第7章分光光度法分析.docx
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第7章分光光度法分析
第7章分光光度法（约3万字编者：
史建军）
[内容简介]分光光度法是目前应用最为广泛的一种分子吸收光谱法，主要用于试样中微量组分的定量测定。
本章着重介绍分光光度法的基本原理、分光光度计的主要部件和几种常见仪器的使用操作方法、可见分光光度法测定分析技术、目视比色法的原理和方法、分光光度法的实际应用等。
[学习要求]通过对本章的学习，要重点掌握光吸收定律、影响显色反应的因素和测量条件的选择、仪器的基本构造及使用方法、掌握利用分光光度计对试样进行分析测定的技能。
7.1概述
许多物质都是有颜色的，例如KMnO4水溶液呈紫红色，K2Cr2O7水溶液呈橙色，Ni（NO3）2水溶液呈绿色，Cu2+在水中呈蓝色等。
有些物质本身无色或是浅色，但当它们与某些试剂发生反应后，也可以生成有色物质，例如Fe3+与CNS–生成血红色配合物；Fe2+与1.10-邻菲罗啉（1,10-邻二氮菲）生成橙红色配合物；Cu2+与NH3生成深蓝色配合物等。
这些有色物质溶液颜色的深浅与溶液的浓度有关，溶液的浓度愈大，颜色就愈深。
浓度愈小，颜色就愈浅。
因此，在分析中利用比较溶液颜色的深浅来测定溶液中有色物质含量的方法称为比色分析法。
以人眼来检测溶液颜色深浅的方法称为目视比色法；以光电转换器来检测溶液颜色深浅的方法称为光电比色法。
利用分光光度计测定溶液对某一波长光的吸收程度来分析被测物质含量的方法称为分光光度法。
分光光度法不仅能在可见光区（400～780nm）测定有色物质的含量，还能在紫外（200～400nm）和红外光区（3000～40000nm）测定物质的含量和结构。
所以，分光光度法又分为可见分光光度法、紫外分光光度法、红外分光光度法。
本章仅着重讨论可见分光光度分析。
分光光度法具有以下特点：
（1）灵敏度高重量分析和容量分析一般只适应于常量组分（＞1％）的测定，不能测定微量组分（0.01％～1％）和痕量组分（＜0.01﹪），而分光光度法可测定浓度为10-5～10-6mol·L-1（达微克量级）的物质，相当于含量为0.001～0.0001﹪,甚至更低。
如果将被测组分事先加以富集（采用萃取、共沉淀等方法），灵敏度还可以提高。
非常适用于微量组分的测定。
（2）准确度较高分光光度分析一般相对误差为2﹪～5﹪，看起来它的准确度比重量分析法和容量分析法低得多，但对于微量组分的测定，已完全满足要求。
在微量的情况下，重量分析法和容量分析法是无法进行准确测定。
（3）操作简便，分析速度快分光光度法所使用的仪器设备并不复杂，操作也比较简单。
试验溶液进行分析时，一般只经历显色和吸光度测定两个步骤，就可以得出分析结果。
在生产过程的例行分析中，一般几分钟，甚至数十秒就可报出结果。
（4）使用成本低仪器设备价格便宜，分析时所用的试剂数量较少，因而使用费用较低。
（5）应用范围广几乎所有的无机物和许多有机物都可以直接或间接用此法进行分析测定。
因此，在石油、化工、冶金、国防、刑侦、环保、食品、质检、科研等领域应用十分广泛。
随着科学技术的迅猛发展，计算机技术在分析仪器制造中的广泛应用，各种新型智能分析仪器将不断出现，例如可自动计算、储存、分析数据，打印、显示反应浓度、酸度、时间、速度、温度与吸光度的关系等功能。
使人们获得更多、更准确、更全面的信息。
7.2光的吸收定律
7.2.1朗伯-比尔定律
7.2.1.1光的基本性质
光是一种电磁波，具有波动性和粒子性。
光既是一种波，它具有波长（λ）、频率（ν）和光速（c），它们的关系是
λ·ν=c（7-1）
