酶工程实习设计方案.docx
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酶工程实习设计方案
吉林农业大学
酶工程实习
设计方案
题目名称：
纤维素酶和果胶酶的固定化及性质研究
学生姓名：
院系：
生命科学学院专业班级：
指导教师：
职称：
讲师
2014年6月12日
1前言1
1.1纤维素1
1.2纤维素酶1
1.3酶的固定化技术1
1.4固定化的方法2
1.4.1吸附法2
1.4.2包埋法2
1.4.3共价结合法3
1.4.4交联法3
1.5实验目的及意义3
2仪器与试剂4
2.1试剂配制4
2.1.1缓冲溶液的配制4
2.1.2DNS显色剂4
2.1.3标准葡萄糖溶液的配制（1mg/ml）4
2.1.4海藻酸钠溶液的配制4
2.1.51.5%壳聚糖4
2.1.6酶液制备4
2.2仪器4
3方法与步骤5
3.1葡萄糖标准曲线的绘制5
3.2游离纤维素酶活力测定5
3.3固定化影响因素5
3.3.1固定化时间对酶固定化的影响5
3.3.2pH对酶固定化的影响6
3.3.3固定化时间对酶固定化影响6
3.4不同条件对酶反应的影响7
3.4.1温度对游离酶反应的影响7
3.4.2pH对游离酶反应的影响7
3.4.3底物浓度对游离酶反应的影响8
3.4.4温度对固定化酶反应的影响8
3.4.5pH对固定化酶活力的影响9
3.4.7底物浓度对固定化酶活力的影响10
3.5交联固定纤维素酶10
3.5.1戊二醛浓度对酶固定化的影响10
3.5.2交联时间对固定化的影响11
3.6壳聚糖吸附交联法固定化酶11
参考文献12
1前言
1.1纤维素
纤维素（C6H10O5）n。
一种天然有机高分子化合物。
由许多个D（+）-葡萄糖通过β-1,4糖甙键结合成的多糖,是构成植物细胞壁的主要成分。
纤维素和淀粉一样无还原性,不溶于水和一般有机溶剂,但溶于氢氧化铜的氨溶液、浓的氯化锌溶液、硫氰酸钙和某些盐类的饱和溶液。
棉花是最纯的天然纤维素,约含90%。
亚麻中约含80%,木材中约含50%。
纤维素加热到150℃以上可脱水逐渐焦化。
其水解较淀粉困难,一般在浓酸中或用稀酸在压力下进行。
水解过程中可得到纤维四糖、纤维三糖和纤维二糖等,最终产物是D（+）-葡萄糖。
与较浓的苛性碱溶液反应生成纤维素碱,与强氧化剂反应生成氧化纤维素、纤维素与浓硫酸和浓硝酸的混酸作用可生成硝酸纤维。
根据酯化程度的不同,含氮量13%左右的称作火棉,是制无烟火药的原料;含氮量11%左右的称作胶棉,是制造喷漆、胶片、赛璐路的原料。
在硫酸存在时,纤维素与乙酸酐作用,可得三乙酸纤维。
三乙酸纤维加水可分解为二乙酸纤维,可制造人造丝、胶片和塑料等,还可用来制取乙基纤维素、羧甲基纤维素等。
可由含纤维素多的木材、竹、麦杆、稻草、棉花等物质中提取。
1.2纤维素酶
催化纤维素水解的一组酶。
包括:
①内切β-1,4-葡聚糖酶（即Cx酶）,随机作用于天然结晶纤维素中的某些β-1,4-糖苷键,将纤维素切成较短的链;②β-1,4-葡聚糖纤维二糖水解酶（即C1酶）,作用于
Cx酶所切成的短链非还原末端,逐个切下纤维二糖;③β-葡萄糖苷酶（即纤维二糖酶）,将纤维二糖水解为葡萄糖。
纤维素酶可将纤维中的β-1,4-葡萄糖苷键水解,生成可溶性的聚合物及D-葡萄糖。
根据酶的来源,其相对分子质量最低为5000,最高达400000。
最适pH值为4.0～5.0。
最适温度40～60℃。
某些金属离子Mg2+、Cl2+及中性盐可使本酶活化,另外一些金属离子Ag2+、Cu2+、Mn2+、Hg2+和染料可使本酶失活。
1.3酶的固定化技术
是指通过物理化学方法如吸附、偶联交联、包埋等把酶做成仍具有酶催化活性的但不溶于水的固相酶。
