基因诊断操作手册.docx
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基因诊断操作手册
基因诊断操作手册
一、外周血DNA提取，纯化和保存1
二、聚丙烯酰胺凝胶电泳3
三、DMD基因诊断与产前诊断7
四、SMA基因诊断与产前诊断12
五、使用SRY（Y染色体上性别决定区域）对性别发育异常进行基因诊断16
六、脆性X综合征的基因诊断与产前基因诊断19
七、男性原发性无精、少、弱精症诊断流程29
八、亲子鉴定32
九、母血鉴定33
十、MJRESEARCHPTC-200DNAENGINE操作规程38
十一、PCRSystem2720快速上机手册41
十三、W-CJ-IFD型无菌工作台标准操作程序45
十四、ThrmoOrion420+PH计46
一、外周血DNA提取，纯化和保存
外周血抽提DNA：
（1）取一支50ml离心管，加入40ml1×红细胞裂解液，加入3-5ml全血，充分混匀，等待溶液变澄清。
（2）溶液变澄清以后，以3000rpm，4℃，10min离心。
（3）倒净上清，加入3ml1×细胞核裂解液充分混匀后，放在振子上振匀，直到离心管底部不见细胞沉淀。
（4）加入300ul20%SDS，充分混匀。
（5）加入30ul蛋白酶K，充分混匀。
（6）放在37℃50rpm摇床上6小时以上或者过夜。
（7）取一支15ml离心管，加入6ml饱和酚，把消化好的血倒入这支离心管中。
颠倒离心管100次，充分混匀。
以3000rpm，4℃，10min离心。
（8）取上清至一支15ml离心管，加入3ml饱和酚，3ml氯仿。
颠倒离心管100次，充分混匀。
以3000rpm，4℃，10min离心。
（9）取上清至一支15ml离心管，加入6ml氯仿，颠倒离心管100次，充分混匀。
以3000rpm，4℃，10min离心。
（10）取上清至一支15ml事先加好10ml无水乙醇的离心管。
轻轻颠倒离心管，使DNA沉淀出来。
把沉淀连同约1ml无水乙醇吸入到一只1.5ml的EP管中。
（11）以13000rpm，4℃，5min离心该EP管。
（12）弃上清，70%乙醇洗两次。
空气晾干后，加入适量PCR水（400-600ul）。
转鼓上过夜混匀。
附：
10×红细胞裂解液：
NH4Cl82.9g（高压灭菌,4℃保存）
KHCO310g
EDTA0.37g（用于整合二价阳离子抑制DNA酶）
加dH2O至1000ml
1×细胞核裂解液：
1MTris-HClpH8.00.5ml3ml
4MNaCl10ml25ml
0.5mMEDTA0.4ml25ml
加dH2O至250ml（高压灭菌,4℃保存）
悬浮细胞抽提DNA：
可先用3ml的1×红细胞裂解液洗一次，2500rpm，10min,1×核裂解液600l，20%SDS30l，蛋白酶K4-6l，依细胞量而定，消化2h，（或放4℃过夜，第二天再处理），羊水可用异丙醇沉淀DNA。
贴壁细胞抽提DNA：
弃上清，加2-3ml破膜液或1×PBS洗1
（2）次，弃上清，吸尽余液；加1×核裂解液1ml（700l），20%SDS50l（40l），慢慢加，边加边观察溶液粘稠度，蛋白酶K10l，混匀，37℃摇床上2h（51rpm/分，3h）；取1ml（800l）饱和酚加入方形培养瓶，轻轻混匀，将混合液转移至15ml离心管，余下步骤同常规羊水DNA抽提（400l苯酚/400l氯仿→800l氯仿）
二、聚丙烯酰胺凝胶电泳
分为变性胶与非变性胶两种，区别在于前者中含有一定浓度的变性剂（尿素、甲酰胺或两者合用）。
其基本原理是单体丙烯酰胺在过硫酸铵与TEMED（N,N,N’N’-四甲基乙二胺）的催化与诱导下聚合成长链，当有N,N’-亚甲双丙烯酰胺参与聚合反应时，长链与长链之间就交联成凝胶，其孔径由链长与交联度决定，当DNA分子进入凝胶，在电场下进行泳动时，可根据各自迁移率的不同而得以分离。
非变性胶可用于双链DNA分子的分离与纯化，变性胶可用于单链DNA分子的分离与纯化。
由于变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可消除DNA分子不同构象对迁移率的影响，常用于进行遗传病家系的单体型分析。
1、试剂：
1）30%丙烯酰胺：
丙烯酰胺29g
N,N’-亚甲双丙烯酰胺1g
加去离子水至100ml室温避光保存
2）10%过硫酰铵（APS）：
过硫酰铵1g
加去离子水至10ml4℃避光保存
3）TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺）4℃避光保存