式中λ的单位为nm（纳米）；ν的单位为Hz（赫兹）；c为3×1010cm·s-1（真空中）光也是一种粒子，它具有能量（E）。
它们的关系是
E=hν=h·
（7-2）
式中E为能量，单位是eV（电子伏特）；h为普朗克常数（6.627×10-34J·s）；ν为频率，单位是Hz；c为光速；λ为波长，单位是nm。
从式7-2可见，不同波长的光，能量不同，波长愈长，能量愈小，波长愈短，能量愈大。
将电磁波（光）按波长或频率排列成图表，则该表称为电磁波谱。
表7-1电磁波谱
波谱名称
波长范围
频率/MHz
光子能量/eV
跃迁能级类型
分析方法
γ射线
Χ射线
远紫外线
近紫外线
可见光
近红外线
中红外线
远红外线
微波
无线电波
5×10-3～0.14nm
10-2～10nm
10～200nm
200～380nm
400～780nm
0.75～2.5μm
2.5～50μm
50～1000μm
0.1～100cm
1～1000m
6×1014～2×1012
3×1014～3×1010
3×1010～1.5×109
1.5×109～7.5×108
7.5×108～4.0×108
4.0×108～1.2×108
1.2×108～6.0×106
6.0×106～105
105～102
102～0.1
2.5×106～8.3×103
1.2×1061.2×102
125～6
6～3.1
3.1～1.7
1.7～0.5
0.5～0.02
2×10-2～4×10-4
4×10-4～4×10-7
4×10-7～4×10-10
核能级
内层电子能级
原子及分子
的价电子或
成键电子能级
分子振
动能级
分子转
动能级
核自旋能级
Χ射线光谱法
真空紫外光谱法
紫外分光度法
可见分光光度法
近红外光谱法
中红外光谱法
远红外光谱法
微波光谱法
核磁共振光谱法
具有同一波长的光，称为单色光。
纯单色光很难获得，激光的单色性虽然很好，但也只是接近于单色光。
含有多种波长的光称为复合光，日光、白炽灯光等白光都是复合光。
能被人肉眼感觉的光称为可见光，其波长范围是400～780nm。
波长小于400nm的紫外光和波长大于780nm的红外光均不能被人的眼睛感觉，所以这些波长范围的光是看不到的。
在可见光范围内，不同波段的光刺激人的眼睛后，会产生不同颜色的感觉。
见表7-2。
日光中的可见光（白光也是复合光）就是这些不同波段的色光混合而成的。
把复合光分解成单色光的过程，叫光的色散。
当一束白光通过棱镜后就会色散为红、橙、黄、绿、青、蓝、紫七色光。
实验证明，不仅七色光可以混合成白光，其中的两种色光按一定强度混合也可以成为白光。
这两种白光称为互补色光。
图7-1中处于直线关系的两种色光为互补色光，例如橙色光和青蓝色光、绿色光和紫色光、黄色光和蓝色光都是互补色光。
表7-2各种色光的波长
颜色
波长
紫色
蓝色
青色
绿色
黄色
橙色
红色
400～450
450～480
480～500
500～560
560～590
590～620
620～760
图7-1互补色光示意图
7.2.1.2物质的颜色和对光的选择性吸收
（1）物质的颜色
如果把不同颜色的物体放在黑暗处，什么颜色也看不到。
可见，物质的颜色与光有密切的关系，物质的颜色由光的组成和物质本身的结构共同决定。
当白光照射到固体物质上时，如果物质对各种波长的光完全吸收，则呈黑色；如果完全反射，则呈白色；如果对各种波长的光均匀吸收，则呈灰色；如果选择吸收某些波长的光，则呈反射或透射光的颜色。
溶液呈不同颜色是由溶液中的离子或分子对不同波长的光具有选择性吸收而引起的，溶液的颜色是它吸收光的互补光色。
见表7-3。
表7-3物质的颜色与吸收光颜色和波长的关系
物质的颜色
吸收光
颜色
波长
黄绿
黄
橙
红
紫红
紫
蓝
青蓝
青
紫
蓝
青蓝
青
