汉防己生物碱的提取Word文档格式.docx

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3、巩固硅胶TLC板的制备方法。

实验原理利用生物碱及其盐的溶解性提取亲脂性生物碱，再利用其极性大小同进行分离。

本次实验所需仪器：

电子分析天平；

研钵；

烧杯；

漏斗；

恒温水浴箱；

PH试纸；

250ml圆底烧瓶；

球行（回流）、直行冷凝管（蒸馏）；

空心塞；

空心玻管；

橡皮套；

蒸馏头；

真空接受管；

弯玻管；

缓冲瓶（抽滤瓶）；

真空泵；

耐压橡皮管；

蒸发皿。

试剂：

汉防己；

10%盐酸；

碘化汞钾；

碘化铋钾；

碘化碘钾；

硅钨酸；

85%乙醇

实验内容

1.系统预试

1.记录待预试药物的学名、植物来源、药用部分及其特征（熔点、沸点和折光率）。

2.检品溶液的制备：

将检品先剪切成碎块然后用研钵研成粉末。

取检品粉末2g，加蒸馏水20ml,加10%盐酸至pH≤3，在60℃左右的水浴上加热15分钟，冷却过滤，滤液供作以下实验。

3.初步鉴别：

①碘化汞钾试剂取检品液1ml，滴加2滴碘化汞钾试剂，观察有无白色沉淀产生。

②碘化铋钾试剂取检品液1ml，滴加2滴碘化铋钾试剂，观察有无橘红色或红棕色沉淀产生。

③碘化碘钾试剂取检品液1ml，滴加2滴碘化碘钾试剂，观察有无棕色沉淀产生。

④硅钨酸试剂取检品液1ml，滴加2滴硅钨酸试剂，观察有无淡黄色或白色沉淀产生。

2.汉防己总生物碱的提取：

（萃取法）

称取50g汉防己粗粉置于250ml圆底烧瓶中，分别用85%乙醇150ml、100ml、100ml回流提取，分别提取1.5、1、1小时（或每次2小时），每次提取后，倾斜倒出乙醇提取液，合并乙醇提取液，过滤，得乙醇提取液。

将滤液减压浓缩至小体积移至蒸发皿水浴浓缩至无醇味，得总提取物（糖浆状）。

3、薄层板制备

除另有规定外,将吸附剂1份和水3份在研钵中向一方向研磨混合,去除表面的气泡后，倒入涂布器中，在玻板上平稳地移动涂布器进行涂布（厚度为0.25～0.5mm）,取下涂好薄层的玻板，于室温下，置水平台上晾干，在反射光及透射光下检视，表面应均匀，平整，无麻点、无气泡、无破损及污染，于110℃烘30分钟,冷却后立即使用或置干燥箱中备用。

注意：

1.药材的量为烧瓶容量的1/3~1/2，再加溶剂使其浸过药面1~2cm。

2.欲蒸馏液装至烧瓶体积的1/2~2/3，应加入沸石。

减压蒸馏操作注意事项见书。

实验原理1、利用生物碱及其盐的溶解性提取亲脂性生物碱，再利用其极性大小同进行分离。

2、利用甲素、乙素极性不同，在不同溶剂中溶解度不同进行分离。

实验所需仪器：

大烧杯；

抽滤瓶；

布氏漏斗；

250ml分液漏斗；

铁架台；

铁圈；

减压回收溶剂一整套装置；

锥形瓶。

实验所需试剂：

1%盐酸；

浓氨水；

氯仿；

1%氢氧化钠水溶液；

无水硫酸钠；

甲苯；

丙酮。

1.亲脂性叔胺生物碱和水溶性季胺生物碱的分离：

将乙醇提取物转移至大烧杯中，后逐渐加入80ml1%盐酸分三次溶解，在搅拌下50℃水浴中搅拌促溶，（生物碱成盐溶于水，酸性不溶物下沉，加酸至溶液不再产生沉淀且溶液呈明显的酸性为止）抽滤除去树脂物，沉淀以1%盐酸少量洗涤数次，弃去沉淀。