4）10×TBE：
Tris碱108g
硼酸55g
0.5MEDTA（pH8.0）40ml
加去离子水至1000ml高压蒸气灭菌，室温保存
5）8%丙烯酰胺（含50%尿素）：
丙烯酰胺38g
N,N’-亚甲双丙烯酰胺2g
10×TBE25ml
尿素250g
加去离子水至500ml室温避光保存
6）6×非变性载样缓冲液：
二甲苯青FF0.025g
溴酚蓝0.025g
0.5MEDTA（pH8.0）300l
蔗糖4g
加去离子水至10ml4℃保存
2×变性载样缓冲液：
二甲苯青FF0.0083g
溴酚蓝0.0083g
0.5MEDTA（pH8.0）100l
加去离子甲酰胺至10ml4℃保存
7）固定液：
无水乙醇50ml
冰醋酸2.5ml
加一蒸水至500ml
染色液：
AgNO31g
加一蒸水至500ml
显色液：
NaOH3.75g
甲醛（30%）2.7ml
加一蒸水至500ml
2、操作步骤：
1）选择合适的垂直电泳槽与大小相配的两块玻璃板（其中一块为U形），及两玻璃板间的间隔片和点样梳。
2）用洗涤剂清洗干净两块玻璃板，烘干或晾干。
3）装配灌胶板：
在两块玻璃板间放好间隔片，在玻璃板两边夹好夹子，插上点样梳，根据梳子的松紧调整间隔片及夹子的位置，在两块玻璃板的底边封好一层胶带。
4）配制胶液（丙烯酰胺有神经毒，操作时必须戴手套）。
6%非变性胶：
30%丙烯酰胺6ml
10×TBE1.5ml
10%过硫酸胺300l
去离子水加至30ml
8%变性胶：
8%丙烯酰胺（含50%尿素）50ml
10%过硫酸铵500l
5）封底胶：
胶液配好后，充分混匀，取出5ml胶液加入TEMED15l，快速混匀，将玻璃板倾斜，迅速倒进两块玻璃板之间封底。
6）灌胶：
待底胶凝固后，剩余胶液内加TEMED20l，混匀，将玻璃板倾斜，缓慢灌入胶液（注意灌胶时应连续，避免产生气泡，有气泡要及时去除）。
7）胶液灌好后，在玻璃板上方插入相应的点样梳（插梳子注意去除梳齿下残留的气泡，且不要将梳子全部插入胶内，留约2mm在胶外，以免拔梳子时将胶孔桥拔断）。
8）室温下让凝胶聚合约1-2小时。
9）配制1L0.5×TBE电泳缓冲液（50ml10×TBE加去离子水至1L），混匀后，加入上下电泳槽中。
10）小心拔下梳子，用电泳槽内的TBE冲洗胶孔（避免残留的丙烯酰胺再聚合，导致点样孔不整齐，影响电泳的带形），去掉封口的胶带以及玻璃板两边的夹子，将胶板用固定夹固定在电泳槽上（有凹面的玻璃朝向电泳槽），接通电源，300V（400V）预电泳10分钟。
11）非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时，在待上样的DNA样本中加入1/5体积的6×非变性载样缓冲液，混匀后上样（上样时注意不要有气泡冲散了样品，且上样速度尽量快些，以免样品扩散）。
上样结束后，300V恒压电泳，待二甲苯青FF指示剂电泳至合适的位置后停止电泳。
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时，在待上样的DNA样本中加入等体积的2×变性载样缓冲液，置PCR自动热循环仪上95℃变性5分钟，变性结束后样本立即插入冰上，上样（上样前需用注射器将上样孔再冲洗一次，以免残留的尿素结晶使得DNA电泳带型模糊变形）。
上样结束后350V恒压电泳（最好是用带循环水装置的电泳设备于50℃恒温电泳，可保证胶板温度均匀），待二甲苯青FF指示剂电泳至合适的位置后停止电泳。
12）电泳结束后取下胶板，小心掀开玻板，移去间隔片，用银染法显色：
将凝胶小心移入一托盘内，固定液固定2分钟，一蒸水漂洗一次→染色液染色10分钟→一蒸水漂洗两次，每次半分钟→显色液显色，至出现清晰DNA产物带型，凝胶用一蒸水漂洗一次后，转移到保鲜膜上，用保鲜膜包好。
电泳结果拍照或用图像处理系统进行扫描。
附：
表1DNA在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围及标准参照染料迁移率
聚丙烯酰胺[%（W/V）]
有效分离范围（bp）
二甲苯青FF
溴酚蓝
3.5
1000-2000
460
100
5.0
80-500
260
65
8.0
60-400
160
45
12.0
40-200
70
20
15.0
25-150
60
15
20.0
6-100
45
12
表2:
变性的聚丙烯酰胺凝胶中标准参照染料迁移率
%聚丙烯酰胺
溴酚蓝
二甲苯青FF
5
35
