戊地昔布对高糖培养的肾小管上皮细胞增殖的影响及其调控机制.docx

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戊地昔布对高糖培养的肾小管上皮细胞增殖的影响及其调控机制

戊地昔布对高糖培养的肾小管上皮细胞增殖的影响及其调控机制

（作者:

___________单位:

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作者：

刘淑霞张玉军刘青娟唐丽娟段惠军【摘要】目的探讨戊地昔布对高糖培养的肾小管上皮细胞增殖、核因子（NF）κΒ、环氧合酶（COX）2表达的影响。

方法将常规培养的人肾小管上皮细胞分为正常糖、高糖和高糖加200μmol/L戊地昔布组，72h后收集细胞，采用流式细胞术检测细胞的增殖指数（PI）；免疫细胞化学检测肾小管上皮细胞增殖细胞核抗原（PCNA）和NFκB蛋白的表达变化，流式细胞术检测肾小管上皮细胞中NFκB和COX2蛋白的表达情况。

结果

（1）与正常糖组比较，高糖组肾小管上皮细胞PCNA表达增强和PI升高（P＜0.01或P＜0.05）；而戊地昔布能够降低高糖培养的肾小管上皮细胞PCNA的表达和PI（P＜0.01）。

（2）正常糖组，NFκB主要表达在肾小管上皮细胞的细胞浆内，而高糖组NFκB表达增强，阳性表达主要定位于肾小管上皮细胞的细胞核内；高糖能够上调肾小管上皮细胞NFκB活化和COX2蛋白的表达（P＜0.01）；高糖加戊地昔布组NFκB及COX2表达均降低（P＜0.01）。

（3）NFκB和COX2呈显著正相关；同时COX2蛋白表达与PI呈显著正相关（P＜0.01）。

结论降低NFκB活化、下调COX2蛋白表达从而降低肾小管上皮细胞增殖可能是戊地昔布保护糖尿病时肾脏损伤的机制之一。

【关键词】戊地昔布；高糖;人肾小管近端上皮细胞；核因子κB；环氧合酶2【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectofvaldecoxibonthePI,NFκB/COX2signalpathwayofhumanrenalproximaltubularcells（HKCs）culturedinhighglucosemedium.MethodsHKCswereculturedseparatelyinnormal,highglucosemediumorhighglucose+200μmol/Lfor72h.ThePIwasdetectedbyflowcytometry;TheexpressionsofNFκBandCOX2proteinweredetectedbyflowcytometryandtheexpressionofPCNAwasdetectedbyimmunocytochemicalstaining.Results

（1）Comparedwiththoseinnormalglucosemediumgroup,theexpressionofPCNAandPIwereincreasedinhighglucosemediumgroup,whilevaldecoxibdecreasedtheexpressionofPCNAandPI.

（2）Innormalglucosemediumgroup,NFκBwerepositivelyexpressedincytoplasm,andtheywereexpressedinnucliofHKCsculturedinhighglucosemedium.TheexpressionsofNFκBandCOX2inhighglucosemediumgroupwerehigherthanthoseinnormalglucosemediumgroup;whichweredecreasedinhighglucose+valdecoxibgroup.（3）TheexpressionsofNFκBandPIwerepositivelycorrelatedwiththeexpressionofCOX2.ConclusionsValdecoxibhassomerenalprotectiveeffectondiabeticnephropathy,partlythroughinhibitionofcellproliferationbydownregulatingNFκBanddecreasingtheexpressionofCOX2.【Keywords】Valdecoxib;Highglucose;Humanrenalproximaltubularcells（HKCs）;Proliferation;NuclearfactorkappaB;Cyclooxygenase2近年研究表明，环氧合酶2（COX2）在肾小管上皮细胞中的表达升高可能与糖尿病的肾脏损害有关〔1〕。

戊地昔布是特异性COX2抑制剂，主要用于治疗骨关节炎、类风湿关节炎和原发性痛风〔2，3〕。

本课题组前期研究发现其能够抑制肿瘤细胞的生长〔4〕，但其对糖尿病肾病（DN）的作用尚未见报道。

本研究通过检测人肾小管近端上皮细胞（humanrenalproximaltubularcells,HKCs）核因子（NF）кB、COX2蛋白的表达，观察戊地昔布是否抑制高糖培养的HKCs增殖情况，并探讨其作用的可能机制。

