人血白蛋白药典注释.docx

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人血白蛋白药典注释

人血白蛋白

人血白蛋白是最早从人血浆提取并获得大规模生产和应用的血液制品。

白蛋白的研发始于二次世界大战，为抢救伤员美国哈佛大学医学院Cohn教授等人于1942年1月成功从人血浆提纯了白蛋白用于战时伤员抢救。

发展至今已有60年的历史。

我国人血白蛋白的生产始于上世纪70年代初期，《中国生物制品规程》1979年版开始收载，历经《中国生物制品规程》1990年版、2000年版、《中国药典》2005年版、2010年版收载。

人血白蛋白系由肝实质细胞合成，在血浆中的半寿期约为15-19天，是血浆中含量最多的蛋白质，占血浆总蛋白的40%-60%，每100ml血浆含3500-5500mg白蛋白。

白蛋白在体内的合成率虽然受食物中蛋白质含量的影响，但主要受血浆中白蛋白水平调节，在肝细胞中没有储存，在所有细胞外液中都含有微量的白蛋白。

人血白蛋白的分子结构为含610（585）个氨基酸残基的单链多肽，分子量为66458，分子中含17个二硫键，不含有糖的组分。

在体液pH7.4的环境中，白蛋白为负离子，每分子可以带有200个以上负电荷。

人血白蛋白的主要作用：

1.增加血容量和维持血浆胶体渗透压：

白蛋白占血浆胶体渗透压的80%，主要调节组织与血管之间水分的动态平衡。

由于白蛋白分子量较高，与盐类及水分相比，透过膜内速度较慢，使白蛋白的胶体渗透压与毛细管的静力压抗衡，以此维持正常与恒定的血容量；同时在血循环中，1g白蛋白可保留18ml水，每5g白蛋白保留循环内水分的能力约相当于100ml血浆或200ml全血的功能，从而起到增加循环血容量和维持血浆胶体渗透压的作用。

2.运输及解毒：

白蛋白能结合阴离子也能结合阳离子，可以输送不同的物质，也可以将有毒物质输送到解毒器官。

3.营养供给:

组织蛋白和血浆蛋白可互相转化，在氮代谢障碍时，白蛋白可作为氮源为组织提供营养。

主要适应于：

1.失血创伤、烧伤引起的休克。

2.脑水肿及损伤引起的颅压升高。

3.肝硬化及肾病引起的水肿或腹水。

4.低蛋白血症的防治。

5.新生儿高胆红素血症。

6.用于心肺分流术、烧伤的辅助治疗、血液透析的辅助治疗和成人呼吸窘迫综合征。

[制造概要]本品系由健康人血浆，经低温乙醇蛋白分离法分离纯化，超滤、除菌过滤、并经60℃10小时加温灭活病毒后制成。

1、原料血浆

原料血浆的采集及质量随着国家相关要求的提高变化，具体改变见“血液制品生产用原料血浆（注释）”

2、生产工艺

我国大约在上世纪八十年代中期左右开始血浆蛋白产品的工业化生产，而人血白蛋白是最早上市的血液制品之一，白蛋白的分离纯化工艺采用低温乙醇分级沉淀分离的方法，到组分Ⅴ白蛋白的纯度达到95%以上，到目前为止我国所有的血液制品厂家仍然采用此方法用于白蛋白的纯化生产，从八十年代中期到九十年代中期，国内的血液制品企业普遍采用Cohn－Oncley的五法或六法用于白蛋白的分离纯化，到九十年代中后期多数厂家改为Kistler-Nitschmann法[7]或及其改良法，同时将原来的固-液分离（沉淀分离）由原来的离心方式改为压滤的方式，到目前为止，几乎所有的国内生产企业都采用此种方式分离纯化白蛋白。

由于采用低温乙醇分离纯化工艺，白蛋白溶液中含有较多的乙醇，一般浓度在10%-15%,白蛋白生产的初期，多采用冻干的方式脱醇，到了八十年代后期，超滤技术开始应用于血液制品的生产，逐步采用超滤方式替代冻干去除乙醇。

