一氧化碳中毒小鼠脑HO1的表达变化及其与脑细胞凋亡的关系.docx

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一氧化碳中毒小鼠脑HO1的表达变化及其与脑细胞凋亡的关系

一氧化碳中毒小鼠脑HO-1的表达变化及其与脑细胞凋亡的关系

独创性声明

本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。

据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。

与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。

学位论文作者签名：

垒竖生．

签字日期：

兰丝璧年』月坐日

学位论文版权使用授权书

本学位论文作者及指导教师完全了解大连医科大学有关保留、使用学位论文的规定，同意大连医科大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。

本人授权大连医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。

论文作者签名：

指导教师签名：

签字日期：

20

一氧化碳中毒小鼠脑HO．1的表达变化及其与脑细胞凋亡的关系

硕士生姓名：

赵林岩指导教师：

王苏平教授专业名称：

神经病学

摘要

背景：

一氧化碳中毒（co）是生活和生产中常见的中毒性疾病，严重危害人类的健康和生命。

急性一氧化碳中毒患者经过及时抢救治疗。

大多可以康复，但有部分患者在中毒症状缓解、意识恢复正常后，大约经历2到60天表现正常或基本正常的间歇期后，会再次出现‘。

系列脑病的

症状，称为一氧化碳中毒迟发性脑病（DEACMP）。

Uemura等报道，CO中毒死亡病人尸检发现皮层，基底节，海马，丘脑和小脑细胞凋亡与死广j共存，凋亡细胞以海马CA2区更为明显IlJ。

脑细胞坏死丰要发生在CO中毒所致的严重损伤之后，病变以炎性反应与组织损伤为特点IzJ，而CO中毒所致DEACMP则是经历一段“正常”时期后才出现，推测DEACMP症状的出现与CO中毒后神经组织细胞凋亡持续发生关系较大pl。