这样既保持了酶高效、专一催化的特点,又提高了酶的稳定性,有利于酶的长期保存,反复使用,还增加了强度,适合于工业上管道化,自动化测定。
固定化酶技术是近20多年发展起来的新技术,现已应用于工业、医学、分析分离等,并展示出它的巨大优越性。
1.4固定化的方法
1.4.1吸附法
吸附法主要是利用范德华力和氢键、疏水相互作用、离子键等，
将酶固定在载体上的一种方法。
根据酶和载体之间结合力的不同，可细分为物理吸附法和离子吸附法2种。
物理吸附法的载体主要是高吸附能力的非水溶性材料，如硅藻土、高岭土、蒙脱石、分子筛、硅胶、多孔玻璃、氧化铝、大孔吸附树脂等;离子吸附法的载体主要是含有离子交换基团的水不溶性材料，利用酶与载体之间形成静电作用力来实现固定化，其中常用载体有阴离子交换剂和阳离子交换剂。
吸附法常用于非水相反应中固定化酶的制备，因为大多数酶不溶于有机溶剂，而且许多情况下，酶分子和载体之间不需要很强的结合力。
吸附法固定化脂肪酶是生物柴油生产中的主要方法。
吸附法也有许多不足,如酶量的选择全凭经验,pH值、离子强度、温度、时间的选择对每一种酶和载体都不同,酶和载体之间结合力不强易导致催化活力的丧失和玷污反应产物等。
因此,其应用受到限制。
为提高其适用性能,一部分科研人员将此法与其他方法联用。
1.4.2包埋法
包埋法包括凝胶包埋法和微囊包埋法,制成的固定化酶稳定性较好,但对酶作用底物分子大小有一定要求。
凝胶包埋法是将个别酶分子包在高聚物格子中,可以将块状聚合形成的凝胶切成小块,也可以直接包埋在珠状聚合物中,后者可以使固定化酶机械强度提高10倍,并改进酶的脱落情况。
微囊化法
是将酶溶液或悬浮液包裹在膜内,膜既能使酶存在于类似细胞内的环境中,又阻止酶的脱落或直接与微囊外环境接触。
小分子底物则能迅速通过膜与酶作用,产物也能扩散出来。
此法包埋的酶量很多,在医学上具有很大的应用可能性,因此越来越受到人们的注意。
1.4.3共价结合法
共价结合法是酶蛋白分子上功能团和固相支持物表面上的反应基团之间形成化学共价键连接,以固定酶的方法。
由于酶与载体间连接牢固,不易发生酶脱落,有良好的稳定性及重复使用性,成为目前研究最为活跃的一类酶固定化方法。
其常用载体包括天然高分子（纤维素、琼脂糖、淀粉、葡萄糖凝胶、胶原及衍生物等）、合成高聚物（尼龙、多聚氨基酸、乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物等）和无机支持物（多孔玻璃、金属氧化物等）。
共价结合法载体的活化或固定化操作较复杂,要严格控制条件才能使固定化酶的活力高。
1.4.4交联法
交联法是用多功能试剂进行酶蛋白之间的交联,是酶分子和多功能试剂之间形成共价键,得到三向的交联网架结构,除了酶分子之间发生交联外,还存在着一定的分子内交联。
根据使用条件和添加材料的不同,还能够产生不同物理性质的固定化酶。
常用交联试剂有戊二醛、双重氮联苯胺-2,2c-二磺酸、1,5-二氟-2,4-二硝基苯、己二酰亚胺酸二甲酯等。
四种酶固定化方法各有所长,其中包埋法是相对较好的一种方法,但几种方法联用,往往效果更好。
无论采用何种方法,固定化酶的稳定性是首要考虑的因素。
酶、载体及试剂的费用、操作难易等与工业化有关的因素也必须考虑。
科研人员在研究时,应尽量选用价格低廉、易得的体和试剂,载体最好是已在其他工业生产中大量使用的材料,同时也要考虑其应用时的安全性。
1.5实验目的及意义
纤维素酶能将纤维素水解为葡萄糖,进而对葡萄糖发酵生成乙醇等产品。
然而由于在水解纤维素过程中纤维素酶的稳定性差、催化效率较低、使用寿命短、且不能循环使用进而导致纤维素酶解过程中成本过高,严重阻碍了纤维素酶的广泛应用。