九十年代末期以后我国的白蛋白生产工艺基本稳定。

白蛋白的生产过程中，其核心是分离纯化过程，其中低温乙醇分离纯化工艺中的一些关键参数对白蛋白的质量有直接影响，如白蛋白的纯度，多聚体含量，物理外观，稳定性等，这些关键的工艺参数包括pH，温度，酒精浓度，离子强度，蛋白浓度，这五个关键参数在低温乙醇分离工艺中又称为“五变因素”，是最重要的工艺参数，除此之外，还有乙醇的加入方式，速度，加压过滤分离时的压力，滤过速度等参数，也对产品的质量有重要影响。

（1）原料血浆

原料血浆经低温乙醇分离纯化后可得到白蛋白含量较高的中间组分如组分Ⅴ沉淀，如经批准该组分可作为中间品冻存，但存放的有效期不得超过批准的规定。

通常情况下，组分Ⅳ沉淀是白蛋白分离过程的废弃组分，但其中白蛋白含量可能较高，可用于进一步提取、回收白蛋白，采用组分Ⅳ沉淀为原料提取白蛋白时，需采用经批准的特定生产工艺。

（2）原液制备

原液系指原料经低温乙醇分级沉淀、分离纯化、并经超滤去除乙醇后的白蛋白组分，是人血白蛋白连续生产过程中的一个阶段，通常不作为中间产品保存。

（3）半成品

为保证人血白蛋白在效期内保存的稳定性，半成品配制时需加入保护剂，通常使用辛酸钠或辛酸钠和乙酰色氨酸。

（4）病毒灭活

白蛋白生产工艺及特定的病毒灭活手段是该制品病毒安全性的重要保证。

白蛋白制品均采用传统的巴氏消毒病毒灭活方法，将制品加入保护剂后置60℃±0.5℃水浴中连续加温至少10小时，可在制品分装前或分装后进行，制品分装后进行巴氏消毒可能会使分离纯化过程中没有完全去除的其他蛋白变性，因此制品分装后进行巴氏消毒对产品的纯度要求更高。

如果在分装前进行，应防止巴氏消毒后制品的污染，包括细菌的污染[1]。

经巴氏消毒灭活病毒处理的人血白蛋白在临床使用的安全纪录已有几十年历史，病毒灭活验证试验表明巴氏消毒可有效灭活HIV和相关模拟病毒，WHO相关指南中描述，将模拟病毒加入5%白蛋白溶液中，经60℃加温10分钟后已检不出病毒[1]-[4]。

（5）成品

①分装后孵育

自《中国生物制品规程》1990年版始，增订分装后的制品应置于20～35℃至少14天孵育，以检出可能出现的单支染菌制品；《中国生物制品规程》2000年版将此项规定修订为液体制品分装后应置20～25℃至少4周或30～32℃至少14天孵育；在此基础上，《中国药典》2005年版增订对不合格制品不能再用于生产的规定。

对于检出的制品如经无菌检查确证被细菌污染时，应对除菌分装过程进行回顾性分析，以评估整批制品微生物污染的安全性。

②规格

目前批准上市的人血白蛋白规格有5g/瓶、10g/瓶、12.5g/瓶（5%、10%、20%、25%）

（5）重滤和再制

2000年版及前面历版《中国生物制品规程》对于无菌检查及理化检查不合格的白蛋白制品允许采用适宜方法再制一次，并根据再制方法增加相应的检测项目。

为严格控制产品质量，自《中国药典》2005年版三部开始，取消重滤和再制的相关规定。

[原液检定]

《中国生物制品规程》1995年版始增订原液检定项。

残余乙醇含量：

乙醇属生产过程中使用的有机溶剂，按照《中国药典》2010年版三部凡例的相关要求（第二十项，第1条）生产过程中采用有机溶剂进行提取、纯化时，其残留量应符合附录ⅥV残留溶剂测定法的相关规定。