绿
黄绿
黄
橙
红
400～450
450～480
480～490
490～500
500～560
560～580
580～600
600～650
650～760
当一束光（强度为I0）通过下列几种溶液时，溶液呈现的颜色和吸收光的关系见图7-2，
（a）无色透明溶液（b）KMnO4溶液（d）K2CrO7溶液
（e）Fe（CNS）3溶液（f）黑色溶液（g）均匀吸收溶液
图7-2溶液呈现的颜色和吸收光的关系
（2）物质吸收光谱曲线
溶液对不同波长的光吸收程度并不相同，如果将不同波长的光依次通过某一固定浓度的溶液，测量每一波长下有色溶液对光的吸收程度（即吸光度），以波长为横坐标、以吸光度为纵坐标作图，得到一曲线。
曲线描述了物质对不同波长光的吸收能力，称为吸收光谱曲线。
如图7-3所示。
图7-3是三个不同浓度的KMnO4溶液的吸收光谱曲线。
从图上可以看出：
①KMnO4溶液对不同波长光吸收程
度不同，对波长为525nm的绿色光吸收
最多，在吸收曲线上形成一高峰（称为
吸收峰），而对红光和紫光吸收很少，
因此KMnO4溶液呈紫红色。
光吸收程度
最大处所对应的波长称为最大吸收波长
（常以λmax表示）。
在进行光度测定时，
选定在λmax处测量，可以得到最大的灵
敏度。
②不同浓度的KMnO4溶液的吸收曲
线形状相似，最大吸收波长也相同，所不
同的是吸收高峰随浓度的增加而增高。
③不同物质溶液的吸收曲线，其形状和最大吸收波长都各不相同。
因此，可以
利用吸收曲线作为定性、定量分析的依据。
7.2.1.3朗伯-比耳定律
（1）透射比和吸光度
当一束光通量为Φ0的单色光垂直照射在含有吸光物质的均匀溶液时，一部分光被溶液吸收，透过溶液的光通量Φtr减少。
其比值Φtr／Φ0表示溶液对光的透射程度，称为透射比（也称透光率），用符号τ表示。
τ=
（7-3）
可见透射比τ愈大说明溶液对光的透射程度愈大吸收愈小，反之τ愈小则溶液对光的透射程度愈小吸收愈大。
τ用百分数表示，又称百分透射比。
有色溶液对入射光的吸收程度称为吸光度（也称吸光率），用符号A表示,且
A=lg
=lg
=－lgτ（7-4）
（2）朗伯定律
1768年朗伯（S.H.Lambert）研究了物质对光的吸收与吸光物质的厚度的关系，证明入射光强度一定、溶液浓度、温度一定时，溶液的吸光度与液层厚度（b）成正比，即
A=k1b（7-5）
式中k1为比例常数，它与入射光的波长、溶液的性质、浓度和温度有关。
（3）比耳定律
1859年，比耳（Beer）研究了不同浓度的溶液对光吸收的定律，证明当入射光的强度、溶液液层厚度和温度一定时，溶液的吸光度与溶液的浓度（c）成正比，即
A=k2c（7-6）
（4）朗伯-比耳定律
当溶液厚度和浓度都可改变时，就要考虑两者同时对吸光度的影响，将朗伯定律和比耳定律合并为朗伯-比耳定律，即
A=kbc（7-7）
朗伯-比耳定律不仅适用于可见光，也适用于红外光和紫外光，它是分光光度法进行定量分析的理论基础。
应用朗伯-比耳定律的条件：
一必须使用单色光，二吸收发生在均匀的介质中，三吸收过程中，吸光物质互相不发生作用。
7.2.2朗伯-比耳定律在比色分析中的应用
7.2.2.1吸光系数
朗伯-比耳定律中的比例常数K称为吸光系数，其物理意义是：
单位浓度的溶液液层厚度为1cm时，在一定波长下测得的吸光度。
K值的大小取决于吸光物质的性质、入射光波长、溶液温度、和溶剂性质等，与溶液浓度和液层厚度无关。
但K值的大小因溶液浓度所采用的单位不同而不同。
（1）摩尔吸光系数
当溶液的浓度以物质的量浓度（mol·L-1）表示，液层厚度以厘米（cm）表示时，相应的比例常数K称为摩尔吸光系数，以ε表示，其单位为L·mol-1·cm-1。
因此，式（7-7）可改写成
