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2012年5月1日

1目的：

实现PCR实验室日常专人负责，确保实验室操作的规范性。

2实验室分区设置

2.1.1本院在检验科设置临床基因扩增实验室。

2.1.2按国家卫生部《医疗机构临床基因扩增管理办法》以及《上海市医疗机构临床基因扩增检验技术审核办法》的要求，从房屋配置、装修、采光、通风、隔离等条件将实验室设置分为试剂准备、贮存区（第一区）、标本制备区（第二区）及扩增和产物分析区（第三区）三个独立区域。

各区门前有醒目标志，每个区都设置缓冲区，用于更换工作服、鞋套及维持空气流向。

进入各个工作区域工作时，必须严格遵守单一方向顺序：

即从第一区的试剂贮存、准备区—→第二区的标本制备区—→第三区的扩增及产物分析区。

严禁误入和逆向进入各工作区。

2.1.3各区的实验物品（含移液器、试管架、吸头盒、记录本、笔等），不得混用，须贴上不同标签予以区别。

2.1.4各区配有不同颜色工作服：

第一区试剂准备、贮存区为白色，第二区标本制备区为蓝色，第三区扩增及产物分析区为粉红色。

进入各区实验室，必须更换本室有颜色标识的工作服，带上手套。

3各分区工作制度

3.1试剂贮存、准备区工作制度

3.1.1本区只进行如下工作：

试剂的制备、分装和反应液的制备及试剂贮存；

其它操作不得在此区进行。

3.1.2实验人员进入该区须穿本区专用蓝色工作服。

实验中须戴一次性手套。

3.1.3记录实验室温湿度和冰箱的温度。

3.1.4根据当天所要检测标本的种类、数量，取出和配制当天实验所需的试剂，其余试剂要立即收好放回冰箱内。

3.1.5实验中所使用的离心管、吸头等需经高压灭菌处理，应在消毒有效期内使用。

3.1.6试剂准备工作完成后，将使用过的离心管、吸头置于盛2000mg/L有效氯消毒液的废物盒中，消毒清洁实验台面。

3.1.7将准备好的试剂放入一区到二区的传递窗。

（注：

传递窗的两扇门不能同时开启）；

3.1.8其他区的用品不得带入本区。

3.1.9作好每次实验记录，书写工整详细，使用本室专用的、带有本室标识的记录本和笔。

3.1.10实验完毕打开紫外灯消毒30～60分钟，记录紫外灯使用情况。

3.2标本制备区工作制度

3.2.1本区只进行如下工作：

临床标本的保存，核酸提取、贮存及加样至扩增反应管，RNA检测逆转录（RT）合成cDNA；

\

3.2.2实验人员进入该区须穿本室专用白色工作服。

实验中须使用一次性手套，手套需常更换。

3.2.3从传递窗中取出试剂放入冰箱冷冻室试剂存放专区暂存。

3.2.4记录实验室温湿度和冰箱的温度。

3.2.5核对标本的编号、类型和标本数量。

3.2.6按操作规程在生物安全柜内进行标本的裂解、提取和加样，加样后，将其放入二区到三区的传递窗。

3.2.7使用带有本室专用标志的加样器以及经过消毒处理的离心管和带滤芯的一次性吸头。

3.2.8使用过的离心管、吸头须置于盛有2000mg/L有效氯消毒液的废物盒中。

3.2.9污染的处理：

实验中若在操作台面上发生液体外泄，应立即用浸有2000mg/L有效氯溶液的滤纸覆盖发生污染处半小时，然后用酒精擦洗，并开启紫外灯消毒。

3.2.10作好每次实验记录，书写工整详细，使用本室专用的、带有本室标识的记录本和笔。

3.2.11标本处理完成后，关闭所有仪器，记录仪器使用时间和运行状态。

3.2.12其他区的用品不得带入本室。

3.2.13实验完毕要开启紫外灯消毒30～60分钟，记录紫外灯使用情况。

3.3扩增及产物分析区工作制度

3.3.1本区只进行如下工作：

DNA或cDNA的扩增、实时荧光PCR扩增产物的分析、结果判断、记录结果和生成检测报告等；

3.3.2实验人员进入该区须穿本区专用粉红色工作服。

3.3.3记录实验室温湿度。

3.3.4将从传递窗接收来的加好样离心后的反应管上机扩增。

3.3.5扩增结束后，关掉扩增仪。

记录仪器使用时间和运行状态。

3.3.6扩增结果分析完后，在工作清单中填入检测结果。

3.3.7得到当天室内质控结果后，输入质控软件。

3.3.8作好每次实验记录，书写工整详细，使用本室专用的、带有本室标识的记录本和笔。

3.3.9实验完毕要打开紫外灯消毒30～60分钟，记录紫外灯使用情况。

4批准记录

批准时间

有效期

□1年；

□其他：

PCR实验室人员配置及管理

XXXXXX医院检验科

PCR（N）-SOP-002

XX

1目的：

保证实验室有足够数量的合格的具备开展该类实验能力的实验人员。

2适用范围：

适用于实验室人员配置、管理、培训及考核。

3细则：

3.1人员要求

3.1.1本实验室工作人员应为医学检验专业或相关专业毕业，具有初级以上技术职称或专科以上学历。

3.1.2实验室工作人员应参加上海市临床检验中心举办的PCR技术培训，并取得临床基因扩增检验技术上岗证。

3.1.3对于新进入本室的人员，如尚未取得PCR技术培训合格证，应在实验室有培训合格证的上级技术人员的指导下进行实验工作，实验报告由有资格人员出具，并应尽快取得上岗培训合格证。

