我们的结果提示,vaspin具有拮抗IL.1p诱导的关节软骨细胞炎症和降解反应。
以往的一些研究表明,区别于脂肪因子家族其他成员的作用,vaspin对某些细胞具有抗炎抗凋亡的作用[27,31,58]。
Vaspin在血管平滑肌细胞中表现出来拮抗TNF。
旺介
万方数据
浙江大学博士学位论文3、协pin对培养软骨细胞具有抗炎抗降解作用
导的炎症反应【271,而在慢性肝炎模型中,vaspm具有抑制炎症因子TNF.仪和同家族促炎因子leptin和resisfin的作用【321。
然而,vaspin在软骨细胞中的作用此前并无相关研究报道,我们本部分的研究结果首次揭示了vaspin对软骨细胞具有抗炎抗降解作用。
在此部分实验中,我们发现vaspin对体外培养的软骨细胞具有抗炎抗降解作用,但是其发挥作用的浓度并不一致。
在较低的浓度(10-50ng/ml范围),vaspin显著抑制了IL一1B介导的降解酶类因子MMP一2,MMP.9和ADAMTS一5的基因表达,而当浓度达到了100ng/ml以上直到500ng/ml,这种作用并不显著,况且对于另外一个重要的降解酶因子ADAMTS一4来说,各个浓度均未达到显著抑制作用。
Vaspin低浓度具有抗降解作用,而高浓度却无法抑制IL.1B介导的降解作用,是否意味着vaspin在软骨细胞中具有双向作用,具体的作用机制是值得我们进一步深入研究的。
另外,vaspin对抗IL—lp介导的炎症反应呈现出浓度依赖性,较高浓度的vaspin(100ng/ml以上)显著抑制了IL—lp介导的COX.2,PGE2和iNOS含量升高,这个结果明确提示了vaspin对软骨细胞具有的抗炎作用。
然而,相关的抗炎分子机制并不明确,需要进一步研究。
3.5小结
1)浓度达500ng/ml的vaspin对关节软骨细胞活性无影响。
2)Vaspin可拮抗IL一1p介导的关节软骨细胞降解因子MMP.2,MMP一9和
ADAMTS.5的基因表达,以及炎症因子COX一2,PGE2和iNOS表达。
40
万方数据
浙江大学博士学位论文4Vaspin拮抗IL-IB介导的软骨细胞炎症降解作用的分子机制研究
4Vaspin拮抗IL一1ljI介导的软骨细胞炎症降解作用的分子机制研
究
4.1引言
OA以关节软骨进行性退变为特点,炎症因子和降解因子都发挥了重要作用,其中的分子机制是非常复杂的,多种信号通路包括晚期糖基化终末产物/受体信号通路(Advancedglycationendproducts/receptor,AGEs/RAGE)[59,60],丝裂原活化蛋白酶(Mitogen.activatedproteinkinase,MAPK)【61】,Wnt/13一连环蛋白‘621和核转录因子kappaB(NuclearfactorkappaB,NFrd3)信号通路参与了OA病程的发展。
其中
NFrA3信号通路在OA发病中的作用受到了研究者的重视。
IL.1p可激活NFrd3信号通路,而NFvd3信号通路的激活可以诱发下游诸多炎症因子和降解酶因子的转录,从而降解破坏关节软骨【631。
针对NFrd3信号通路的研究用于治疗OA已被众多研究者所意识到【201。
在上一部分研究中,我们的研究结果表明,在体外培养的关节软骨细胞中,低浓度的vaspin(10-50ng/m1)具有拮抗IL一1p介导的细胞降解因子MMP一2,MMP一9和ADAMTS.5的基因表达,而高浓度的(100ng/ml以上)vaspin具有抑制IL—lp介导的细胞上清液中炎症因子COX一2,PGE2和iNOS的表达。
然而,vaspin对IL一1p拮抗作用和上述因子的抑制作用分子机制尚不明确。
因此,在本部分研究中,我们研究了vaspin拮抗IL.1p的具体分子机制。
有研究表明,vaspin能够通过抑制信号通路NF.1(B的活化从而抑制TNF一伐介导的血管平滑肌细胞凋亡和炎症反应‘271,在体外培养的血管平滑肌细胞中,随着vaspin浓度的升高,显著抑制了NF—rd3的磷酸化和Ird3一cc的降解【271。
此外,不同的学者还发现在体外培养的内皮细胞中,vaspin能够通过抑制NF.rd3信号通路的激活,起到抗炎作用[64,65]。
这些研究结果均表明,在不同的细胞中,vaspin可以通过抑制NF.r.B信号通路达到抑制炎症的目的。
因此,我们猜测vaspin在软骨细胞
万方数据