方法一：

合并滤液和洗涤液，用浓氨水调至pH9，这时难溶的游离亲脂性叔胺碱析出，将此溶液转入分液漏斗中，用环己烷-乙酸乙酯（25：

75）30ml萃取，再以每次10ml同样的萃取剂萃取，直至取1ml萃取液，经无水硫酸钠脱水，蒸干，用1ml5%盐酸溶解残留物，加1~2滴碘化铋钾试剂无明显沉淀为止。

合并萃取液，以适量无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏回收溶剂，即得亲脂性叔胺总碱

方法二：

合并滤液和洗涤液，转移至250ml的分液漏斗中，再加入30ml氯仿，滴加浓氨水至pH值9-10后轻轻振摇萃取，分取氯仿层，再以每次10ml氯仿萃取，合并氯仿液，氯仿液即含有亲脂性叔胺总碱。

2.汉防己甲素、乙素分离：

（冷甲苯法）

将亲脂性总碱称重后，置25ml锥形瓶中，加5倍量甲苯，搅拌促溶至不溶物量不再减少，过滤，用少量甲苯洗涤不溶物后，合并甲苯溶液，并蒸馏浓缩至干，残留物用丙酮重结晶，得细棒状晶体Ⅰ（汉防己甲素），甲苯不溶物用丙酮重结晶后，得颗粒状晶体Ⅱ（汉防己乙素）。