3.2人员配置

3.2.1实验室应根据工作需要配备足够的工作人员，目前实验室有主管技师2人、技师3人，5人都已获得培训合格证，视工作量的增加和业务发展需要，会适当增加工作人员。

3.2.2各级技术人员履行相应的工作职责。

3.3人员培训及考核

3.3.1实验室工作人员每1～2年至少参加1次PCR技术的省级或国家级继续教育项目，参加相关学术交流会议。

3.3.2安排未取得上岗培训合格证的工作人员在合适的时间内参加技术培训。

3.3.3科室每周组织实验室内部实验人员进行业务小讲课、PCR实验室人员每月进行本小组内核酸扩增方面的相关培训，提升自身的理论学习水平。

3.3.4本实验室工作人员每年至少进行考核一次。

3.4人员管理

实验室建立所有工作人员的技术档案，包括：

学历、任职资格、发表论文、研究成果、培训等相关材料复印件。

PCR实验室清洁程序

XXXXXXXX医院检验科

PCR（N）-SOP-003

XXXX

XXXX

保证实验室环境的整洁，防止污染。

适于实验室工作环境、实验台面、工作服、移液器等的清洁消毒工作。

3.1实验室地面必须平整、干净，通道要利于通行，没有无用的物品阻碍。

3.2合理规划实验室内物品，做到摆放整齐、有序，无用的或使用效率低的物品放置到储存处，常用的物品要容易寻找到。

3.3抽屉、柜子、文件类物品要作好标记，以方便识别。

3.4实验结束后清洁台面，并用移动紫外灯进行消毒。

3.5每周对使用过的移液器用75%酒精进行擦拭，若使用过程中发生污染应随时移液器咀进行75%酒精浸泡15分钟左右。

3.6实验过程中如发生标本或试剂外溅，应立即用浸有2000mg/L有效氯溶液滤纸盖上半小时，然后用酒精擦洗，并用移动紫外灯消毒。

3.7每天实验前开启各区的通风系统，各区实验结束后，分别打开传递窗紫外灯、移动紫外灯（对实验台面消毒）、天花板紫外灯消毒实验室，每次开启30～60分钟。

3.8待紫外灯消毒时间足够后，依次关闭各区紫外灯并记录。

3.9依次清洁三个区的实验台面和地面，各区清洁消毒工具均专用，不可混用，注意按照单一方向流程的原则来进行清洁。

3.10处理好各区废弃物，交医院集中处理。

3.11每周将工作服交院洗衣房洗涤消毒，不同实验区的工作服隔开洗涤。

目的：

保证实验室、实验人员和外部环境的安全。

适用范围：

核酸扩增荧光检测实验室常用化学试剂（NaOH、EDTA、乙醇、生理盐水等）、实验室废弃物的处理；

细则：

1.科室职责应对本室工作人员讲明本程序在预防交叉、实验室污染及切断传播途径中的重要性，并要求严格执行。

2.实验室所有垃圾，装入专用污物袋内，各区备有：

生活垃圾袋（黑色）及生物污染垃圾袋（黄色）。

3.使用过的一次性消耗品（如试管、吸头、离心管、等），置于盛2000mg/L有效氯消毒液的废物盒中，使用过的手套、鞋套等直接放入黄色垃圾袋内交医院集中处理。

4.废弃标本及其容器装入黄色垃圾袋内、封闭，交本科室废弃物处理室预处理，然后交医院污物处理中心处理。