浙江大学博士学位论文4Vaspin拮抗IL.113介导的软骨细胞炎症降解作用的分子机制研究
中的抗炎作用,是否也与抑制NF一1(B信号通路有关。
本部分研究采用上一部分实验中建立的大鼠关节软骨细胞培养方案,用
Westernblot方法检测了vaspin对IL.1p刺激后关节软骨细胞中NFr.B信号通路的
影响。
用ELISA法检测NF—r.B信号通路抑制剂(BAY11.7082)对软骨细胞上清液中COX.2,PGE2和iNOS的含量变化。
4.2材料与方法
4.2.1主要实验仪器
台式离心机德国Heraeus公司
低温高速离心机德国Heraeus公司
4摄氏度冰箱德国Siemens公司
-80摄氏度冰箱日本Sanyo公司
无菌操作台美国Thernlo公司
细胞培养箱日本Sanyo公司
称量天平美国Ohaus公司
移液器德国Eppendorf公司
光学显微镜日本OLYMPUS公司
雪花状制冰机美国RossTemp公司
高压蒸汽灭菌器日本Sanyo公司
离心管美国Coming公司
细胞培养板美国Coming公司
细胞计数板上海精密仪器仪表有限公司
一次性过滤器上海半岛实业有限公司
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浙江大学博士学位论文4Vaspin拮抗IL-1B介导的软骨细胞炎症降解作用的分子机制研究
紫外分光光度仪美国HewlettPackard公司
恒温水浴箱上海医用恒温设备厂
水平摇床江苏太仓市科教器材厂
25cm2细胞培养瓶美国Coming公司
6cm2细胞培养皿美国Coming公司
4.2.2实验试剂
人重组vaspin美国PeproTech公司
人重组IL—lp美国Sigma公司
4周龄SD大鼠浙江大学动物中心
高糖DMEM培养基美国Gibco公司
青一链霉素美国Gibco公司
PBS美国Gibco公司
0.2%链酶蛋白酶美国Sigma公司
0.1%胶原酶美国Sigma公司
胎牛血清美国Gibco公司
o.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)美国Gibco公司
二甲基亚砜(DMSO)美国Sigma公司
去离子水美国Sigma公司
细胞浆、核蛋白提取试剂盒江苏碧云天生物公司
过硫酸铵美国Promega公司
四甲基乙二胺(TEMED)美国BioRad公司
BCA蛋白质分析测定试剂美国Pierce公司
丙烯酰胺美国AMRESCO公司
N,N.亚甲双丙烯酰胺美国AMRESCO公司
十二烷基硫酸钠(SDS)美国AMRESCO公司
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万方数据
浙江大学博士学位论文4Vasp_in拮抗IL-1B介导的软骨细胞炎症降解作用的分子机制!
!
壅Tris(Z羟甲基氨基甲烷)美国AMRESCO公司
5×蛋白质上样缓冲液美国Pierce公司
二硫苏糖醇(DTT)美国Invirtrogen公司
BAY1l一7082美国Calbiochem公司
4.2.3实验试剂的配制
4.2.3.130%丙烯酰胺
29%丙烯酰胺
1%N,N’.亚甲双丙烯酰胺用ddH20溶解后室温保存。
4.2.3.21.5M"Iris—HCI(pH8.8)
Tris碱19.159蒸馏水40ml
溶解后用浓盐酸调pH至8.8,加水至100ml,4摄氏度保存。
4.2.3.31MTris-HCl(pH6.8)
Tris碱13.19蒸馏水40ml
溶解后浓盐酸调pH至6.8,加蒸馏水至100ml,4摄氏度保存。
4.2.3.41MDTTDTT3.099
0.01M的乙酸钠溶液20ml(pH5.2)
万方数据
浙江大学博士学位论文4vasp.m拮抗IL-l8介导的软骨细胞炎症降解作用的分子垫趔翌究
溶解后分装,.20摄氏度保存。
423510%SDS
109SDS溶于ddH20后定容至100ml。
4.2.3.610%过硫酸铵o.19过硫酸铵溶于lmlddH20,一20摄氏度保存,每周配制。
4.2.3.78%分离胶(Sml)
ddH202.3ml
30%丙烯酰胺1.3ml
1.5MTris(pH8.8)1.3ml
10%SDS0.05ml
10%过硫酸铵0.05ml
TEMED0.003ml
4.2.3.85%积层胶(2m1)
ddH204ml
30%丙烯酰胺0.33ml
1Mtris(pH6.8)0.25ml
