细胞培养基础知识.pdf
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细胞培养基础知识细胞培养基础知识InvitrogenProprietary&Confidential2价值和信任的历史价值和信任的历史GIBCO自1962年开始生产用于细胞培养的动物血清，是此行业的开创者。
在四十年的岁月里，一直保持在技术和品质方面的领先水平。
血清和培养基的市场占有率常年蝉联全球第一。
GIBCOGIBCO血清生产的纵向整体化管理血清生产的纵向整体化管理从血液收集到最终产品检验和内部稽核的每一个步骤，GIBCO都采用专用设备和标准操作程序。
这种严格的控制可保证产品的高品质和最低的批间差。
可追踪性：
血清品质的证据可追踪性：
血清品质的证据GIBCO收集并保留从采血、处理、检测到发运的全部文件供追踪之用。
Gibco品牌品牌InvitrogenProprietary&Confidential3细胞培养相关设备细胞培养相关设备CO2培养箱，水浴，离心机，液氮罐，显微镜InvitrogenProprietary&Confidential4细胞培养基本流程细胞培养基本流程基础培养基基础培养基+FBS+添加剂添加剂+抗生素抗生素去除去除Media用用PBS清洗清洗加入加入Trypsin以分离贴壁以分离贴壁细胞细胞将部分细胞将部分细胞传代到新的传代到新的Media中中InvitrogenProprietary&Confidential51.细胞培养主要成分细胞培养主要成分基本培养基血清细胞培养试剂（抗生素、细胞解离，生长因子等）平衡盐溶液真核细胞InvitrogenProprietary&Confidential6培养基必须提供所有基本的营养培养基必须提供所有基本的营养InvitrogenProprietary&Confidential7经典培养基的应用经典培养基的应用BME（BasalMediumEagle）:
是由是由Eagle发明的，是最简单的培养基，只有发明的，是最简单的培养基，只有11种氨基酸和盐及一些维生种氨基酸和盐及一些维生素。
最先用于培养小鼠的素。
最先用于培养小鼠的L细胞和人类细胞和人类HeLa细胞，现在广泛用于各种细胞细胞，现在广泛用于各种细胞的培养的培养EMEMorMEM（EaglesMinimumEssentialMedium）:
是是BME的升级版，氨基酸浓度是的升级版，氨基酸浓度是BME的两倍，适用于更多的细胞的两倍，适用于更多的细胞DMEMorDME（DulbeccosModificationofEaglesMedium）是是Dulbecco改进的改进的MEM.氨基酸和维生素浓度是氨基酸和维生素浓度是BME的的4倍倍.最先葡最先葡萄糖的浓度是萄糖的浓度是1g/L，称为低糖称为低糖DMEM,后来增加到后来增加到4.5g/L，称为高糖称为高糖DMEM，广泛用于各种细胞培养。
广泛用于各种细胞培养。
InvitrogenProprietary&Confidential8经典培养基的应用经典培养基的应用M199（Medium199）:
是一种比较古老的，配方复杂的，含有核苷酸，核酸等成分的培养基。
最初是一种比较古老的，配方复杂的，含有核苷酸，核酸等成分的培养基。
最初用于鸡胚肌细胞的培养，还用于各种细胞的维持和病毒生产用于鸡胚肌细胞的培养，还用于各种细胞的维持和病毒生产RPMI1640（RoswellParkMemorialInstitute#1640）:
是是McCoys5A的改进版，含有高浓度的肌醇。
广泛用于悬浮细胞的培养。
的改进版，含有高浓度的肌醇。
广泛用于悬浮细胞的培养。
如人类白细胞，骨髓瘤细胞，杂交瘤细胞等血液来源的细胞如人类白细胞，骨髓瘤细胞，杂交瘤细胞等血液来源的细胞HamsF10（HamsNutrientMixtureF10）:
由由Ham发明，用于人类发明，用于人类2倍体细胞和仓鼠细胞的培养。
倍体细胞和仓鼠细胞的培养。
HamsF12（HamsNutrientMixtureF12）:
F10的升级版，含有更多的维生素，肌醇，氨基酸。
用于培养大鼠，兔子和的升级版，含有更多的维生素，肌醇，氨基酸。