酶的固定化技术为提高纤维素酶的使用效率、降低成本提供了可能性。
2仪器与试剂
2.1试剂配制
2.1.1缓冲溶液的配制
pH4.0HAc-NaAc缓冲溶液：
0.2mol/L的NaAc1.80ml，0.3mol/L的HAc8.20ml。
pH5.0磷酸盐缓冲液:
取3.12gNaH2PO4溶于100ml蒸馏水中，用NaOH调至pH5.0。
pH6.0:
取磷酸二氢钾0.834g和磷酸氢二钾0.087g加水溶解，定容至100ml,置于广口瓶内贴签备用。
pH7.0:
取磷酸二氢钾0.68g加入29.1ml的0.1mol/ml的氢氧化钠，加水稀释至100ml,置于广口瓶内贴签备用。
pH8.0:
取磷酸二氢钾0.559g，磷酸氢二钾0.041g，加水定容至100ml，用NaOH调至pH8.0。
2.1.2DNS显色剂
称取3，5-而硝基水杨酸20g，加1NNaOH400ml，再加入600g酒石酸钾钠，定容至2000ml
2.1.3标准葡萄糖溶液的配制（1mg/ml）
准确称取100mg葡萄糖溶于100ml水中，即得1mg/ml葡萄糖溶液。
2.1.4海藻酸钠溶液的配制
3.5%海藻酸钠：
取3.5g海藻酸钠溶于100ml蒸馏水中制得。
2.1.51.5%壳聚糖
取1.5g壳聚糖溶于pH4的醋酸溶液中制得，3%壳聚糖制作方法与其相同。
2.1.6酶液制备
2mg/ml酶液：
取0.2g纤维素酶，加水溶解定容至100ml。
2.2仪器
恒温水浴锅，722型分光光度计，30ml刻度试管，电子天平，PH试纸，标签纸，洗耳球，试管，试管架，滤纸，漏斗，玻璃棒，烧杯，吸量管，比色皿，锥形瓶，容量瓶，广口瓶，注射器。
3方法与步骤
3.1葡萄糖标准曲线的绘制
取7支25ml刻度试管，分别加入1.0mg/ml的葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml，补加蒸馏水至2ml，分别加入2mlDNS显色剂，沸水浴5min显色后定容至25ml，在540nm波长下测量吸光值A，以葡萄糖含量为横坐标,吸光度A为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线。
3.2游离纤维素酶活力测定
吸光度测定：
取4支试管，分别标号1,2,3,4。
各加入1ml酶液，其中1号管先加入2mlNaOH钝化酶活力，之后各试管加入2ml羧甲基纤维素钠反应45min。
反应结束后2-4号管加2mlNaOH终止反应。
每只试管各取2ml至刻度试管中加2mlDNS沸水浴5min显色后定容至25ml，540nm测吸光值。
3.3固定化影响因素
3.3.1固定化时间对酶固定化的影响
将质量分数为3.5%的海藻酸钠与酶液混合备用，之后用5个锥形瓶将2%的CaCl2分别在40℃,45℃,50℃,55℃，60℃下预热5min。
用注射器将海藻酸钠-酶溶液以15cm左右高度滴入到不同温度的CaCl2溶液中立即形成光滑的小球。
将小球滤出分别称取1g与CMC反应45min后540nm处测OD值。
温度梯度
40℃
45℃
50℃
55℃
60℃
A
3.3.2pH对酶固定化的影响
用pH分别为4,5,6,7,8的缓冲溶液配制浓度为2%的CaCl2溶液，将混合好的海藻酸钠-酶溶液用注射器滴入不同pH的CaCl2溶液中得到固定化酶，分别称取1g与CMC反应540nm处测量OD值。
pH梯度
4
5
6
7
8
A
3.3.3固定化时间对酶固定化影响
用海藻酸钠固定6组固定化酶，固定化的时间分别为30min，60min，90min，120min，150min,180min，之后各取1g与CMC反应540nm处测OD值。
时间梯度
30
45
60
75
A
3.4不同条件对酶反应的影响