1资料与方法1.1药品与试剂戊地昔布由河北医科大学药学院合成〔5〕，纯度99%，用DMSO配成250mmol/L母液，临用前稀释，浓度为200μmol/L；兔抗NFκB（SantaCruz公司）、COX2（Labvision公司）多克隆抗体，小鼠抗人增殖细胞核抗原（PCNA）单克隆抗体（北京中山生物工程公司），免疫组化试剂盒购自晶美公司。

1.2细胞HKC由解放军总医院陈香美教授惠赠。

1.3主要仪器设备流式细胞仪（EpicsXLⅡ型，美国），CO2培养箱（日本三洋公司产品）。

1.4HKC的培养取对数生长期的HKC，用2.5g/L胰蛋白酶消化，按1×104个/孔接种于6孔板和100ml培养瓶中，待细胞贴壁6h后，轻轻吸去上清，加入葡萄糖浓度分别为5.4、30和30mmol/L+200μmol/L的戊地昔布培养基，于培养的72h时收集细胞，6孔板用于免疫细胞化学检测，收集培养瓶中的细胞用于流式细胞学检测。

1.5流式细胞仪检测细胞的增殖活性收集培养72h后培养瓶中的细胞，70%的乙醇固定；取1×105/ml细胞，加入10%鸡红细胞作为内参标准，与样品同步染色，加入碘化丙啶（propidiumiodide,50mg/L，tritonx1001.0%）在4℃冰箱避光染色30min，用EpicsXLⅡ型流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期分布。

应用DNA细胞周期分析软件，计算出DNA组方图各时相分布的百分比，以增殖指数（PI）表示细胞的增殖活性，公式：

PI=（S期+G2M期）/（S期+G2M期+G0/G1期）×100%1.6免疫细胞化学检测HKC中PCNA和NFκB蛋白的表达变化将6孔板培养的细胞用PBS洗涤后，4%多聚甲醛固定，0.1%TrintonX100打孔过夜，羊血清封闭后滴加1∶100鼠抗人PCNA单克隆抗体和兔抗NFκBp65多克隆抗体4℃过夜，以PBS代替一抗作为阴性对照，DAB显色，光镜观察阳性信号。

PCNA阳性结果判定：

细胞核呈棕黄色为阳性细胞，将每张切片随机取10个高倍视野，应用HPIAS1000高清晰度彩色病理图文分析系统计算阳性率，以平均值代表切片的阳性表达。

NFκB阳性结果判断：

细胞浆或/和细胞核内出现棕黄的颗粒均为阳性表达。

1.7流式细胞术检测HKC中COX2和NFκB蛋白的表达采用间接免疫荧光标记方法，取单细胞悬液1×106/ml，加入兔抗人COX2和NFκBp65多克隆抗体，室温孵育30min，PBS洗涤后加入1∶50羊抗兔FITCIgG二抗工作液100μl避光室温孵育30min，PBS洗涤后进行EpicsXLⅡ型流式细胞仪检测。

设PBS代替一抗和二抗的阴性对照，以及只加一抗或二抗的阳性对照和同型对照。

以荧光指数（FI）表示COX2和NFκB蛋白的相对含量，公式：

FI=（样品蛋白表达的平均荧光强度-对照样品平均荧光强度）/正常对照样品平均荧光强度1.8统计学处理实验数据均用x±s表示，采用SPSS12.0统计软件进行方差分析和t检验;相关性分析采用Pearson法。

2结果2.1戊地昔布对高糖培养的HKC增殖的影响高糖能够增强HKC的增殖活性，PI升高（P＜0.05），而戊地昔布作用72h后，细胞的PI降低（P＜0.01），见表1。

免疫细胞化学结果显示，PCNA的阳性表达主要定位于细胞核内，呈棕黄色颗粒。

正常糖组HKC核内可见少量阳性表达，阳性细胞率为12.45%；而高糖组表达增强，72h时阳性表达率为90.91%，明显高于正常糖组；而高糖+戊地昔布作用72h后PCNA蛋白表达的阳性表达率为10.52%，明显低于高糖组（均P＜0.01）（图1）。