用于培养大鼠，兔子和鸡胚细胞，还用于中国仓鼠卵巢细胞以及肺细胞的培养鸡胚细胞，还用于中国仓鼠卵巢细胞以及肺细胞的培养InvitrogenProprietary&Confidential9基本培养基用途基本培养基用途InvitrogenProprietary&Confidential10GIBCO培养基的培养基的4种形式种形式即用型即用型（1X）液体培养基液体培养基:
直接用直接用培养基浓缩液培养基浓缩液（10Xor50X）:
用前需要稀释成用前需要稀释成1干粉培养基干粉培养基DPM（DryPowderMedia）:
需要在水中溶解需要在水中溶解,加入碳酸氢钠加入碳酸氢钠,调调pH值值,然后过滤才可以用然后过滤才可以用高级颗粒技术培养基高级颗粒技术培养基AGT（AdvancedGranulationTechnologyTM）:
比比DPM形式的培养基更容易溶解的颗粒状的培养基形式的培养基更容易溶解的颗粒状的培养基.AGT是完全为工业产量的用户开发的是完全为工业产量的用户开发的,pH提前调好了提前调好了,所有的成分都所有的成分都提前混合好了提前混合好了,只需要加水溶解和过滤。
只需要加水溶解和过滤。
InvitrogenProprietary&Confidential11优点优点:
节省空间节省空间特性特性:
干粉状形式节省空间需要在超纯水中溶解需要加入碳酸氢钠需要调节pH需要用0.22um的滤膜过滤缺点缺点:
耗时耗时干粉培养干粉培养基基液体培养基液体培养基液体形式直接可以使用不需要另外加入其他成分不需调pH不需过滤什么东西都不需要自己准备不需调pH高价值费空间高价格InvitrogenProprietary&Confidential12培养基的保存及运输培养基的保存及运输干粉：
干粉：
22年年液体：
液体：
1010个月个月浓缩液体：
浓缩液体：
1212个月个月所有的培养基都必须在所有的培养基都必须在2288，避光避光保存保存，不能冷冻不能冷冻，干粉培养基可在室干粉培养基可在室温情况下运输。
温情况下运输。
InvitrogenProprietary&Confidential13含有含有L-Glutamine的液体培养基的液体培养基12个月个月不含不含L-Glutamine的液体培养基的液体培养基18个月个月干粉培养基，干粉培养基，3年年培养基的保质期培养基的保质期InvitrogenProprietary&Confidential14GIBCO培养基的类型培养基的类型传统培养基传统培养基要添加血清要添加血清（5-10%）的培养基的培养基高级培养基高级培养基（Advancedmedium）浓缩了营养物质和其他成分的培养基浓缩了营养物质和其他成分的培养基,只需要只需要2%的血清的血清（减少减少50-90%）减少不同批次血清带来的差异和试血清的麻烦减少不同批次血清带来的差异和试血清的麻烦,节省时间和花费节省时间和花费无血清培养基无血清培养基（无血清培养基无血清培养基/无蛋白培养基无蛋白培养基/化学定义的培养基化学定义的培养基）使用时无须再填加血清使用时无须再填加血清,主要用于生物产品生产主要用于生物产品生产,干细胞研究等干细胞研究等专用培养基专用培养基针对角质细胞、淋巴细胞、造血细胞、内皮细胞、肝细胞、神经元细胞、针对角质细胞、淋巴细胞、造血细胞、内皮细胞、肝细胞、神经元细胞、胚胎干细胞、胚胎干细胞、CHO细胞、细胞、293细胞、各类昆虫细胞、杂交瘤细胞、细胞、各类昆虫细胞、杂交瘤细胞、羊水细胞等的无血清培养基羊水细胞等的无血清培养基InvitrogenProprietary&Confidential15血清血清的作用血清血清的作用附着因子纤连蛋白，提高粘性增殖、分化所需的激素和生长因子调节膜的渗透性生长因子、脂类、酶和微量元素的载体缓冲液毒素灭活作用保护作用:
pH波动,蛋白酶,有毒试剂,机械损伤InvitrogenProprietary&Confidential16GIBCO动物血清的动物血清的种类种类胎牛血清（FBS）:
-原产地（美国；澳大利亚；巴西；新西兰等）原产地（美国；澳大利亚；巴西；新西兰等）-经过鉴定的经过鉴定的（certified）vs质量有保证的质量有保证的（qualified）新生牛血清（NBS）:
-出生少于十四天出生少于十四天小牛血清:
-出生少于一年出生少于一年捐献血清:
-特殊饲养的，专门用来进行血清提取的牛特殊饲养的，专门用来进行血清提取的牛其他血清:
-horse,chicken,goat,lamb（羊）（羊）,porcine（猪）（猪）,rabbitInvitrogenProprietary&Confidential17血清血清的类型血清血清的类型热灭活:
（在56水浴30min）热灭活一些可以产生免疫应答反应的物质（补体等）在昆虫细胞培养和胚胎干细胞培养中需要透析:
透析掉小分子量的物质离子，氨基酸用于标记低IgG:
我们有自己独特的层析技术去除球蛋白经过处理将IgG去除用于免疫学研究及其生产生物制品胚胎干细胞专用:
胚胎/间充质干细胞专用维持干细胞处于为分化状态-射线照射处理的血清（客户订制）InvitrogenProprietary&Confidential18血清血清CertifiedFBSVsQualifiedFBSCertifiedFBS和和QualifiedFBS都通过以下测试都通过以下测试无菌，醋酸纤维素介质中的电泳图谱，渗透压，pH值，总蛋白，病毒检测，内毒素和支原体对对Certified胎牛血清，除以上检测外，还进行如下检测：
胎牛血清，除以上检测外，还进行如下检测：
噬菌体检测；生物化学检测（碱性磷酸酶等21项内容）；激素检测（雌二醇等5项内容）；Sf9细胞生长InvitrogenProprietary&Confidential19血清可追踪性：
血清品质的证据血清可追踪性：
血清品质的证据GIBCO收集并保留从采血、处理、检测到发运的全部文件供追踪之用血清通常具有3-5年的保质期血清的性能可能会随着每批，和季节的不同而不同在拿到每一批血清前应该进行验证通常,购买一次血清最好足够1-2年使用，确保每一瓶都一样，而不需要每次都进行验证InvitrogenProprietary&Confidential20培养效能检测培养效能检测对所有的胎牛血清，GIBCO都进行以下培养效能检测。
选择胎牛血清的最重要的标准是其支持特殊的细胞生长的能力，因此，除了保证血清通过严格的品质控制，GIBCO也同时在实验室条件下对血清的三个重要的培养效能进行检测：
集落效率检定：
集落效率检定：
分析每一批胎牛血清促成单一细胞集落的能力，及促进老鼠骨髓瘤细胞及其衍生的融合瘤细胞的生长能力。
实际应用在低密度非贴附性细胞的集落形成、融合瘤发育以及单克隆抗体的制造。
贴附效率检定：
贴附效率检定：
利用一贴附的、已转型的人类细胞株来检测每一批血清促使低密度细胞贴附及分裂的能力。
实际应用在低密度或正常密度、转型细胞株及细胞株的繁殖。
二倍体成纤维细胞生长促进检定：
二倍体成纤维细胞生长促进检定：
评估每一批血清能维持难培养的贴附细胞长期生长的能力。
培养数代WI-38人类二倍体成纤维细胞，计算每一代培养的细胞总数。
此项检测所挑选出的胎牛血清批号能维持难以生长的细胞、贴附性细胞、正常的细胞株的生长及存活。
此外，对部分胎牛血清，我们也进行昆虫细胞生长促进检定：
昆虫细胞生长促进检定：
评估每一批Certified等级胎牛血清，及特定批号的Qualified等级的胎牛血清其促进SF9昆虫细胞生长的能力。
此项测试为选择适合昆虫细胞生长及BEVS实验的胎牛血清最佳指标。
InvitrogenProprietary&Confidential21其它检测其它检测对Certified胎牛血清，除以上检测外，还进行如下检测：
噬菌体检测；噬菌体检测；我们利用适当的大肠杆菌，例如K12，进行噬菌体溶菌斑记数分析。
此检测可以了解胎牛血清收集与制造过程的产品质量，噬菌体浓度高表示胎牛血清的原料处理有问题。
生物化学检测生物化学检测（碱性磷酸酶等21项内容）；激素检测激素检测（雌二醇等5项内容）；血红蛋白检测血红蛋白检测其它其它对EScell-QualifiedFBS,要进行特殊检测以确定对胚胎干细胞未分化的细胞形态的维持能力。
对小牛血清和新生牛血清小牛血清和新生牛血清，我们进行其对VERO细胞生长的支持能力的检测；对马血清马血清，我们进行其对Sp2/O-Ag14细胞生长的支持能力的检测；对部分血清，我们也进行细胞毒性的检测。
InvitrogenProprietary&Confidential22有关血清的常见问题有关血清的常见问题1.保存血清最好的方法保存血清最好的方法?