130
6
26
106
8
19
76
10
12
55
20
8
28
表3：
各浓度聚丙烯酰胺凝胶的配制
组分
制备浓度（%）
3.5
5.0
8.0
12.0
15.0
20.0
30%丙烯酰胺（ml）
11.6
16.6
26.6
40.0
50.0
66.6
双蒸去离子水（ml）
67.7
62.7
52.7
39.3
29.3
12.7
5×TBE（ml）
20
20
20
20
20
20
10%过硫酸铵（ml）
0.7
0.7
0.7
0.7
0.7
0.7
总体积
100ml
3、常见问题及对策
问题
可能原因
解决办法
带模糊或拖尾
1、胶板过热
2、缓冲液与凝胶TBE浓度不一致
3、DNA量太多
1、降低电压或缓冲
液离子强度
2、用同一批TBE制
胶及配制电泳缓冲液
3、减少点样量
带型扭曲
1、上样孔变型
2、泳道上有气泡
1、重新制胶
2、重新制胶
带型不平
1、底胶不平
2、胶板两边松紧不一
1、重新制胶
2、重新制胶
制胶时漏胶
1、底胶没封好
2、胶带封口不严
3、所用试剂失效（主要是10%APS）
1、重灌底胶
2、重新封口
3、重新配制试剂
三、DMD基因诊断与产前诊断
假性肥大型进行性肌营养不良（Duchenne/Beckermusculardystrophy,DMD/BMD）是一类发病率较高的X连锁隐性遗传病。
Duchenne和Becker型进行性肌营养不良（DMD/BMD），是常见的遗传性肌病，在3500个活产男婴中就有一个DMD患者，BMD的发病率约为1/30000。
二者是由DMD基因不同突变类型导致不同的临床表现。
DMD多于5岁前发病，表现为上楼梯困难，走路时呈鸭型步态，不能跳跃，常伴有肌肉假性肥大，以腓肠肌明显，病情进展迅速，大多在13岁之前失去独立行走能力，随着病情加重，20岁左右死于呼吸衰竭和/或心脏并发症。
与DMD相比，BMD起病年龄较晚，症状较轻、进展较缓慢，多于16岁之后失去独立行走能力，寿命可达到40~50岁。
充分了解DMD基因的特点、突变类型及特点，有助于我们有效选择适合的检测方法，为该类疾病的遗传咨询和产前诊断提供有效的信息。
以下是我室目前所用的方法。
一、基因诊断与产前诊断方法：
1、检测缺失：
多重PCR-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
2、连锁分析：
PCR-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（仅限于DMD/BMD疾病的分析）。
3、性别鉴定：
SRY（Y染色体上性别决定区域）的检测。
（仅限于产前诊断）
二、基因诊断流程：
临床确诊或高度怀疑为DMD/BMD（包括排除性诊断）→遗传咨询门诊就诊→采集家系成员抗凝外周血（先证者、母亲、父亲及先证者的兄弟姐妹与家系内的其他待证者）→提取gDNA→多重PCR-聚丙烯酰胺凝胶电泳（18个外显子）+PCR-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（DMD基因内部的9个位点）→发现缺失，在基因水平上可以确诊为DMD，未见缺失，在基因水平不能确诊，但也不能排除为DMD的可能（非缺失型或未检测的外显子缺失型或其他类型的缺失、重复、点突变等）。
通过连锁分析可以判断待证者是否遗传与先证者相同的DMD基因及DMD基因部分交换的情况，如携带致病DMD基因，男性为患者，女性为携带者；未遗传与先证者相同的致病DMD基因，则可排除患与先证者同类型DMD的可能。
三、产前诊断流程：
产前诊断必须建立在先证者基因诊断或临床诊断确诊为杜氏/贝氏进行性肌营养不良病患者的基础上！
有DMD家族史且先证者基因诊断确诊或临床确诊为DMD/BMD→遗传咨询门诊就诊→采集家系成员抗凝外周血及胎儿羊水或脐带血（先证者、母亲、父亲、胎儿及先证者的兄弟姐妹与家系内的其他待证者）→提取gDNA→多重PCR-聚丙烯酰胺凝胶电泳（18个外显子）+PCR-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（DMD基因内部的9个位点）+性别鉴定（SRY）→发现缺失，在基因水平上可以确诊为DMD，未见缺失，在基因水平不能确诊，但也不能排除为DMD的可能（非缺失型或未检测的外显子缺失型或其他类型的缺失、重复、点突变等）。