A=εbc（7-8）
摩尔吸光系数的物理意义是：
浓度为1mol·L-1的溶液，于厚度为1cm的吸收池中，在一定波长下测得的吸光度。
摩尔吸光系数是吸光物质的重要参数，它表示物质对某一特定波长光的吸收能力。
ε愈大，该物质对某波长光的吸收能力愈强，测定的灵敏度也就愈高。
因此，测定时，选择摩尔吸光系数大的有色化合物进行测定，选择摩尔吸光系数值最大的波长作为入射光。
一般认为ε﹤1×104L·mol-1·cm-1灵敏度较低；ε在1×104～6×104L·mol-1·cm-1为中等灵敏度；ε＞6×104L·mol-1·cm-1为高灵敏度。
摩尔吸光系数由实验测得。
在实际测量中，不可能取1mol·L-1这样高浓度的溶液来测量摩尔吸光系数，只能在稀溶液中测量后，计算出摩尔吸光系数。
【例7-1】含Fe2+离子浓度500μg·L-1的溶液，与显色剂1.10-邻菲罗啉反应，生成橙红色配合物，在波长为508nm，吸收池的厚度为2cm条件下，测得吸光度为0.197，试计算有色物质1.10-邻菲罗啉亚铁的摩尔吸光系数
解Fe的摩尔质量为55.85g·mol-1
C（Fe2+）=
=8.95×10-6（mol·L-1）
故ε=
ε=
=1.1×104（L·mol-1·cm-1）
（2）质量吸光系数
质量吸光系数适用于摩尔质量未知的化合物。
若溶液的浓度以质量浓度ρ（g·L-1）表示，液层厚度以厘米（cm）表示，相应的吸光度为质量吸光度，以a表示，单位为L·g-1·cm-1。
式（7-7）可改写成
A=abρ（7-9）
7.2.2.2.吸光度的加和性
多组分体系中，在某一波长下，如果溶液中存在多种吸光物质，相互之间不发生作用，则溶液在该波长的总吸光度等于各组分吸光度之和，即吸光度具有加和性。
表示如下：
A总=A1+A2+A3+…+An=
（7-10）
利用这个性质，可以进行多组分混合物的定量分析。
7.2.2.3偏离光吸收定律的主要原因
根据吸收定律,当一定波长和强度的入射光通过一定厚度的溶液时，吸光度和溶液的浓度成正比，即A=kbc。
吸光度对溶液作图可得到一条过原点的直线，该直线称为标准曲线（或标准曲线）。
在实际工作中，
经常出现标准曲线不成直线或不通过原点的现
象，这种现象称之为偏离光吸收定律。
如果标准曲线向上偏（实际吸光度比理
论值大）称为正偏离光吸收定律；标准曲线
向下偏（实际吸光度比理论值小）称为负偏
离光吸收定律，如图7-4所示。
引起偏离光
吸收定律的原因很多，但主要有以下几方面。
（1）入射单色光不纯引起的偏离
吸收定律成立的前提条件是入射光为单色光，在实际工作中单色器提供的是波长范围较窄的光带，严格地说仍然是复合光。
由于物质对不同波长光的吸收程度不同（即吸光系数不同），导致偏离光吸收定律。
（2）溶液中的化学反应引起的偏离溶液中的吸光物质因离解、缔合、形成新的化合物而改变了吸光物质的浓度，导致对光吸收定律的偏离。
为此应控制好显色条件，控制溶液的化学平衡，防止偏离的产生。
（3）比耳定律的局限性引起的偏离比耳定律只适用于浓度小于0.01mol·L-1的稀溶液。
溶液浓度过高将导致偏离比耳定律。
因此在测量中，被测溶液的浓度要控制在0.01mol·L-1以内，避免产生偏离。
7.3显色反应及测量条件的选择
7.3.1影响显色反应的因素
7.3.1.1显色反应
在比色分析和可见分光光度分析中，要利用测量有色物质对某一单色光吸收程度来进行测定。
而许多物质本身无色或浅色，它们的吸光度很小，这就需要将试样中的被测组分转变成有色化合物，这种反应称为显色反应。
与被测组分反应生成有色化合物的试剂称为显色剂。
显色反应分为氧化还原反应和配位反应两大类，也可以兼有上述两种反应，其中配位反应应用最为普遍。