5.日常生活垃圾如纸屑等按一般垃圾交医院处理。

PCR实验室废弃物处理程序

XXXXX医院检验科

PCR（N）-SOP-004

XXX

PCR实验室化学试剂配制程序

PCR（N）-SOP-005

保证实验中用到的各种溶液符合实验要求。

核酸扩增荧光检测实验室常用溶液：

4%NaOH溶液、75%酒精、2000mg/L有效氯溶液等。

程序：

1用具：

干燥洁净的250ml量桶一只，三角烧瓶，天平一架，100ml试剂瓶。

2配制步骤：

2.1配制4%NaOH溶液:

a）用天平称取4克分析纯的NaOH固体，置于一只三角烧瓶中。

b）用250ml量桶准确取100ml水，缓缓注入盛放NaOH固体的三角烧瓶中。

c）摇荡三角烧瓶使NaOH固体充分溶解。

d）然后缓缓倾倒入100ml试剂瓶中密封保存备用。

2.2配制2000mg/L有效氯溶液消毒剂:

本室采用片剂配制有效氯溶液，根据实际配制液体体积加入适当数量片剂。

2.375%酒精溶液:

由医院库房直接领取。

PCR实验室应急处理程序

PCR（N）-SOP-006

1.目的：

在实际工作中，仪器设备发生故障、试剂盒发生质量问题时，为保证检验结果的准确性、及时，应正确采取应急措施，最大程度上避免或减轻不利影响。

2．适用范围：

适用于满足核酸扩增荧光检测实验室检测需要并可能对检验结果造成误差的仪器设备和试剂盒。

3．负责人：

4．细则：

4．1核酸扩增荧光检测实验室工作人员在职责范围内均有责任熟悉各种仪器和相关设备的性能、要求、维护和保养、常见故障的排除、尤其要严格按照操作规程操作。

4．2工作人员在职责范围内均有责任有意识地注意以求及时发现并报告仪器设备和试剂盒的异常情况。

4．3作为应急处理，潜在着一定的可能影响检测质量的不确定因素。

室负责人负责在第一时间检查核实应急措施的有效性。

4．4仪器设备故障

4．4．1室负责人接到异常情况报警后，立即现场确认异常情况的性质：

观察有无误操作、偶发现象或确属不能立即排除的故障。

4．4．2用红牌故障标志标示故障仪器，以防被错误使用。

4．4．3有满足要求的替用设备的，启用替用设备（准用仪器）。

借用其他部门仪器设备时，及时联系借用并核实该设备的使用状态。

替用、借用或备用设备的使用在满足质量要求的同时，必须同时满足实验室管理措施（特别是防污染）的要求。

4．4．4不能解决的问题，应及时与供应方会同解决。

根据双方合同约定，及时通知供应方。

供应方技术支持人员将在规定的时间内随身携带备用设备到达现场。

4．4．5仪器维修后，必须经验收合格并供需双方签字，调试实验通过后才能重新启用。

取下红色故障标示（暂停使用），换上绿色正常标示（正常使用）。

4．4．6室主任须检查并随时跟踪所采取措施的有效性。

4．4．7对未能及时排除故障时，必须及时上报科室，在科主任批准下，应积极联系附近的其他已得到上海市临检中心认证的临床基因扩增检验实验室检验，以满足患者和临床需求。