10%SDS0.02ml
10%过硫酸铵0。
02ml
TEMED0.002ml
4.2.3.95xTris一甘氨酸电泳缓冲液
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万方数据
浙江大学博士学位论文4Vaspin拮抗lL-IB介导的软骨细胞炎症降解作用的分子机制研究
Tris碱15.19
甘氨酸949
SDS59
ddH20800ml
临用前以ddH20稀释至1×浓度的电泳缓冲液。
4.2.3.105xTBS
Tris碱12.19
NaCl40.99
ddH20800mI
用HCl调pH值至7.4后定容至1000ml。
4.2-3.11I×TBST
5xTBS用ddH20稀释至1×,加入o.1%的Tween20,搅拌均匀。
4.2.3.125x转膜缓冲液
Tris碱15.19
甘氨酸729
SDS59
ddH20800ml
定容至1000mi,临用前稀释至l×,并加15%甲醇,现配现用。
4.2.3.13封闭液
脱脂奶粉59
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万方数据
浙江大学博士学位论文.4Vaspin拮抗m—l13介导的软骨细胞炎症降解作用的分子机制研究
TBST100ml
4摄氏度保存
4.2.3.145x上样缓冲液
1.0MTris(pH6.8)0.6ml
50%甘油5ml
10%SDS2ml
p.巯基乙醇0.5ml
1%溴酚蓝lml
ddH200.9ml
4.2.4实验方法和步骤
4.2.4.1大鼠关节软骨细胞培养见上一部分实验的细胞培养部分。
4.2.4.2大鼠关节软骨细胞处理
大鼠关节软骨细胞按1x106/皿接种于6cm2细胞培养皿中。
待细胞长满板底约80%左右时,换无血清培养基过夜进行同步化处理。
其后大鼠关节软骨细胞用0、10、50,100、250和500ng/ml浓度的vaspin预处理24小时,然后加入IL.1p(最
终浓度10ng/m1),继续孵育1小时,收集软骨细胞进行Westernblot检测。
另外,将软骨细胞按2.0x104/孔接种于24孔细胞培养板中。
待细胞长满板底约80%左右时,换无血清培养基过夜进行同步化处理。
其后软骨细胞用NFr,B抑制剂(BAY11-7082,1州)预处理1小时,然后加入IL-11](最终浓度10ng/m1),
继续孵育24小时。
最后收集细胞上清,进行ELISA检测。
47
万方数据
浙江大学博士学位论文4Vaspin拮抗IL.113介导的软骨细胞炎症降解作用的分子机制研究4.2.4.3Westernblot检测
4.2.4.3.1蛋白的提取吸去培养基,用冷PBS洗涤2次,每次3分钟,然后每个培养皿中加入lml
预冷的PBS,用刮除法在冰上收集软骨细胞,收集后再用预冷的PBS洗涤2次,
弃上清。
然后使用蛋白提取试剂盒,根据说明书逐步操作,提取胞浆蛋白。
4.2.4.3.2蛋白浓度测定
蛋白定量采用Bradford测定法,用BSA(0,0.2,0.5,0.75,1.0,1.5,3.0,5.0,7.5,10.099/m1)绘制标准曲线,取5山样品,用ddH20稀释到259l,其后加入2009l工作液,在570nm下测定吸光度,根据标准曲线计算相应的结果,蛋白浓度为测
定结果的5倍。
4.2.4.3.3丙烯酰胺凝胶电SDS—PAGE
取相当于5099蛋白的样品,加入等量的5xSDS上样缓冲液,100摄氏度煮沸5分钟,冷却后放于冰上备用。
先配制8%分离胶,用水封闭,室温放置30分钟后分离胶凝固,其后灌注5%积层胶,插入Teflon梳子,室温放置30分钟,待积层胶凝固后取出梳子,清洗加样孔,放入电泳槽中,加入Tris。
甘氨酸缓冲液,在上样孔中加入样品及Marker,接通电源,积层胶恒压50V,分离胶恒压100V,
电泳至适当位置。
4.2.4.34转膜
裁取适"-3大小的PVDF膜和4张3M滤纸,PVDF膜依次浸泡于无水甲醇及转膜液中,滤纸浸于转膜液中,平衡20分钟,膜放阳极、胶放阴极,两面各垫2张3M滤纸及1块海绵,然后置入转膜槽中,于250mA恒流转膜,时间根据目的蛋白大小调节。
4.2.4.3.5封闭
万方数据
浙江大学博士学位论文4Vaspin拮抗IL-10介导的软骨细胞炎症降解作用的分子机制研究
将转有蛋白的膜浸于含5%脱脂奶粉的TBST中封闭液中封闭1小时。