目前对血红素加氧酶（HO）的生物学特性已经有了较明确的认识，其在体内有三种存在形式，即HO．1、HO．2、HO．3。

其中HO一1为诱导型，各种理化因素的刺激导致的脑损伤时都可增加HO．1的表达。

在j下常的脑组织中，主要表达HO．2，HO．1表达很少，甚至不表达。

有文献报道【4，5】：

动物实验HO．1在缺氧缺血性脑病中与细胞凋亡相关联。

目的：

研究一氧化碳中毒后不同时间点小鼠脑内血红素加氧酶-l的表达变化；检测一氧化碳中毒后不同时间点小鼠脑内神经细胞凋亡及相关基因表达的情况。

探讨血红素氧化酶．1与脑细胞凋亡之间的变化关系。

进而推测一氧化碳中毒脑损伤的发病机制。

为进一步寻求临床治疗的新

途径提供理论依据。

方法：

雄性昆明小鼠，18～229，随机分为CO中毒组和空气对照组。

CO中毒组采用按体重（150ml／kg）每间隔6小时连续四次注射商纯度（99．9％）的CO气体致小鼠中毒改良模型进行染毒。

空气对照组采用按体重（150ml／kg）每间隔6小时连续四次注射空气。

应用苏木素一伊红染色观察海马区脑组织病理形态损伤；采用SABC免疫组化法研究HO-l、

Bel．2、Bax在蛋白水平的表达，于400倍光镜下计数5个视野平均阳性细胞数：

应用Westernblot法观察HO．1蛋白水平的表达。

应用流式细胞仪法检测凋亡细胞。

数据以均数±标准差表示，统计学处理采用SPSSl3．0软件进行t检验。

结果：

l、光镜下脑组织海马区的病理改变：

（1）空气对照组在各时间点脑组织切片染色未见明显改变。

（2）CO中毒组1d可见神经细胞肿胀，细胞数目略减少，细胞淡染；3d除上述变化外，可见部分坏死细胞，细糖核旅缩，细胞间隙扩大。

5d时上述现象进一步明显，海马区可见大量坏死细胞，细胞水肿加重。

21d时细胞水肿减轻，但仍可见部分坏死细胞。

2，免疫组化法HO．1蛋白表达情况：

空气对照组阳性细胞较少，染色较浅；CO中毒组，海马阳性细胞数较多，染色较深，且除Oh外，不同时间点阳性细胞数与对照组相比有统计学意义。

HO．1在ld表达增加（52．75+6．5）（p

3、Westernblot法HO．1蛋白表达情况：

空气对照组表达较少，CO

中毒组在1d表达增加（1．144-0．43）（p<0．01），3d达高峰（2．914-1，07）（p

与免疫组化法测

HO．1蛋白表达情况一致。

‘

4、细胞凋亡情况：

空气对照组各时间点细胞凋亡百分数较少，CO中毒组12h凋亡细胞百分数数增JJl]（21．954-24）（p<0．01），5d达高峰（34．274-4．19）（p<0．01），15d后减少（16．64-0．78）（p

5、凋亡相关蛋白表达：

Bax在中毒后表达增加，3d达高峰（34．54-0．58）

（p<0．01），之后略下降，Bcl．2在中毒后表达上升，3d减少至最低（12．54-3．69）（p

结论；1、正常小鼠海马区可有少量Ho—l表达，CO中毒小鼠HO．1

于免疫组化和Westenblot测定后表达明显增高。

2、正常小鼠海马区可有极少量调亡细胞，CO中毒小鼠海马区调亡细

胞明显增多，且与HO一1的表达变化一致。

3、HO．1表达增高可能参与了一氧化碳中毒所致脑损伤的发病机制，使凋亡相关蛋白表达发生变化，促使神经细胞发生调亡有关，进而为临床治疗提供新的思路。

关键词：

一氧化碳中毒血红素加氧酶．1神经细胞凋亡

凋亡调控基因小鼠

2

J1■^■ol·一

乙nangesolnemeoxYgenase-1andapoptosisaswellas

therelationshipbetweenthemfollowingcarbon

monoxidepoisoninginmice

Masterdegreecandidate：

ZhaoLinyanSupervisor：

ProfessorWangSupingMajor：

Neurology

Abstract

Background：

TheCarbonmonoxidepoisoningiscommoninlifeandproductionoftoxicdiseases，severelyendangeringhumanity’Shealthandlife．Theacutecarbonmonoxidepoisonpatientpassesthroughtheprompt

rescuetreatment，mostlymayberestoredtohealth，buthasapartofpatienttoalleviate，consciousnessafterthetoxicantsymptomrestoresnormally，probablyabout2—60daysexperiencenormalorthebasicnormalinterimperiod，canappearaseriesofbrainillnessoncemorethesymptom，knownascarbonmonoxidepoisoningdelayedencephalopathy（DEACMP）．Uemuraandotherreports，thepatientdiedofacuteCOpoisoningautopsyfoundthatthecortex，basalganglia，hippocampus，thalamusandcerebellumapoptosisanddeathcoexistence，CA2apoptosisinthehippocampusareamoreobviousit】．ThebraincellsnecrosisoccurredmainlyinaeuteCOpoisoning

causedbyaseriousinjury，diseaseandinflammatoryresponsetoinjuryforFeaturest引，andDEACMPiscausedbyacuteCOpoisoningExperiencea”normal”aperiod，tospeculateDEACMPsymptomsofCOpoisoningandtheemergenceofapoptosisofnervecellscontinuetotakeplaceiscontactedtogetherl3]．Atpresent，TheHemeoxygenase（HO）biologicalcharacteristicshaveamoreclearunderstandingofitspresenceinthebody．Ithasthree

kindsofexistenceforms，namelyHO一1，HO一2，HO一3．HO一1whichwasinduced．AvarietyofphysicalandchemicalfactorsstimulatedincreasedexpressionofHO．1．Inthenormalbraintissue，itmainlyexpressestheHO一2，HO-1expressionoflittleornoexpression．Someliteraturesreport14,5]inanimalexperimentsHO一1inhypoxicischemicencephalopathy