表1戊地昔布对高糖培养HKC、PI增殖指数、COX2和NFκB蛋白表达的影响2.2戊地昔布对高糖培养的HKC中COX2蛋白表达的影响流式细胞术检测结果显示，与正常糖组相比，高糖培养72h时，COX2蛋白表达明显增强，与正常糖组比较有显著性差异（P＜0.01）；而高糖+戊地昔布组COX2蛋白表达明显降低，与高糖组比较有显著性差异（P＜0.01）见表1。

2.3戊地昔布对高糖培养的HKC中NFκB蛋白表达的影响免疫细胞化学结果显示，正常糖组NFκB蛋白阳性表达主要定位于细胞浆内，呈棕黄色颗粒；高糖组其表达明显增强，阳性主要定位细胞核内，表明高糖能够活化NFκB，而高糖+戊地昔布组的HKC中NFκB蛋白阳性表达明显降低，尤其是细胞核的阳性表达降低（图2）。

流式细胞术结果显示，与正常糖组相比，高糖能够提高肾小管上皮细胞NFκB蛋白的表达（P＜0.01），而72h时高糖+戊地昔布组其表达降低，与高糖组相比有显著性差异（P＜0.01）（见表1）。

2.4相关性分析经Pearson相关分析，HKC中COX2蛋白的FI值与PI呈正相关（r=0.607，P=0.008）；COX2蛋白的FI值与NFκB蛋白的FI值呈显著正相关（r=0.888，P=0.000）。

3讨论COX是花生四烯酸转化为前列腺素的关键酶，有两种同工酶即COX1和COX2。

COX1为结构酶，表达于多数正常组织和细胞，与维持细胞自身生理功能的稳定有关；COX2为诱导酶，在正常组织中表达很低。

有关狼疮性肾炎活动期病人〔6〕、被动Heymann肾炎大鼠〔7〕及DN〔1〕的研究均提示COX2表达升高可能参与诱导肾脏的损伤。

本研究显示，高糖能够上调肾小管上皮细胞COX2蛋白的表达，同时细胞增殖活性增强，两者呈显著正相关，提示上调COX2表达可能是高糖促进肾小管上皮细胞增殖的机制之一。

NFκΒ是由两种Rel家族蛋白构成的二聚体蛋白质,其中P65/P50异源二聚体是NFκB的典型代表，p50含核定位信号,与DNA直接结合；p65含转录活化区域，参与基因转录的起始调节,具有转录激活功能〔8〕。

静息状态下，NFκB以非活性状态存在于细胞质中,不具有调节基因转录能力。

当细胞受到细胞因子、致凋亡因子、与细胞分裂增殖有关的因素等外来刺激时，NFκB可被活化，活化的NFκB进入胞核与核内DNA特定序列结合，调节相应基因的转录。

COX2基因启动子上具有NFκB5′（-455～-428kb），NFκB3′（232～205kb）两个NFκB结合位点，作为上游调节因子，NFκB可以通过作用于这些结合位点，而调节COX2基因转录、蛋白表达〔9〕。

本实验显示，在正常糖组NFκB主要表达在肾小管上皮细胞的胞浆内，为非活性状态，而在高糖培养组其表达增强，表达主要定位于肾小管上皮细胞的细胞核内，表明高糖组肾小管上皮中NFκB活化增强；且肾小管上皮细胞增殖活性增强；而戊地昔布组NFκB蛋白表达降低，肾小管上皮COX2表达亦降低，相关性分析NFκB与COX2蛋白表达呈显著正相关，提示在高糖环境下NFκB激活并转移至细胞核内，与COX2基因上的启动子结合从而上调COX2蛋白表达，引起肾小管上皮细胞增生。

而戊地昔布能够降低NFκB的表达，对COX2的转录调控活性减弱，COX2蛋白表达降低，从而抑制肾小管上皮细胞的增殖活性，对逆转DN肾脏体积增大有保护作用。

综上所述，活化NFκB、上调COX2蛋白表达从而引起肾脏固有细胞的增殖可能是糖尿病肾脏损伤的机制之一；而COX2特异性抑制剂戊地昔布可能直接或间接的抑制COX2蛋白的表达从而保护糖尿病患者的肾脏结构和功能。

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100816.4张玉军，刘淑霞，齐凤英，等.戊地昔布诱导人食管癌Eca109细胞凋亡的机制研究〔J〕.中国药理学通报，2006；22（5）:

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