7.3.1.2对显色反应的要求
在分析测定中，同一组分可与多种显色剂发生显色反应，生成各种不同的有色物质。
选用那种显色剂较好呢？
应该考虑以下几个因素。
（1）选择性好。
一种显色剂最好只与一种被测组分起显色反，或显色剂与共存组分生成的有色化合物的吸收峰相隔较远，这样干扰少。
（2）灵敏度高。
分光光度法一般测定微量组分，这就要求灵敏度较高。
有色化合物的摩尔吸光系数愈大，灵敏度愈高。
但灵敏度高的显色反应，不一定选择性好。
对高含量的组分，并不要求高灵度的显色反应。
（3）有色化合物组成恒定，化学性质稳定。
在测定过程中吸光度才能保持基本不变，否则会影响吸光度测定的准确度和再现性。
（4）如果显色剂有色，则要求有色化合物与显色剂之间颜色差别要大，这样，试剂空白值小测定的准确度高。
（5）显色反应的条件要易于控制，保证有较好的再现性。
7.3.1.3显色剂
常用的显色剂有两大类，即无机显色剂和有机显色剂。
（1）无机显色剂许多无机试剂能与金属离子发生显色反应，如Cu2+与NH3·H2O形成深蓝色配合物Cu（NH3）
，CNS-与Fe3+形成红色的配合物Fe（CNS）3或Fe（CNS）2+等等。
但多数无机显色剂灵敏度和选择性都不高，性能较好有实用价值的无机显色剂如表7-4。
表7-4常用的无机显色剂
显色剂
测定元素
反应介质
有色化合物的组成
颜色
最大吸收波长
硫氰酸盐
铁
钼
钨
铌
铼
0.1～0.8mol·L-1HNO3
1.5～2mol·L-1H2SO4
1.5～2mol·L-1H2SO4
3～4mol·L-1HCl
6mol·L-1HCl
Fe（CNS）52-
Mo（CNS）6-MoO（CNS）52-
W（CNS）6-WO（CNS）52-
NbO（CNS）4-
ReO（CNS）-4
红
橙
黄
黄
黄
480
460
405
420
420
钼酸铵
硅
磷
钨
硅
磷
钒
0.15～0.3mol·L-1H2SO4
0.15mol·L-1H2SO4
4～6mol·L-1HCl
稀酸性
稀HNO3
酸性
硅钼蓝
磷钼蓝
磷钨蓝
硅钼杂多酸
磷钼钒杂多酸
磷钼钒杂多酸
蓝
蓝
蓝
黄
黄
黄
670～820
670～820
660
420
430
420
氨水
铜
钴
镍
浓氨水
浓氨水
浓氨水
Cu（NH3）42+
Co（NH3）62+
Ni（NH3）62+
蓝
红
紫
620
500
580
过氧化氢
钛
钒
铌
1～2mol·L-1H2SO4
6.5～3mol·L-1H2SO4
18mol·L-1H2SO4
TIO（H2O2）2+
VO（H2O2）3+
Nb2O3（SO4）2（H2O2）
黄
红橙
黄
420
400～450
360
（2）有机显色剂许多有机显色剂与金属离子形成稳定的配合物，且颜色鲜明，显色反应的选择性和灵敏度都比较高。
有机显色剂种类很多，实际应用广泛。
常用的有机显色剂见表7-5。
表7-5常用的有机显色剂
显色剂
测定元素
反应介质
λmax/nm
ε/（L·mol-1·cm-1）
磺基水杨酸
Fe2+
PH2～3
520
1.6×103
1.10-邻菲罗啉
Fe2+
Cu2+
PH3～9
510
435
1.1×104
7×103
丁二酮肟
Ni（Ⅳ）
氧化剂存在、碱性
470
1.3×103
1-亚硝基-2-苯酚
Co2+
415
2.9×104
钴试剂
Co2+
570
1.13×105
双硫腙
Cu2+、Pb2+、Zn2+、
Cd2+、Hg2+
不同酸度
490～550
（Pb520）
4.5×104～3×104
（Pb6.8×104）
偶氮砷（Ⅲ）
Th（Ⅳ）、Zr（Ⅳ）、La3+、Ce4+、Ca2+、Pb2+
强酸至弱酸
665～675
（Th665）
1×104～1.3×105