associatedwithapoptosis．

Objective：

studythecarbonmonoxidepoisoningatdifferenttime

3

pointsinmicebrainHemeoxygenase一1expressionchanges；Detectcarbonmonoxidepoisoningatdifferenttimepointsinmicebrainnervecellapoptosisandrelatedgeneexpressionsituation；Discussrelationsofheme

oxygenase-1andbraincellapoptosischanges．Furtherspeculatemechanismofencephalopathyofcarbonmonoxidepoisoning．Tofurtherexplorenewwaysofclinicaltreatmentandprovideatheoreticalbasis．

Methods：

Malemice，18～22g，weredividedintoCOpoisoninggroup

andaircontrolgroup．COpoisoninggroupwillbeinjectedbyusingtheweight（150ml／kg）everysixhoursforspacingfourthofhighpurity（99．9％）ofCOgasinmiceexposedtomodifiedmodel．AircontrolGroupwillbeinjectedbyusingofbodyweight（150ml／lkg）everysixhoursforspacingfourthofair．Thehippocampusbraintissuepathologicalformofinjurywasobservedbyhematoxylin—Yihongstaining．HO．1，Bcl一2，Baxinthelevel

ofproteinexpressionwereobservedbySABCimmunohistochemicalmethod．HO-1inthelevelofproteinexpressionwasobservedbyusingWesternblot．Cellapopsiswasdetectedbyflowcytometry．Underthe400timesthelightmicroscope，countinganaverageoffiveoutlookpositive

cells，alldataswereexpressedbymean4-sd．statisticalanalysissoftwareofSPSS13．0t—testwasemployed．

Results：

1、lightmicroscopehippocampusofthebraintissuepathologicalchanges：

（1）theairinthecontrolgroupeachtimepointbrainsliceswerenoobviouschanges．

（2）COpoisoningGroup1dayforeseableedemanervecells，slightlyreducingthenumberofcells，．cellswith

desalination；3daysinadditiontotheappeal，thevisiblepartofcellnecrosis，nuclearenrichment，expansionofspace；5daysofthisphenomenonfurtherclearthatthehippocampusoccurinthelargenumberofeellnecrosis，celledemaincrease．In21dayscelledemareduce．butthe

visiblepartofcellnecrosis．

2、ImmunohistochemicalmethodHO．1proteinexpression：

aircontrolgrouplesspositivecells；COpoisoninggroupmorepositivecellsinthehippocampus，HO-1expressionincreasedin1day（52．75+6．5）（p

（p

（p<0．01）．

4

3、WesternblotmethodHO-1proteinexpression：

aircontrolgrouptoexpressless，COpoisoninggroupin1dayHO一1expressionincreased（1．144-0．43）（p<0．01），reachedthepeak（2．91+1．07）（p

4、apoptosis：

aircontrolgroupatdifferenttimepointslessapoptosis，COpoisoninggroupthenumberofapoptosisincreasedin12h（21．95士24）（p<0．01），in5daysapoptosisreachedthepeak（34．27+4．19）（p

5、apoptosisrelatedproteinexpression：

Baxexpressionincreasedafterthepoisoning，reachedthepeakin3days（34．5+0．58）（p

Conclusion：

1、normalmicehippocampusmaybeasmallamountofHO-1expression，COpoisoninginmiceHO．1aftertwomethodsofexpressionincreasedsignificantly．

2、thenormalmicehippocampuscanbeaverysmallamountofapoptosisceils，COpoisoninginmicehippocampusapoptosiscellshavemarkedlyincreased，andwithHO．1expressionoftheagreement．

3、whichstronglysuggestedthatHO一1isasoociatedwiththemechanismsofbraindamagecausedbycarbonmonoxidepoisoning．HO．1makeschangetoproteinexpressionrelatedtoapoptosis．HO一1iscandidateforneuronalapoptosis．Thenfortheclinicaltreatmentofnewideas．

Keywords：

Carbonmonoxidepoisoninghemeoxygenase一1neuralapoptosisapoptosisgenemice

5

一氧化碳中毒小鼠脑Ho．1的表达变化及其与脑细胞凋亡的关系

硕士生姓名：

赵林岩指导教师：

王苏平教授专业名称：

神经病学

—‘上_．!