4．5试剂盒质量发生问题，经核实后，及时通知供货商迅速更换另一批次试剂，使用前需先作质量检测，合格后方可使用。

4．6仪器设备故障或试剂质量问题不能得到解决，预期将会影响到检测报告的及时发出，可将标本送至其它已得到上海市临检中心认证的临床基因扩增检验实验室检查；

如已影响到报告的及时发出，应在门诊取报告处向病人公告或向相关病区公告，取得病人的谅解。

4．7影响到检测报告发出的情况，应在应急处理记录表作记录。

5相关表格

应急处理记录表，编号PCR（N）-SOP-006-01。

PCR实验室试剂质检标准操作程序

PCR（N）-SOP-007

1．目的：

保证每批用于临床实验的试剂的质量良好，符合要求。

各种用于临床实验的核酸扩增荧光检测试剂。

4．程序：

4．1收到试剂后，目测试剂是否处在冻存状态。

4．2核对试剂品种和数量并检查包装：

外包装（厂名厂址、批准文号、批号和有效期等）；

内包装（试剂瓶完整性、试剂配备品种完整性、使用说明书有否等）。

4．3及时将试剂转入－20℃冰箱保存。

将上述检测核对情况在记录表上登记。

4．4最迟在前批次试剂存量尚可维持常规实验一周时，按如下要求对新批号试剂进行效验实验。

4．5效验实验：

4．5．1要求设置：

空白对照、阴性对照、阳性对照、室内质控各一，阳性标准品梯度（104、105、106、107）。

4．5．2出现如下情况中任何一种的，判断为试剂不合格，不能用于临床检测：

a）空白对照出现扩增。

如扩增曲线CT值大于25，需重复实验确证试剂污染。

b）阳性对照和阳性标准品均未检出，或阳性对照未检出而阳性标准品检出率大幅下降，表示试剂失效或检测灵敏度大幅下降。

4．5．3阳性对照未检出，阳性标准品检测正常，提示样品提取液可能存在问题。

重复新旧提取液阳性对照实验，确定提取液失效问题。

更换提取液后该批试剂方可使用。

4．5．4空白对照无扩增，阴性对照有扩增，排除其他污染可能性后，提取液存在污染可能。

单独用提取液点样上机，出现扩增，需更换提取液后方可使用该批试剂。

4．5．5阳性对照检出，阳性标准品未检出或扩增曲线明显系统性CT值偏大5个循环以上。

提示阳性标准品存在问题。

更换阳性标准品后该批试剂方可投入使用。

4．5．6空白对照、阴性对照无扩增，阳性对照正常检出，阳性标准品导出的标准曲线之斜率（－2.9～－3.9）、截距（26～34）、相关性（﹤－0.99）均在使用范围内，表明该批试剂良好，可以投入临床使用。

4．6将实验结果归入记录。

6相关表格

试剂入库使用记录表，编号PCR（N）-SOP-007-01。

试剂质检记录表，编号PCR（N）-SOP-007-02。

乙型肝炎病毒核酸定量检测标准操作程序

PCR（N）-SOP-101

7项目名称

乙型肝炎病毒核酸定量检测

8检验方法名称

TaqMan荧光定量检测

9方法学原理

PCR扩增时加入一对乙型肝炎病毒DNA特异性引物，同时加入一个特异性的、能与PCR产物杂交的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团（R）和一个荧光淬灭基团（Q）。

探针完整时，R基团发射的荧光信号被Q基团吸收；

PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使R荧光基团和Q荧光基团分离，Q基团对R基团的抑制吸收作用消失，荧光监测系统就可接收到R基团的荧光信号。

每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成。

被切割产生的荧光分子数与PCR产物的数量成比例，这样就实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。

10标本要求

10.1血清：

用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入无抗凝剂普通试管，待凝固后1500r/min离心5分钟，吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管；

10.2血浆：

用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入EDTA或枸橼酸钠抗凝剂的试管，轻轻颠倒混匀5~10次，使抗凝剂与静脉充分混匀，5~10分钟后即可分离出血浆，转移至1.5ml灭菌离心管；