（Th1.3×105）
RAR（吡啶偶氮间苯二酚）
Co、Pd、Nb、Ta
Th、In、Mn
不同酸度
（Nb550）
（Nb3.6×104）
二甲酚橙
Zr（Ⅳ）、Hf（Ⅳ）、Nb（Ⅴ）、Uo22+、Bi3+、Pb2+
不同酸度
530～580
（Hf530）
1.6×104～5.5×104
（Hf4.7×104）
铬天菁S
Al
PH5～5.8
530
5.9×104
结晶紫
Ca
7mol·L-HClCHCl3丙酮萃取
5.4×104
罗丹明B
Ca、Tl
6mol·L-HCl苯萃取1mol·L-HBr异丙醚萃取
6×104
1×105
孔雀绿
Ca
6mol·L-HCl、C6H5Cl-CCl4萃取
9.9×104
亮绿
Tl
B
0.01～0.1mol·L-1
HBr乙酸乙酯萃取
PH3.5苯萃取
7×104
5.2×104
7.3.1.4影响显色反应的因素
显色反应是否满足分光光度法的要求，除了与显色剂的性质有关外，还与显色剂的用量、显色反应的酸度、显色温度、显色时间等因素有关。
如果控制不好这些显色条件，将会严重影响分析结果的准确度。
（1）显色剂的用量显色反应可以用下式表示：
M+R≒MR
（被测组分）（显色剂）（有色化合物）
从化学平衡角度看，为使显色反应尽可能地进行完全，一般需要加入过量的显色剂。
但也不是显色剂越多越好，显色剂太多，往往会引起副反应，对测定不利。
显色剂的适宜用量一般通过实验来确定，即作A-cR曲线，获得显色剂适宜的用量。
具体的方法是：
固定被测组分的浓度和其它条件，分别加入不同量的显色剂，测定其吸光度值，绘制吸光度（A）显色剂浓度（cR）曲线，一般可能出现以下三种情况，如图7-5。
图7-5（a）的曲线表明，显色剂浓度在a-b范围内吸光度出现稳定值，可以在这个范围内选择显色剂用量。
这类曲线较常见，显色反应生成的有色配合物较稳定，对显色剂用量控制要求不严格，适用于分光光度法。
图7-5（b）的曲线表明，显色剂浓度在a′-b′范围内吸光度比较稳定，因此要严格控制显色剂用量。
图7-5（c）曲线表明，吸光度随显色剂浓度的增大而增大，必须十分严格的控制显色剂用量，才能得到符合要求的分析结果。
（2）溶液的酸度溶液的酸度对显色反应的影响是多方面的，溶液的酸度直接影响金属离子和显色剂存在的形式、有色配合物的组成和稳定性。
因此，必须控制好溶液适宜的酸度。
1酸度对配合物组成的影响同种金属离子与同种显色剂反应，若酸度不同，生成配合物的配位数、颜色也不同。
例如Fe3+与水杨酸在不同酸度下，生成不同配位比的配合物。
PH=﹤4Fe（C7H4O3）+紫红色（1：
1）
PH≈4～7Fe（C7H4O3）2-橙红色（1：
2）
PH≈8～10Fe（C7H4O3）33-黄色（1：
3）
可见，控制一定的溶液酸度，得到组成恒定的有色配合物，才能获得好的分析结果。
②酸度对配合物稳定性的影响当溶液酸度增大时，显色剂的有效浓度减小，显色能力减弱，有色配合物的稳定性随之降低。
③酸度对显色剂颜色的影响许多显色剂是有机弱酸，本身就具有酸碱指示剂的性质，溶液酸度变化，显色剂的颜色也发生变化。
例如PAR（吡啶偶氮间苯二酚）用H2R表示，它的颜色与酸度的关系如下。
PH=2.1～4.2黄色（H2R）
PH=4～7橙色（HR-）
pH＞10红色（R2-）
PAR可与多种离子生成红色的配合物，在碱性溶液中显色剂本身的颜色与配合物的颜色相近，无法进行测定。
④酸度对金属离子存在状态的影响溶液酸度过低可能引起金属离子水解，破坏有色配合物组成和稳定性，使溶液颜色变化，无法准确测定。
故溶液酸度不能太低。
综上所述，酸
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