实验六：

汉防已甲素、乙素的鉴定

实验目的1、掌握TLC在生物碱鉴定中的应用；

实验原理利用汉防已甲素、乙素在TLC中的色谱行为不同时行分离鉴定。

b形管；

温度计；

橡皮圈；

塞子；

毛细管；

酒精灯；

玻板；

涂布器；

点样器；

薄层缸；

显色喷雾器

硅油；

硅胶G；

0.45CMC；

环己烷-乙酸乙酯-二乙胺；

改良的碘化铋钾试剂

实验内容：

（一）测定熔点（选做）

汉防己甲素的熔点：

216~217

汉防己乙素的熔点：

134~136

取供试品适量，研成细粉，除另有规定外，应按照各药品项下干燥失重的条件进行干燥。

若该药品为不检查干燥失重、熔点范围低限在135℃以上、受热不分解的供试品,可采用105℃干燥；

熔点在135℃以下或受热分解的供试品，可在五氧化二磷干燥器中干燥过夜或用其他适宜的干燥方法干燥，如恒温减压干燥。

调节升温速率为每分钟上升1.0～1.5℃，加热时须不断搅拌使传温液温度保持均匀，记录供试品在初熔至全熔时的温度，重复测定3次，取其平均值,即得。

“初熔”系指供试品在毛细管内开始局部液化出现明显液滴时的温度。

“全熔”系指供试品全部液化时的温度。

测定熔融同时分解的供试品时，方法如上述,但调节升温速率使每分钟上升2.5～3.0℃；

供试品开始局部液化时（或开始产生气泡时）的温度作为初熔温度；

供试品固相消失全部液化时的温度作为全熔温度。

遇有固相消失不明显时，应以供试品分解物开始膨胀上升时温度作为全熔温度。

某些药品无法分辨其初熔、全熔时，可以其发生突变时的温度作为熔点。

（二）薄层层析

1、吸附剂：

硅胶G-CMC

展开剂：

环己烷-乙酸乙酯-二乙胺（6：

2：

1）

显色剂：

改良的碘化铋钾试剂（在喷显色剂之前在80℃左右完全挥干展开剂，以免二乙胺干扰。

甲素显色后呈淡棕色，且颜色2小时左右褪掉，而乙素呈深棕色，久置不褪色。

）

样品：

汉防己甲素、汉防己乙素标准品，自制的汉防己甲素和汉防己乙素。

薄层色谱法，系将适宜的吸附剂或载体涂布于玻璃板、塑料或铝基片上，成一均匀薄层。

待点样、展开后，与适宜的对照物按同法在同板上所得的色谱图对比，用以进行药品的鉴别。

2、仪器与材料

（1）玻板除另有规定外，用10cm×

10cm、10cm×

15cm、20cm×

10cm或20cm×

20cm的规格，要求光滑、平整，洗净后不附水珠，晾干。

（2）吸附剂或载体最常用的有硅胶G、硅胶GF、硅胶H、硅胶HF，

其次有硅藻土、硅藻土G、氧化铝、氧化铝G、微晶纤维素、微晶纤维素F等。

其颗粒大小一般要求直径为10～40μm。

薄层涂布,除另有规定外，一般可分无黏合剂和含黏合剂两种；

前者系将吸附剂或载体用水适量调成糊状，均匀涂布于玻璃板上，后者系在吸附剂或载体中加入一定量的黏合剂，一般常用10％～15％煅石膏（CaSO4·

2H2O在140℃加热4小时）,混匀后加水适量使用，或用羧甲基纤维素钠水溶液（0.2％～0.5％）适量调成糊状，均匀涂布于玻璃板上。

（3）涂布器应能使吸附剂或载体在玻璃板上手工或自动涂成一层符合厚度要求的均匀薄层。

（4）点样器一般采用微升毛细管或与之相应的点样器材。

（5）展开室可用适合薄层板大小的专用玻璃缸,底部平底或有双槽，盖子须密闭。

3、操作方法

（1）薄层板制备除另有规定外,将吸附剂1份和水3份在研钵中向一方向研磨混合,去除表面的气泡后，倒入涂布器中，在玻板上平稳地移动涂布器进行涂布（厚度为0.25～0.5mm）,取下涂好薄层的玻板，于室温下，置水平台上晾干，在反射光及透射光下检视，表面应均匀，平整，无麻点、无气泡、无破损及污染，于110℃烘30分钟,冷却后立即使用或置干燥箱中备用。

（2）点样除另有规定外,用点样器点样于薄层板上,一般为圆点，点样基线距底边1.5cm，样点直径一般不大于3mm,点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜，一般为1cm。

点样时必须注意勿损伤薄层表面。

（3）展开将点好样品的薄层板放入展开缸的展开剂中，浸入展开剂的深度为距原点5mm为宜，5cm×

15cm玻板展开剂用量约10ml，密封，待展开距离除另有规定外，一般为8～15cm，取出薄层板，晾干。

展开缸如需预先用展开剂预平衡，可在缸中加入适量的展开剂，必要时并在壁上贴二条与缸一样高、宽的滤纸条，一端浸入展开剂中，盖严，使展开缸平衡或按正文规定操作。

（4）显色

（三）衍生物的制备（选做）

取汉防已甲素0.2g，溶于2ml（丙酮中，滴加苦味酸饱和水溶液至不再析出黄色沉淀为止，抽滤收集沉淀，顺次以少量水乙醚洗涤，乙醇重结晶，得汉防已甲素苦味酸盐，mp235~242℃（dc）。

附录中草药化学成分检出试剂配制法

一、生物碱沉淀试剂：

1．碘化铋钾（Dragendorff）试剂：

取次硝酸铋3g溶于30%硝酸（比重1.18）17ml中，在搅拌下慢慢加碘化钾浓水溶液（27克碘化钾溶于20ml水），静置一夜，取上层清液，加蒸馏水稀释至100ml。