4.2.4.3.6杂交
取出封闭好的膜,孵育一抗,垂直混悬仪4摄氏度过夜,BST漂洗lo分钟×3次,孵育二抗,室温缓摇l小时,TBST漂洗10分钟×3次。
4.2.4.3.7压片、洗片
取出膜,配制显色液(ECLA液0.7mI+ECLB液0.7m1),加在膜上,5分钟后吸去多余液体,保鲜膜封膜,固定在暗盒中。
压片后分别过显影液(30秒)、清水、定影液(30秒)洗片显影。
4.2.4.3.8数据分析
采用Bandscan5.0软件分析条带的光密度值,目的蛋白相对表达量=目的蛋白(光密度值)/内参13-actin(光密度值)进行表示,结果以平均数土标准差表示。
4.2.4.4ELISA检测
方法见上一部分实验的ELISA方法。
4.2.5统计学分析
实验结果用SPSS16.0统计软件分析处理,结果以均数4-标准差表示,所有均数土标准差均来自3次独立实验的结果,均数差异性比较采用t检验。
以P4.3结果
4.3.1Vaspin抑制IL一1p介导的NFrB磷酸化和IKB一位的降解此前的研究部分我们低浓度的vaspin能够抑制IL—lp介导的体外培养关节软骨
细胞中降解因子的基因表达,而高浓度的vaspin能够抑制细胞上清液的COX一2,
PGE2和iNOS的含量。
这种抑制作用的机制尚不明确,为此,我们初步探索了vaspin对上述炎症降解因子作用可能涉及的信号通路。
本部分实验中,我们直接观察了
49
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浙江大学博士学位论文4Vaspin拮抗IL-1B介导的软骨细胞炎症降解作用的分子机制研究
不同浓度vaspin对NFrB信号通路的影响。
结果发现,IL-113作用大鼠关节软骨细胞后,可引起NFr.B磷酸化含量增加,而IrB.Ct的分解增加。
但是加入不同浓度(10—500ng/m1)的vaspin之后,随着浓度的增加,即可抑制抑制IL一1D介导的NFrB磷酸化和Ir,B.q的降解,当浓度达100ng/ml时,NFr.B的磷酸化被显著抑制,而当浓度达50ng/ml时,Ir,B.O【的分解抑制达到显著差异水平(P<0.05)(图4.1)。
Ai黪≤灏辆麟霸垂滚斓蘩鳓蝴醪囊黼瓣。
鳓㈣黪p-NF-r.B
钢懒睡囊黪攀黉鳜灞獭黪舞懒嘲猁嘲黪黪Ird3。
理
1:
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m—18。
++++++
Vaspin(ng./m1)--lo50100250500
DDO140
O120
100
80
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《暑。
碍。
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O
鲫%:
霁狮∞撼∞5O20
OO
一++++++一+++÷++IL-113
Vaspia(ng/mb一一lO50100250500一一1050100250500
图4.1Vaspin抑制IL一1p介导的NFgB磷酸化和IKB一仪的降解,经不同浓度的vaspin干预后加入IL一1p(10ng/m1)。
孵育24小时。
士P<0.05(与IL一1p刺激组相比)
4.3.2信号通路抑制剂BAYll一7082对细胞上清液COX一2,PGE2和iNOS含量的
影响
50
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浙江大学博士学位论文4vaspin拮抗IL-IB介导的软骨细胞炎症降解作用的分子机制研究
为进一步验证NFr:
B信号通路在软骨细胞炎症因子表达中的作用,我们用NFvd3抑制剂BAYll-7082干预软骨细胞,用ELISA方法检测细胞上清液中COX.2,PGE2和iNOS含量的变化。
ELISA结果表明,加入NFv.B抑制剂后,细胞上清中COX一2,PGE2和iNOS的含量与IL一1p组相比有均有明显下降,达到显著差异水平(P<0.05)。
(图4.2,图4.3,图4.4)。
£)毒詈胃受
oo
ILI13(10ng/m1)一++
BAYl1-7082一一+
图4.2信号通路抑制剂BAYll一7082对细胞上清液中COX.2的影响。
士p<0.05(与Ⅱ一1p刺激组相