通过连锁分析可以判断待证者（包括胎儿）是否遗传与先证者相同的DMD基因及DMD基因部分交换的情况，如携带致病DMD基因，男性为患者，并建议其引产，女性为携带者，建议继续妊娠，但怀孕后必须对胎儿进行产前诊断；未遗传与先证者相同的致病DMD基因，则可排除患与先证者同类型DMD的可能，建议继续妊娠。
四、实验条件：
（SRY祥见脆性X）
外显子多重PCR扩增
A、B组mPCR组合及引物
外显子
引物名称
引物序列
片段（bp）
终浓度
（ng/ul）
A组
4
DMD-4F
5’-TTgTCggTCTCCTgCTggTCAgTg-3’
5’-AAgCCCTCACTCAAACATgAAgC-3’
196
1.0
DMD-4R
8
DMD-8F
5’-gTCCTTTACACACTTTACCTgTTgAg-3’
5’-ggCCTCATTCTCATgTTCTAATTAg-3’
360
1.8
DMD-8R
19
DMD-19F
5’-TTCTACCACATCCCATTTTCTTCCA-3’
5’-gATggCAAAAgTgTTgAgAAAAAgTC-3’
459
2.3
DMD-19R
44
DMD-44F
5’-CTTgATCCATATgCTTTTACCTgCA-3’
5’-TCCACACCCTTCAgAACCTgATCT-3’
268
1.35
DMD-44R
17
DMD-17F
5’-gACTTTCgATgTTgAgATTACTTTCCC-3’
5’-AAgCTTgAgATgCTCTCACCTTTTCC-3’
416
2.1
DMD-17R
45
DMD-45F
5’-AAACATggAACATCCTTgTgggAC-3’
5’-CATCCTATTAgATCTgTCgCCCTAC-3’
546
3.0
DMD-45R
48
DMD-48F
5’-TTgAATACATTggTTTAAAATCCCAACATg-3’
5’-CCTgAATAAAgTCTTCCTTACCACAC-3’
506
2.5
DMD-48R
51
DMD-51F
5’-gAAATTggCTCTTTAgCTTgTgTTTC-3’
5’-ggTAgAgTAAAgTgATTggTggAAAATC-3’
388
1.95
DMD-51R
60
DMD-60F
5’-AggAgAAATTgCgCCTCTgAAAgAgAACg-3’
5’-CTgCAgAAgCTTCCATCTggTgTTCAgg-3’
139
0.75
DMD-60R
B组
Pm
Pm-F
5’-gAgATCTAgCAgTggATACATAACAAATTgCATg-3’
5’-TTCTCCgAAggTAATTgCCTCCCAgATCTgAgT-3’
535
3.0
Pm-R
3
DMD-3F
5’-TCATCCATCATCTTCggCAgATTAA-3’
5’-CAggCggTAgAgTATgCCAAATgAAATCA-3’
410
2.2
DMD-3R
6
DMD-6F
5’-CCAgATgTAggTCAAAAATgTAATgAA-3’
5’-gTCTCAATCTTCTTACCTATgACTATgg-3’
202
1.05
DMD-6R
12
DMD-12F
5’-gATAgTgggCTTTACTTACATCCTTC-3’
5’-gAAAgCACgACgCAACATAAgATACACCT-3’
331
1.7
DMD-12R
13
DMD-13F
5’-AATAggAgTACCTgAgATgTAgCAgAAAT-3’
5’-CTgACCTTAAgTTgTTCTTCCAAAgCAg-3’
238
1.2
DMD-13R
43
DMD-43F
5’-gAACATgTCAAAgTCACTggACTTgATgg-3’
5’-ATATATgTgTTACCTACCCTTgTCggTCC-3’
357
1.9
DMD-43R
47
DMD-47F
5’-CgTTgTTgCATTTgTCTgTTTCAgTTAC-3’
5’-gTCTAACCTTTATCCACTggAgATTTg-3’
181
0.9
DMD-47R
50
DMD-50F
5’-CACCAAATggATTAAgATgTTCATgAAT-3’
5’-TCTCTCTCACCCAgTCATCACTTCATAg-3’
271
1.4
DMD-50R
52
DMD-52F
5’-AATgCAggATTTggAACAgAggCgTCC-3’
5’-TTCgATCCgTAATgATTgTTCTAgCCTC-3’
113
0.75
DMD-52R
mPCR扩增体系及条件
分别将9对引物按照一定比例混合，混合后每一对引物的中浓度在4~15ng/μl范围之内，分为A、B两组。