附：

改良的碘化铋钾试剂：

甲液：

0.85g次硝酸铋溶于10ml冰醋酸，加水40ml。

乙液：

8g碘化钾溶于20ml水中。

溶液甲和乙等量混合，于棕色瓶中可以保存较长时间，可作沉淀试剂用，如作层析显色剂用，则取上述混合液1ml与醋酸2ml，混合即得。

目前市场上碘化铋钾试剂可直接供配制：

7.3g碘化铋钾，冰醋酸10ml，加蒸馏水60ml。

2．碘化汞钾（Mayer）试剂：

氯化汞1.36g和碘化钾5g各溶于20ml水中，混合后加水稀释至100ml。

3．碘一碘化钾（Wagner）：

1g碘化钾液于50ml，加热，加2ml醋酸，再用水稀释至100ml。

4．硅钨酸试剂：

5g硅钨酸溶于100ml水中，加盐酸少量至pH2左右。

5．苦味酸试剂：

1g苦味酸溶于100ml水中。

6．鞣酸试剂：

鞣酸1g加乙醇1ml溶解后再加水至10ml。

7．碱酸铈——硫酸试剂：

0.1g硫酸铈混悬于4ml水中，加入1g三氯醋酸，加热至沸，逐滴加入浓硫酸至澄清。

二、苷类检出试剂：

（一）糖的检出试剂：

1．碱性酒石酸铜（Fehiling）试剂：

本口分甲液与乙液，应用时取等量混合。

结晶硫酸酮6.23g，加水至100ml。

酒石酸钾钠34.6g，及氢氧化钠10g，加水至100ml。

2．ɑ-萘酚（Molisch）试剂。

ɑ-萘酚1g，加75%乙醇至10ml。

浓硫酸

3．氨性硝酸银试剂：

硝酸银1g，加水20ml溶解，注意滴加适量的氨水，随加随搅拌，至开始产生的沉淀将近全溶为止，过滤。

4．ɑ-去氧糖显色试剂

（1）三氯化铁冰醋酸（Keller-Kiliani）试剂

1%三氯化铁溶液0.5ml，加冰醋酸至100ml。

浓硫酸。

（2）占吨氢醇冰醋酸（Xanthydrol）试剂：

10mg占吨氢醇溶于100ml冰醋酸（含1%的盐酸中）

（二）酚类

1．三氯化铁试剂：

5%三氯化铁的水溶液或醇溶液。

2．三氯化铁一铁氰化钾试剂：

2%三氯化铁水溶液

1%铁氰化钾水溶液

应用时甲液、乙液等体积混合或分别滴加。

3、4一氨基氨替比林一氨氰化钾（Emerscn）试剂：

2%4-氨基安替比林乙醇液

3%铁氰化钾水溶液，（或用0.9%4-氨基安替比林和5.4%铁氰化钾水溶液）。

4．重氮化试剂：

本试剂系由对硝基苯胺和亚硝酸钠在强酸下经重氮化作用而成，由于重氮盐不稳定很易分解，所本试剂应临用时配制。

对硝基苯胺0.35g，溶于浓盐酸5ml，加水至50ml。

亚硝酸钠5g，加水至50ml

应用时取甲、乙液等量在冰水浴中混合后，方可使用。

5．Gibb试剂：

0.5%2，6-二氯苯醌-4氯亚胺的乙醇溶液。

硼酸一氯化钾一氢氧化钾缓冲液（pH9.4）。

[注]试剂配制法中：

1.水是指蒸馏水；

2.不指出溶剂的即为水溶液；

3.醇指95%；

4.试剂配制后应澄清，如不澄清可过滤。

（三）内酯、香豆素类

1．异羟肟酸铁试剂

新鲜配制的1N羟胺盐酸盐（M=69.5）的甲醇液。

1.1N氢氧化钾（M=56.1）的甲醇液

丙液：

三氯化铁溶于1%盐酸中的浓度为1%的溶液。

应用时甲、乙、丙三液体按次序滴加，或甲、乙两液混合滴加后再加丙液。

2．4-氨基安替比林一铁氰化钾试剂（见二一

（二）-3）。

3．重氮化试剂：

（见二一

（二）-4）。

进行2、3试验时样品应先加3%碳酸钠溶液加热处理，再分别滴加试剂。

4．开环一闭环试剂

1%氢氧化钠溶液。

2%盐酸溶液。

（四）黄酮类：

1．盐酸镁粉试剂：

浓盐镁和镁粉

2．三氯化铝试剂：

2%三氯化铝甲醇溶液

3．醋酸镁试剂：

1%醋酸镁甲醇溶液

4．碱式醋酸铅试剂：

饱和碱式醋酸铅（或饱和醋酸铅）水溶液。

5．氢氧化钾试剂：

10%氢氧化钾水溶液。

6．氧氯化锆试剂：

10%氧氯化锆甲醇溶液。

7．锆一枸橼酸试剂：

2%氧氯化锆甲醇液。

2%枸橼酸甲醇液。

（五）蒽醌类：

1．氢氧化钾试剂：

2．醋酸镁试剂：

105醋酸镁甲醇溶液。

3．1%硼酸试剂：

1%硼酸水溶液。

4．浓硫酸试剂：

5．碱式醋酸铅试剂：

（见二一（四）一4）。

（六）强心苷类

1．3，5-二硝基苯甲酸（Kedde）试剂。

2%3，5-二硝基苯甲酸甲醇液。

1N氢氧化钾甲醇溶液：

应用前甲、乙两液等量混合。

2．碱性苦味酸（Baljet）试剂：

1%苦味酸水溶液。

10%氢氧化钠溶液。

3．亚硝基铁氰化钠一氢氧化钠的（Legal）试剂：

吡啶

0.5%亚硝基铁氰化钠溶液。

10%氢氧化钠溶液

（七）皂苷类：

1．溶血试验：

2%血球生理盐水混悬液：

新鲜兔血（由心脏或耳静脉取血），适量，用洁净小毛刷迅速搅拌，除去纤维蛋白并用生理盐水反复离心洗涤至上清液无色后，量取沉降红血球用生理盐水配成2%混悬液，贮冰箱内备用（贮存期2~3天）。