量

刖菁

一氧化碳（CO）是无色、无味、无臭、无刺激性的有毒气体，由于一氧化碳与血红蛋白的亲和力比氧与血红蛋白的亲和力大250．300倍，很短时间内80％．90％的一氧化碳即迅速取代氧和血红蛋白中的氧，从而使血液携氧能力下降，同时阻碍氧的解离，造成广泛的组织缺氧，导致以脑组织和心脏为主的多器官损伤[61。

一氧化碳中毒患者在经过数日后患者血浆中碳氧血红蛋白浓度正常，单纯的缺血缺氧机制并不能完全解释脑损伤的发病机制瞵j。

一氧化碳作为神经信使分子和NO有很多相似之处，两者都能激活可溶性鸟苷酸环化酶（sGC），从而催化三磷酸鸟苷（GTP）生成环鸟苷酸（eGMP）【9】；cGMP是细胞信号转导过程中起重要作用的第二信使，主要通过激活cGMP依赖性蛋白激酶（PKG），进而催化细胞内蛋白质磷酸化来改变蛋白质功能而发挥各种生理效应1101。

cGMP—PKG信号转导途径主要分布在心血管系统和脑内，在细胞分泌、松弛血管平滑肌、神经传导等许多方面都起重要作用，并通过磷酸二酯酶或调节离子通道Ca++的变化，促进脑神经细胞凋亡【11】。

近年对血红素加氧酶（Ho）的研究日益受到重视。

以往研究发现，内源性一氧化碳是生物活性气体，可能是一种新型的气体信史分子，在心血管、呼吸、消化、内分泌等系统发挥重要的生物效应，而且可能是一种新型的神经递质，在神经系统的病理生理过程中起重要作用。

而作为内源性一氧化碳产生的关键酶．HO在体内有三种存在形式，即Ho—l、HO一2、HO一3t12,13,14】，其中HO—l为诱导型，在生理情况下，HO．1在脑内无表达或微弱表达，各种理化因素（如热休克、缺血、谷光甘肽还原酶缺失、放射病、低氧、氧中毒和细胞转运障碍及细胞因子等）的刺激下，HO—l的表达增强f15J。

HO．1表达的变化可能参与缺氧性脑损伤的发病机

制。

6

腹腔注射高纯度的CO气体致小鼠中毒模型是近年来国内外应用较多的一种动物模型[161。

本研究采用按体重注射高纯度的CO气体致小鼠中毒改良模型。

采用westernblot、免疫组化、及流式细胞仪的方法观察一氧化碳中毒不同时间点小鼠海马区HO．1的表达变化，细胞凋亡及调空基因的变化，以及HE染色脑组织病理形态学变化，从而探讨CO中毒小鼠HO．1与脑细胞凋亡的变化关系，为CO中毒后脑损伤的可能机制提供理论依据。

为临床治疗寻找治疗新靶点。

材料与方法

一．实验动物、材料

（一）实验动物：

实验选用健康昆明小鼠（由大连医科大学动物实验室提供），体重

18．209，鼠龄2—3m，每笼5只温室饲养（温度在18～20℃）于昼夜节律

光照条件下，自由进食进水。

，（--1）主要试剂

～氧化碳气体99．9％大连大特气体有限公司提供血红素加氧酶．1兔抗鼠多克隆抗体武汉博士德生物制剂公司SABC免疫组化试剂盒武汉博士德生物制剂公司DAB显色试剂盒武汉博士德生物制剂公司丙烯酰胺（Acrylamide）Sigma公司

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