3.4.1温度对游离酶反应的影响
7支25ml具塞试管中加入2ml1%CMC溶液,置于不同温度（40-60）℃水浴中热5min,加1ml固定化酶,不同温度准确反应45min,反应结束后各取1ml加入DNS试剂,沸水浴5min显色后定容至25ml,摇匀。
以相同条件下沸水浴灭活5min的酶液为空白,在540nm波长条件下测定吸光值。
温度
40
45
50
55
60
对照
A值
3.4.2pH对游离酶反应的影响
6支25ml具塞试管中加入2ml1%CMC溶液,置于温度45℃水浴中热5min,反应结束后各取1g加入DNS试剂,不同ph（4.5.6.7.8.9）准确反应45min,加入DNS试剂,沸水浴5min显色后定容至25ml,摇匀。
在540nm波长条件下测定吸光值。
PH
4
5
6
7
8
A值
3.4.3底物浓度对游离酶反应的影响
6支25ml具塞试管中按表加入试剂,置于温度45℃水浴中热5min,加1ml酶液,准确反应45min,加入DNS试剂,沸水浴5min显色后定容至25ml,摇匀。
在540nm波长条件下测定吸光值。
管号
1
2
3
4
5
6
CMCaq
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
45℃水浴中热5min
酶液
1
1
1
1
1
1
A值
3.4.4温度对固定化酶反应的影响
6支25ml具塞试管中加入2ml1%CMC溶液,置于不同温度（40-60）℃水浴中热5min,加1g固定化酶,不同温度准确反应45min,加入DNS试剂,沸水浴5min显色后定容至25ml,摇匀。
以相同条件下沸水浴灭活5min的酶液为空白,在540nm波长条件下测定吸光值。
温度
40
45
50
55
60
对照
A值
3.4.5pH对固定化酶活力的影响
6支25ml具塞试管中加入2ml1%CMC溶液,置于温度45℃水浴中热5min,加1g固定化酶,不同ph（4.5.6.7.8.9）准确反应45min,加入DNS试剂,沸水浴5min显色后定容至25ml,摇匀。
在540nm波长条件下测定吸光值。
PH
4
5
6
7
8
9
A值
3.4.7底物浓度对固定化酶活力的影响
6支25ml具塞试管中按表加入试剂,置于温度45℃水浴中热5min,加1ml酶液,准确反应45min,各取1ml加入DNS试剂,沸水浴5min显色后定容至25ml,摇匀。
在540nm波长条件下测定吸光值。
管号
1
2
3
4
5
6
CMCaq
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
45℃水浴中热5min
酶液
1
1
1
1
1
1
A值
3.5交联固定纤维素酶
3.5.1戊二醛浓度对酶固定化的影响
将包埋后的酶在不同浓度（4%，5%，6%，7%，8%）戊二醛溶液中浸泡2h，取出后洗涤2~3次，取5支试管，各加入不同浓度固定化的1g固定化酶，各加2mlCMC反应，结束后540nm处测OD值。
戊二醛浓度
4%
5%
6%
7%
8%
A值
3.5.2交联时间对固定化的影响
取5份包埋后的酶，在4%浓度下分别交联1、2、3、4、5h，各取1g分别加入5支试管中与CMC反应，反应结束后在540nm处测OD值。
时间
1h
2h
3h
4h
5h
A值
3.6壳聚糖吸附交联法固定化酶
分别取1.5%、3%的壳聚糖溶液，滴入NaoH-乙醇溶液中形成壳聚糖小球，在2%戊二醛溶液中交联6h，交联结束后加入2mg/ml的酶液吸附2h，取出后洗涤与CMC反应，540nm处测OD值。
参考文献
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