我们建议血清应保存在-5至-2O。
然而，若存放于4时，请勿超过一个月。
若您一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。
2.如何解冻血清才不会使产品质量受损如何解冻血清才不会使产品质量受损?
我们建议您将血清从冷冻箱取出后，先置于28冰箱使之融解，然后在室温下使之全融。
但必须注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。
3.血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理?
血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白（形成凝血的蛋白之一）在血清解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。
但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。
若您欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起过滤。
我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞您的过滤膜。
InvitrogenProprietary&Confidential234.为什么要热灭活血清为什么要热灭活血清?
加热可以灭活补体系统。
激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。
在免疫学研究，培养在免疫学研究，培养ES细胞，昆虫细胞和细胞，昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。
平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。
5.有必要做热灭活吗有必要做热灭活吗?
实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。
经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。
而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。
因此我们建议您，若非必须，您可以不需要做热处理这一步。
如此一来，不但节省您宝贵的时间，更确保血清的质量!
有关血清的常见问题有关血清的常见问题InvitrogenProprietary&Confidential246.为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀?
GIBICO的胎牛血清没有预老化，储存在28时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。
这应该不会影响血清的质量。
推荐在20储存胎牛血清，避免反复冻融。
7.如何避免沉淀物的产生如何避免沉淀物的产生?
我们建议您在使用血清的时候，注意下列的操作:
解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法（-20至4至室温），若血清解冻时改变的温度太大（如-20至37），实验显示非常容易产生沉淀物。
解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。
请勿将血清置于37太久。
若在37放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。
血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。
若必须做血清的热灭活，请遵守56，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。
温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。
有关血清的常见问题有关血清的常见问题InvitrogenProprietary&Confidential25基本培养基如何选择基本培养基如何选择DMEM或者或者RPMI-培养基培养基额外的营养物质额外的营养物质无酚红无酚红GlutaMAXEarles平衡盐平衡盐Hanks平衡盐平衡盐不含钙离子不含钙离子高细胞密度？
高细胞密度？
激素作用激素作用/比色分析？
比色分析？
长时间培养？
长时间培养？
高高CO2压力压力低低CO2压力压力悬浮细胞培养悬浮细胞培养HEPES低低CO2/无血清？
无血清？
高葡萄糖高葡萄糖高代谢率高代谢率/高细胞密度？
高细胞密度？
InvitrogenProprietary&Confidential26血清固有的问题血清固有的问题非目的细胞过度生长非目的细胞过度生长下游处理下游处理残留蛋白的抗原性残留蛋白的抗原性中和抗体的存在造成产量下降中和抗体的存在造成产量下降增加污染的可能增加污染的可能引起细胞分化引起细胞分化InvitrogenProprietary&Confidential27Serum-FreeMedium（SFM）WHY?