10.3标本保存：

标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月。

11试剂

11.1试剂名称：

乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）

11.2生产厂家：

中山大学达安基因股份有限公司；

11.3试剂货号：

#DA-B051；

11.4包装规格：

20人份/盒；

11.5试剂成份:

组成部分

数量

主要组成成份

DNA浓缩液（2000µ

l/管）

1管

PEG6000、NaCl

DNA提取液（500µ

2管

NaOH、Tris-HCl、（PH8.0）、TritonX-100、NP-40、Chelex-100、EDTA（PH8.0）

HBVPCR反应液（400µ

PCR反应缓冲液、上下游引物、荧光探针

Taq酶（60µ

Taq酶原液、dNTPs

HBV临界阳性质控品（200µ

灭活的HBV阳性血清（1×

104IU/ml）

HBV强阳性质控品（200µ

107IU/ml）

阴性质控品（250µ

HBV阴性血清

HBV阳性定量参考品（1.0×

104IU/ml）10µ

l/管紫色

含有HBV扩展目的基因片断的重组质粒（1.0×

105IU/ml）10µ

l/管黄色

105IU/ml）

106IU/ml）10µ

l/管蓝色

106IU/ml）

107IU/ml）10µ

l/管绿色

11.6试剂储存条件：

保存于—20℃，有效期6个月。

12仪器

ABI7500全自动基因扩增检测仪

13操作步骤

13.1DNA提取

13.1.1标本处理（血清和血浆标本处理相同，在样本处理区操作）

13.1.1.1取100µ

l血清加入等量DNA，振荡器振荡混匀5秒；

13.1.1.212000r/min离心10min；

13.1.1.3去上清，沉淀中加入30µ

lDNA提取液，振荡器剧烈振荡混匀5~10秒，瞬时离心数秒，100℃恒温处理10±

1分钟；

13.1.1.412000r/min离心5min，备用。

13.1.2阴性质控品处理

取出阴性质控品，8000rpm离心数秒，吸50µ

l至0.5ml灭菌离心管中，加入50µ

lDNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±

12000r/min离心5min，备用。

13.1.3HBV临界阳性质控品处理（同阴性质控品）；

13.1.4HBV强阳性质控品处理（同阴性质控品）；

13.1.5HBV阳性定量参考品处理：

8000rpm离心数秒，备用；

13.2PCR扩增

13.2.1试剂准备（在试剂准备区操作）：

按比例（HBVPCR反应液40µ

l/人份+Taq酶3µ

l/人份）取相应量的PCR反应液及Taq酶，充分混匀后按43µ

l/管分装至0.2ml离心管中备用。

13.2.2加样：

向准备好试剂的0.2ml离心管中，分别加入处理后的样品（包括样本、阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质控品）上清液2µ

l，或直接加入阳性定量参考品2µ

l，8000rpm离心数秒，放入仪器样品槽。

13.2.3设置PCR循环扩增程序如下

93℃2分钟预变性；

93℃45秒→55℃60秒10个循环

93℃30秒→55℃45秒30个循环

14结果判断：

14.1.1在Results/Amplification页面查看反应曲线，分析结果时，基线（baseline）取为12-18个循环的荧光信号，此时的阈值（threshold）约为400。

14.1.24管阳性标准管、临界阳性对照管的荧光强度对应反应循环数曲线（ΔRnvs.Cycle）应呈较典型的S型曲线，阴性对照管则无此特征，否则实验视为无效。

14.1.3根据预先输入的5个阳性参考品浓度，仪器自动以阳性参考品基因拷贝浓度的对数值为横坐标，以其实际测得的Ct值为纵坐标，作标准曲线，相关系数应大于等于0.990，否则应视为实验无效。

14.1.4定量结果分析：

质控、标准曲线均满足要求时，可对样品进行定量分析。

分析数据时，根据标准曲线自动计算未知标本的相应基因拷贝浓度。

14.1.5如果增长曲线不呈S型或Ct值=30，则判样品的HBVDNA总含量小于检测极限。

14.1.6如果增长曲线呈S型曲线且Ct值<