由于人血白蛋白原液的残余乙醇含量测定，主要用于控制生产工艺中超滤过程对乙醇的去除，可采用快速简便方法，如康卫扩散皿法，该法系依据乙醇在饱和碳酸钠溶液中加热逸出，被重铬酸钾硫酸溶液吸收后呈黄绿至绿色，用比色法测定血液制品中乙醇残留量该法为乙醇残余量限度测定法。

[半成品检定]

热原检查：

半成品热原检查可采用家兔热原试验法或细菌内毒素检查法，一般情况下，半成品配制以后直接分装至终容器，通常采用细菌内毒素检查法以尽快掌握分装后制品的内毒素污染情况。

采用细菌内毒素检查法时，根据制品浓度确定细菌内毒素限制应分别小于0.5EU/ml（5%）、0.83EU/ml（10%）1.67EU/ml（20%）2.08EU/ml（25%）。

[成品检定]

成品检定项目，包括钾离子含量、白蛋白聚合体、吸收度、热稳定性试验为《中国生物制品规程》1990年版开始增订；《中国生物制品规程》2000年版增订HCV抗体和HIV1/2抗体检测，之后根据WHO对血液制品病毒安全性评估的相关建议，自《中国药典》2005年版三部取消此项检测。

1.鉴别试验

1995年版《中国生物制品规程》开始增加白蛋白鉴别试验，采用免疫双扩散法。

《中国生物制品规程》2000年版开始增订免疫电泳法进行白蛋白鉴别试验；《中国药典》2010年版三部鉴别试验项（免疫双扩散法）除要求与抗马、抗牛血清不产生沉淀线外增订与抗猪、抗羊血清或血浆不产生沉淀线；正常人血清或血浆作为参考品用于免疫电泳试验。

2.物理检查

（1）不溶性微粒检查

依据《中国药典》2010年版三部附录制剂通则中注射剂项下对溶液型静脉用注射液、注射用无菌粉末及注射用浓溶液的要求，人血白蛋白制品成品检定增订不溶性微粒检查。

美国药典USP30-NF25、欧洲药典EP6.0、英国药典（BP2008版）中对人血白蛋白、静注人免疫球蛋白的不溶性微粒均未做规定，但在注射剂项下，不溶性微粒均为必检项目，检测方法和标准规定均与《中国药典》2005年版二部附录相同。

以《中国药典》2005年版二部附录为基础拟定附录方法。

以光阻法测定判定结果，不符合规定或供试品不适于用光阻法测定时，应采用显微计数法进行测定，并以显微计数法的测定结果作为判定依据，

（2）渗透压摩尔浓度

溶液的渗透压，依赖于溶液中溶质离子的数量，是溶液的依数性之一，通常以渗透压摩尔浓度（Osmolality表示，它反映的是溶液中各种溶质对渗透压贡献的总和。

血液渗透压决定血液中细胞膜两侧水份的转移，正常的血液渗透压对于维持红细胞的体积和形态正常具有重要作用。

体外溶血性试验表明，在等渗环境时人血白蛋白中不含促溶血性物质，对羊血红细胞、人血红细胞均不发生溶血。

脆性试验（渗透压改变引起的溶血）表明，当人血白蛋白溶液渗透压低至140mOsmol/kg时，开始出现溶血。

依据《中国药典》2010年版三部附录制剂通则中注射剂项下对静脉输液应按各品种项下的规定，进行渗透压摩尔浓度测定并应符合规定的要求，增订白蛋白渗透压摩尔浓度测定，以进一步保证本品临床使用的安全性和产品质量的批间一致性。

USP30、EP6.0均未规定白蛋白的渗透压摩尔浓度，以钾、钠离子限度控制产品渗透压。

采用冰点下降法测定人血白蛋白成品渗透压。

以白蛋白成品中蛋白浓度为5%～25%（渗透压理论值约为10～70mOsmol/kg）、钠离子不得过160mmol/L（含氯化钠、辛酸钠，n均以1.84计的渗透压理论值为294mOsmol/kg）计算，本品渗透压理论值最大约360mOsmol/kg。