成分更加清晰成分更加清晰消除因血清批次不同而带来的不确定性消除因血清批次不同而带来的不确定性保持实验的连续性保持实验的连续性易于纯化和下游处理易于纯化和下游处理优化特殊细胞及其功能的培养条件优化特殊细胞及其功能的培养条件越来越多的无血清培养基越来越多的无血清培养基用非动物用非动物/人来源的原料制造人来源的原料制造有利于精确阐述细胞功能有利于精确阐述细胞功能提高生产力提高生产力更好控制生理反应更好控制生理反应专门针对角质细胞、淋巴细胞、造血细胞、内皮细胞、肝细胞、神专门针对角质细胞、淋巴细胞、造血细胞、内皮细胞、肝细胞、神经元细胞、胚胎干细胞、经元细胞、胚胎干细胞、CHO细胞、细胞、293细胞、各类昆虫细胞、细胞、各类昆虫细胞、杂交瘤细胞、羊水细胞的无血清培养基杂交瘤细胞、羊水细胞的无血清培养基InvitrogenProprietary&Confidential28Serum-FreeMedia（SFM）无需加入血清可能包含降解的蛋白或者蛋白块蛋白含量保持在易于纯化的最小状态优化特殊细胞培养条件Protein-FreeMedia（PFM）无蛋白（不同的厂商有不同的说明）包含起源于动物或者植物的不明确的提取物Chemically-DefinedMedia（CDM）无蛋白和不明确的成分所有的成分都有一个明确的结构，可以提供性能一致的产品,减少批次间的差别SFM,PFM和和CDM培养基的区别培养基的区别InvitrogenProprietary&Confidential29平衡盐溶液的选择平衡盐溶液的选择Hanks平衡盐溶液（HBS）要在空气中使用，不需要CO2培养箱。
原因是什么？
Hanks平衡盐溶液（HBS）和Earles平衡盐溶液（EBS）有什么本质的功能差别？
-HBS和EBS的主要差别在于碳酸氢钠碳酸氢钠的水平，碳酸氢钠的含量在Eagles（2.2g/L）中比在Hanks（0.35g/L）中高。
碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。
-Eagles液在空气水平的CO2中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。
如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液。
如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以。
InvitrogenProprietary&Confidential30酚红：
酚红：
PhenolRed酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：
中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。
什么时候选择不含酚红的培养基？
什么时候选择不含酚红的培养基？
酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素）酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素）由于酚红干扰检测，在做流式流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。
InvitrogenProprietary&Confidential31细胞培养试剂细胞培养试剂InvitrogenProprietary&Confidential32L-Glutamine在细胞培养液中在细胞培养液中L-谷氨酰胺是大部分细胞培养基的基本成分；脱掉氨谷氨酰胺是大部分细胞培养基的基本成分；脱掉氨基后，基后，L谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。
和核酸代谢。
L谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。
而具有毒性。
而L-谷氨酰胺是一种并不稳定的氨基酸，在中性的水溶液谷氨酰胺是一种并不稳定的氨基酸，在中性的水溶液中会自发降解；需要频繁地补加中会自发降解；需要频繁地补加L-谷氨酰胺。
谷氨酰胺。
（1）频繁打开盖子，增加了破坏无菌状态的可能性；）频繁打开盖子，增加了破坏无菌状态的可能性；
（2）过多的追加）过多的追加L-谷氨酰胺，增加了培养基中氨的毒性水平。
谷氨酰胺，增加了培养基中氨的毒性水平。
Supplement:
添加剂添加剂InvitrogenProprietary&Confidential33GlutaMax是由丙氨酸和是由丙氨酸和LL-谷氨酰胺缩合形成的二肽谷氨酰胺缩合形成的二肽与与L-Glutamine（L-谷氨酰胺）相比，含有谷氨酰胺）相比，含有Glutamax的培养基的培养基1.1.GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在二肽非常稳定，即使在121磅灭菌磅灭菌20分钟，分钟，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，LL谷谷氨酰胺几乎完全降解。
氨酰胺几乎完全降解。
2.2.由于由于稳定性稳定性增加，因此无需反复添加，使用更方便；增加，因此无需反复添加，使用更方便；3.3.可以防止可以防止L-谷氨酰胺降解而产生谷氨酰胺降解而产生有毒性氨有毒性氨的累积，因而有的累积，因而有利于细胞生长。
利于细胞生长。
替代品：
替代品：
GlutaMAXInvitrogenProprietary&Confidential34StabilityofGlutaMAX-Ivs.L-glutamineinDMEMD-MEMwassupplementedwithGlutaMAX-IorL-glutamine,aliquotedintovialsandstoredat37C.Samplesweretakendailyandfrozenat-20C.LevelsofGlutaMAX-IandL-glutamineweredeterminedbyHPLC.InvitrogenProprietary&Confidential35AmmoniaLevelsinSupplementedMediaD-MEMwassupplementedwithGlutaMAX-IorL-glutamine,aliquotedintovialsandstoredat37C.Samplesweretakendailyandfrozenat-20C.LevelsofammoniaweredeterminedbyHPLC.InvitrogenProprietary&Confidential36丙酮酸钠：
丙酮酸钠：
Pyruvate培养基中培养基中丙酮酸钠丙酮酸钠的作用是什么？
的作用是什么？
丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源。
但是，如果没
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