体概述

1.噬菌体的基本特征

2.噬菌体的结构及其核酸类型

3.噬菌体的感染性

（1）噬菌体的溶菌生命周期

（2）噬菌体的溶源周期

①温和噬菌体（temperatephage）

②溶源性细菌（lysogen）

③溶源化（lysogenization）

④整合（intergration）

⑤原噬菌体（prophage）

二、λ噬菌体克隆载体

1.与构建克隆载体相关的λ噬菌体性质

2.λ噬菌体作为构建克隆载体材料的依据

3.构建λ噬菌体克隆载体的基本策略

4.λ噬菌体克隆载体的主要类型

5.λ重组体DNA的体外包装

6.λ重组体分子的选择方法

7.λ噬菌体克隆载体的应用

三、柯斯（cosmid）克隆载体

四、人工染色体克隆载体

1.酵母人工染色体载体（yeastartificialchromosome，YAC）

2.细菌人工染色体（bacterialartificialchromosome，BAC）

复习题

1、如何将野生型的λ噬菌体改造成为一个理想的载体？

2、为什么野生型的λ噬菌体不宜作为基因工程载体？

3、什么是YAC?