考虑到临床等渗要求，以及已上市人血白蛋白渗透压的实际情况，将人血白蛋白成品的渗透压限度规定为210～400mOsmol/kg。

（3）装量

《中国药典》2005年版三部开始对人血白蛋白成品增订装量检查，采用标化的容器测定制品装量。

《中国药典》2010年版三部规定按单剂量供试品装量检查法进行，增加称重法（密度法）测定装量。

（4）热稳定性试验

1990年版《中国生物制品规程》开始对人血白蛋白成品增订热稳定性试验，其主要目的在于考察白蛋白生产工艺及其效期内稳定性。

除美国药典（32版）外、欧洲药典（6.0版）、英国药典（？

？

）、日本药典（？

？

）均无此项要求。

3.化学检定

（1）蛋白质含量

按凯氏定氮法的钨酸沉淀法进行，测定供试品的总氮含量以及经钨酸沉淀去除蛋白的供试品滤液中的非蛋白氮含量，计算出蛋白质的含量。

根据《中国药典》2010年版三部凡例的相关要求以及上市产品的实际情况，增订蛋白质含量上限为不高于标示量的110%。

（2）纯度

采用醋酸纤维素薄膜电泳法测定白蛋白纯度，白蛋白在醋酸纤维素薄膜上，在电场的作用下，带电粒子按各自的速度向极性相反的电极方向泳动，使组分分离成狭窄的区带，经氨基黑或丽春红染色后，在色谱扫描仪上纪录各组分的曲线图，以人血清为对照，按峰面积计算白蛋白含量。

（3）钾、钠离子

采用火焰光度法测定，将供试品经雾化为气溶胶引入火焰光源中，其中的原子在火焰中被激发而发射出特定波长的光线，通过光电检测系统测量出待测元素特征谱线的强度，以求出供试品中待测元素的含量。

以标准溶液的浓度对其相应的发光强度作直线回归，将供试品溶液的发光强度带入直线回归方程，求出待测元素的含量。

（4）人血白蛋白多聚体测定法

1990年版《中国生物制品规程》开始对人血白蛋白成品增订多聚体含量测定，采用SephadexG-200凝胶柱层析法。

1995年版《中国生物制品规程》开始采用高压液相分子排阻色谱法测定人血白蛋白多聚体含量。

以白蛋白单体峰与二聚体峰计算分离度，应大于1.5，按白蛋白单体峰计算拖尾因子，应为0.95～1.40。

常用色谱柱为亲水硅胶高效体积排阻色谱柱（SEC，排阻极限300kD，粒度10μm），柱直径7.5mm,长60cm；每个样品分析时间纪录60分钟，（因为色谱柱和仪器的差异保留时间不同，无法固定）按面积归一法计算，色谱图中未保留（全排阻）峰的含量（%除以2，即为人血白蛋白多聚体含量。