mPCR应用GoldTaqDNA聚合酶来扩增，反应体系为20ul（见表1-3）。
mPCR反应体系
试剂（Reagents）
体积（Volume）
10Buffer
2.0l
MgCl2
2.0l
dNTPs（10mM）
0.65l
GoldTaq（5U/l）
0.3l
Primers（4-15ng/l）
4.0l
DNA模板（30ng/l）
2.0l
ddH2OAddto
20.0l
mPCR反应条件和程序：
采用touchdown方法，前面10个循环中，每循环降低1℃、延长2s，共30个循环。
95℃11min→95℃60s
↙↖10cycle
62℃35s→72℃100s→95℃60s
（－1℃、+2s/cycle）↙↖22cycle
50℃40s→72℃90s→72℃20min→4℃∞
PCR产物检测：
聚丙烯酰胺凝胶电脉，银染法检测。
取PCR产物1.5ul（产量低要多加，产量高反之），6%聚丙烯酰胺凝胶电泳1.2小时，恒定电压300V。
银染后扫描。
连锁分析PCR：
9个微卫星位点引物序列
位点
引物名称
引物序列
长度（bp）
Tm值（℃）
2CA
2CA-F
5’-ttcagtttctctcggtgttcct-3’
5’-tacacctgcacatgtgatgaaa-3’
112
55
2CA-R
7CA
7CA-F
5’-ttctggttttctggtctg-3’
5’-gaatcaatctctctgtcaag-3’
226
52
7CA-R
44CA
44CA-F
5’-tccaacattggaaatcacatttcaa-3’
5’-tcatcacaaatagatgtttcacag-3’
196
57
44CA-R
45CA
45CA-F
5’-gaggctataattctttaactttggc-3’
5’-ctctttccctctttattcatgttac-3’
172
57
45CA-R
49CA
49CA-F
5’-cgtttaccagctcaaaatctcaac-3’
5’-catatgatacgattcgtgttttgc-3’
249
57
49CA-R
50CA
50CA-F
5’-aaggttcctccagtaacagatttgg-3’
5’-tatgctacatagtatgtcctcagac-3’
241
59
50CA-F
59CA
59CA-F
5’-tgtctgtcttcagttatatg-3’
5’-ataacttacccaagtcatgt-3’
251
51
59CA-R
63CA
63CA-F
5’-tagaacccaaatgacaacca-3’
5’-aagatagcaggcaacaataaga-3’
51
63CA-R
3’CA
3’CA-F
5’-tttccaaacttcactaaaac-3’
5’-aaaatgttgttgtactggtc-3’
133-139
59
3’CA-R
PCR反应体系为20ul（表1-6），反应程序为：
在95℃3min，95℃40s，于相应的Tm进行退火35s，72℃延伸35s（时间可根据片断大小进行调整），30-33个循环，72℃总延伸8min，4℃保存。
9个微卫星位点PCR扩增体系
试剂（Reagents）
体积（Volume）
10Buffer
2.0l
dNTPs（10mM）
0.4l
Taq（5U/l）
0.2l
Primers（100ng/l）
各0.5l
DNA模板（30ng/l）
2.0l
ddH2OAddto
20l
PCR产物检测：
变性聚丙烯酰胺凝胶电脉，银染法检测。
取PCR产物3-6ul（产量低要多加，产量高反之），加等量2×变性载样缓冲液，于96℃变性15分钟，立刻置冰上，8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳3-4小时（依片断大小而定），恒定电压350V。
银染后扫描。
四、SMA基因诊断与产前诊断
儿童期起病的进行性脊肌萎缩症（spinalmuscu2laratrophy,SMA）,是较常见的常染色体隐性遗传病。
本病由于下运动神经元变性导致进行性、对称性肌萎缩和肌张力减低。
其发病率为1∶6000～1∶10000[1],居致死性常染色体隐性遗传病的第2位,仅次于囊性纤维变。
儿童期的SMA分3型[2]:
SMAⅠ型,又称婴儿重型、Werdnig-Hoffmann病,患儿出生后6
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