2．醋酐一浓碱酸（Liebermann）试剂：

醋酐。

硫酸。

3．浓硫酸试剂，浓硫酸。

（八）含氰苷类：

1．苦味酸钠试剂：

适当大小的滤纸条，浸入苦味酸饱和水溶液；

浸透后取出晾干，再浸入10%碳酸钠水溶液内，迅速取出晾干即得。

2．亚铁氰化铁（普鲁士兰）试剂：

10%氢氧化钠液。

10%硫酸亚铁水溶液，用前配制。

10%盐酸。

丁液：

5%三氯化铁液。

三、萜类、甾体类检出试剂

1．香草醛一浓硫酸试剂：

5%香草醋浓硫酸液（或0.5g香草醛溶于100ml硫酸一乙醇（4：

1）中）。

2．三氯化锑（Carr-Price）试剂：

25g三氯化锑溶于15g氯仿中（亦可用氯仿或四氯化碳的饱和溶液）。

3．五氯化锑试剂：

五氯化锑一氯仿（或四氯化碳）1：

4，用前新鲜配制。

4．醋酐一浓硫酸试剂：

（见二一（七）一2）。

5．氯仿一浓硫酸试剂：

氯仿（溶解样品）。

6．间二硝基苯试剂：

2%间二硝基苯乙醇液。

14%氢氧化钾甲醇液。

用前甲、乙两液等量混合。

7．三氯醋酸试剂：

3.3g三氯醋酸溶于10ml氯仿，加入1~2溶过氧化氢。

四、鞣质类检出试剂：

1．三氯化铁试剂

2．三氯化铁一铁氰化钾试剂

3．4-氨基安替比林一铁氰化钾试剂

4．明胶试剂：

10g氯化钠，1g明胶，加水至100ml。

5．醋酸铅试剂：

饱和醋酸铅溶液。

6．对甲基苯磺酸试剂：

20%对甲基苯磺酸氯仿溶液。

7．铁铵明矾试剂：

硫酸铁铵结晶（FeNH4（SO4）12H2O）lg，加水至100ml。

五、氨基酸多肽、蛋白质检出试剂

1．双缩脲（Biuret）试剂：

1%硫酸铜溶液。

40%氢氧化钠液。

应用前等量混合。

2．茚三酮试剂：

0.3g茚三酮溶于正丁醇100ml中，加醋酸3ml（或0.2g茚三酮溶于100ml乙醇或丙酮中）。

3．鞣酸试剂：

（一6）

六、有机酸检出试剂

1．溴麝香草酚兰试剂：

0.1%溴麝香酚兰（或溴酚兰、或溴甲酚绿）乙醇液。

2．吖啶试剂：

0.005%吖啶乙醇液。

3．芳香胺一还原糖试剂，苯胺5g，水糖5g溶于50%乙醇溶液中。

七、其它检出试剂

1．重铬酸钾一硫酸

5g重铬酸钾溶于100ml40%硫酸。

2．萤光素一溴：

0.1%萤光素乙醇液

5%溴的四氯化碳溶液。

甲液喷、乙液熏。

3．碘蒸气

4．硫酸液：

5%硫酸乙醇液，或15%浓硫酸正丁醇液。

或浓硫酸一醋酸（1：

1）。

5．磷钼酸、硅钨酸或钨酸试剂：

3~10%磷钼酸或钨酸乙醇液。

6．碱性高锰酸钾试剂：

1%高锰酸钾液。

5%碳酸钠液，用时等体积混合。

7．2，4-二硝基苯肼试剂：

取2，4-二硝基苯肼配成0.2%2N盐酸溶液或0.12%盐酸乙醇液。