（5）辛酸钠测定法（气相色谱法）

《中国生物制品规程》1995年版始，增订对保护剂辛酸钠的含量测定并规定限值。

采用气相色谱法测定，用酸改性聚乙二醇（20M）毛细管柱，火焰离子化检测器。

辛酸峰与庚酸峰的分离度应大于1.5，辛酸峰的拖尾因子应为0.95～1.20，辛酸峰与庚酸峰面积之比的相对标准偏差（RSD）应不大于5％。

以辛酸对照品溶液峰面积与内标峰面积比对各辛酸对照品溶液辛酸量（μg作直线回归，求得回归方程，计算出供试品辛酸钠含量。

采用不同厂家的仪器及毛细管柱时，应适当调整试验条件。

（6）乙酰色氨酸含量

为《中国药典》2010年版新增订检测项目。

采用紫外分光光度法（吸收系数法），通过测定供试品在280nm处的吸光度，测定人血白蛋白供试品中的N-乙酰–DL-色氨酸含量。

（7）铝残留量

为《中国药典》2005年版新增订检测项目，检测方法及限度参照欧洲药典的相关规定（5.0。

人血白蛋白中铝离子的残留主要来源于蛋白分离过程中所使用的过滤介质（如助滤剂、滤材等），以及制品贮存过程中由玻璃分装容器释放产生。

采用原子吸收分光光度法测定铝残留量，将供试品原子化产生铝原子蒸气，吸收特征谱线，通过测定辐射光强度减弱程度，比较对照品和供试品溶液的吸光度，求出供试品中铝含量。

4.激肽释放酶原激活剂（PKA含量

PKA是人血桨中的微量蛋白组分之一，分子量约为35,000，等电点为

4.2-4.4。

PKA的活性在于通过作用于前激肽释放酶生成激肽释放酶，激肽释放酶作用于血浆激肽原，生成活性产物激肽，激肽是体内的血管舒张物质之一[5]-[6]。

临床上快速输注血液制品可引起病人的血压下降。

采用低温乙醇法分离血液制品时，PKA主要分布在免疫球蛋白等组分中，通常情况下白蛋白中PKA活性较低。

自《中国生物制品规程》2000年版始，对采用组分Ⅳ分离的人血白蛋白增订PKA活性检测，限度定为不高于35IU/ml，《中国药典》2005年版三部对人血白蛋白的相关规定同《中国生物制品规程》2000年版一致。

为加强对起始原材料的控制，《中国药典》2010年版三部对直接采用血浆生产的人血白蛋白增订激肽释放酶原激活剂含量测定，限度仍为应不高于35IU/ml。

激肽释放酶原激活剂（PKA含量测定采用显色底物法（或显色基质法）。

于供试品中加入前激肽释放酶（PK），在PKA的作用下生成激肽释放酶，使显色基质S-2302显色，在特定波长下测定吸光度，将标准品溶液PKA活性的对数对其相应的吸光度对数进行线性回归，求出回归方程，代入供试品吸光度计算其PKA活性。

5.乙肝表面抗原

《中国生物制品规程》1990年版始增订此项检测，要求试剂盒灵敏度为3ng/ml以下；《中国生物制品规程》1995年版对原料血浆规程中供血浆者增订乙肝疫苗免疫的规定，因此在白蛋白成品检定项下取消此项检测；为进一步保证血液制品病毒安全性，《中国生物制品规程》2000年版开始在白蛋白成品检定项下再次增订此项检测，同时增订应为国家药品当局批准的试剂盒，以保证试剂盒的灵敏度和特异性要求。

6.异常毒性试验

异常毒性试验包括豚鼠和小鼠试验，主要检测非制品本身引起的动物毒性反应。

自《中国生物制品规程》1990年版始，小鼠试验由尾静脉注射修订为腹腔注射。

[保存、运输及有效期]

根据上市批准产品及稳定性试验结果，《中国生物制品规程》2000年版增订本品可在室温（30℃）下保存和运输的规定；按照统一制定治疗类生物制品有效期起始时间的相关原则，《中国药典》2005年版将本品有效期起始时间从血

浆投产之日修订为分装之日；在此基础上《中国药典》2010年版将所有生物制品有效期起始时间统一为自生产之日（半成品配制之日）起计算。

本品可在2-8℃或室温避光保存和运输，自生产之日（半成品配制之日）起，有效期为3年或5年，不同保存条件的有效期应根据实际存放条件下的稳定性确定，为保证上市后产品的质量和监管，标签只能规定一种保存温度和有效期。

[使用说明]

2000年版及以前的历版《中国生物制品规程》均在品种后收载使用说明，自《中国药典》2005年版始，由于治疗类生物制品使用说明不再按标准管理，因此在品种后不再收载相应使用说明。

《中国药典》2010年版三部在凡例中规定，对于血液制品的使用说明，要求增加病毒安全性的警示：

因生产用原料来自人血，虽然对原料血浆进行了相关病原体的筛查，并在生产工艺中加入了去除和灭活病毒的措施，但理论上仍存在传播某些已知和未知病原体的潜在风险，临床使用时应权衡利弊。

[剂型]

目前上市的人血白蛋白剂型有：

人血白蛋白注射液（人血白蛋白）和人血白蛋白冻干制剂（冻干人血白蛋白），规格有5g、10g、12.5g（5%、10%、20%、25%）

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